关键词:
分子检验诊断
动态DNA纳米技术
CRISPR
核酸杂交
基因突变
摘要:
精准的分子检验不仅对于肿瘤早期诊断、个体化治疗方式选择、预测治疗效果和患者预后等至关重要,而且有助于各种疾病的发生病理机制进行阐明,已经成为串联精准医学领域的关键一环,而分子检验技术正是从人类对DNA分子各项基本性质的探索中不断发展而来的。
近年来,随着DNA分子的编程性和动态性的深入研究,具有强大可控性、可编程性和可预测性的动态DNA纳米技术得到了飞速发展,在分子检验领域注入了新动力,推动了精准医学进步。此外,CRISPR技术的出现也极大地拓宽了人类对DNA分子识别和操纵的自由度,许多前所未见的快速检测策略如雨后春笋般不断涌现。
动态DNA纳米技术和CRISPR技术作为分子检测领域的前沿技术,涉及的核酸分子动力学和热力学原理互相交通和关联,具有各自的优势和短板,有极大的发展潜力。从特异性、灵敏度、可控性为代表的检测深度,到以新型标志物、可重复性、稳定性为代表的检测广度,本论文系统性地研究DNA动态纳米技术和CRISPR技术等前沿分子技术在分子精准检验中的机制及应用,构建了一系列高效的检测工具。具体内容如下:
1)针对复杂序列环境或低丰度条件中SNV鉴别错误率高的问题,本论文利用额外的二级结构Bulge-loop微调探针的热力学差异,放大了SNV鉴别的敏感性,并且与熵驱动放大策略、Sink竞争策略整合,从动力学角度消除野生型靶标的干扰,实现了多种SNV的低丰度鉴别。这项工作总结并吸取了DNA动态纳米技术中的经典动力学和热力学控制策略,克服了传统动力学鉴别时检测性能不均一的问题,以及传统热力学鉴别时,平衡吉布斯自由能变时受到的序列限制,为各种可定制的级联反应电路提供了新范式。
2)针对CRISPR技术对靶标的模糊识别机制和在精准检验方面存在的PAM基序限制等问题,本论文首先分析了CRISPR识别机制和靶标分子的长度、序列、双链或单链结构,PAM基序位置的密切联系,然后详细研究了TMSD反应与CRISPR识别的兼容性,设计了TOA的激活模式来克服PAM基序的位置限制。此外,基于TMSD反应提供的接口,我们还进一步将分支迁移反应与CRISPR/Cas12a结合,拓展了检测的通用性和特异性。为了增强实用性,我们还为其开发了两种靶标富集技术以获取适用于检测体系的BMP-like标志物。这项工作深化了CRISPR诊断的性能,拓宽了其可用的检测范围。
3)针对各项性能在多种医学生物领域深度应用中越发显得“捉襟见肘”的CRISPR技术,本论文构建了Toehold-cr RNA装置以精细化控制CRISPR/Cas12a的分子检测性能,不仅可以按照TMSD反应动力学控制的规则实现精细的Cas12a活性调控,还能根据热力学规则极大地提高检测的单碱基分辨率。这一设计在不同序列体系、不同靶标结构、甚至不同Cas亚型中都具有通用性,展示了DNA动态纳米技术与CRISPR技术强大的结合兼容性,并拓宽了其在分子诊断领域的深度应用。
4)针对具有重要医学和遗传系价值,但还没有成熟快速检测技术的困难分子标志物,本论文结合高度可编程和可预测的DNA动态纳米技术和数学逻辑推理,开发了一种多位点SNPs长距离分布分析方法。获取了跨越上千碱基,兼具稳定性及可读性的长链靶标;设计了能实现特异和高产率的短链Holliday-junction核酸探针;并构建了能推理分析多个突变位点在两条染色体上复杂组合的拓展模型。这项工作基于DNA动态纳米技术的高度可编程性能进行了成功的新方法尝试和突破。
5)针对DNA耗散在循环检测应用中受到的干扰问题,本论文在TMSD反应主导的耗散检测体系中引入了基于动力学隔间的竞争策略,成功将仅差别一个碱基的干扰分子从多次循环检测的累积中消除,维持了检测性能的一致性。即使面临同一家族的多种mi RNA干扰,也能准确检测出仅单个碱基差别的Let-7a靶标。耗散反应所具有的可重复使用的循环检测特性为生物安全、环境保护、大规模应用的成本限制等挑战提供了一种破局思路。这项工作大大增强了耗散检测的鲁棒性,并拓宽了该技术在复杂分子测定中的进一步应用。