关键词:
光学活体成像
鹿茸蛋白提取物
毛母质细胞
毛囊干细胞
生长期
雄激素性脱发
摘要:
研究背景和目的 雄激素性脱发(Androgenetic alopecia,AGA)是一种在男性和女性中都极为常见的脱发类型。研究表明,AGA影响了约85%的男性和40%的女性。AGA又称为脂溢性脱发,其特征包括毛发减少、毛囊变小、生长期缩短,导致毛发从直径大于0.03mm的粗黑色素终毛变为直径小于0.03mm的纤细无色素毳毛。AGA不仅影响外观,还会对患者的心理健康和生活质量造成负面影响。目前的治疗方法主要是涂抹米诺地尔(Minoxidil,Min)和口服非那雄胺(Finasteride),两者的成功率分别为35%和48%。外抹Min易引发狂脱期、增加油腻感、造成多毛症和接触性皮炎,口服非那雄胺易引起性功能障碍和神经精神副作用。其他常见的治疗方法是毛发移植手术和LDL激光照射,迄今这些方法尚不能完全治愈该病。综上,目前可用的AGA治疗方法并不令人满意,需要新的治疗策略。中医药具有多靶点的特点,这使其具有成为新药的潜力。鹿角是哺乳动物中唯一能在生理情况下周期性完全再生的器官,在干细胞领域的研究中具有独特价值。实验室前期从鹿茸中提取出一组鹿茸提取物(Pilose Antler Extracts,PAE),含有丰富的生长因子,有极强的促再生及修复作用和促生发作用。实验室前期使用PAE治疗小鼠伤口愈合时,在涂抹处看到了毛发更早生成的现象。这提示PAE可能具有促进毛发再生的作用,但其中的机制尚不清楚。“两步激活假说”提出,毛芽干细胞激活毛囊干细胞,毛囊干细胞的爆发式生长标志着生长期的进入,毛囊的周期性生长由毛囊干细胞和毛母质细胞驱动。研究表明,隆起区静止的毛囊干细胞在毛母质细胞表达音猬因子(Sonic hedgehog signaling,SHH)后开始增殖。毛母质细胞受到骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein,BMP)严格的时间-空间相关表达模式的调控。本研究目的为采用光学成像技术建立活体观测毛囊周期的方法学,并借此方法筛选合适的取材时间,进一步探讨PAE促进毛发再生的药效和作用机制。
研究方法 1建立活体观测毛囊周期的方法学1.1传统方法评估雄激素性脱发模型小鼠毛囊的变化局部应用睾酮构建AGA小鼠模型。使用相机拍照观察不同时间点小鼠毛发生长的变化,并观察皮肤颜色变化。通过对皮肤组织生长周期过程中矢状面皮肤进行HE染色评估皮肤厚度、毛囊长度和毛囊球部直径的变化,并进一步分析不同时间点毛干生长的变化以及不同生长周期的变化。采用液晶偏光影像系统观察生长周期过程中正常小鼠和AGA小鼠毛孔变化的特点。1.2光学成像技术无创检测小鼠毛发生长方法的建立及在雄激素性脱发模型小鼠中的应用采用双光子成像技术无创检测正常小鼠整个生长周期过程中不同时间点粗毛和细毛毛干直径的变化,新、老毛干的变化,以建立无创评估不同时间生长期、退化期和休止期生长周期的变化。利用二次谐波成像技术活体评估正常小鼠不同时间毛囊大小的变化。基于上述方法建立正常小鼠不同生长周期的特征性生理结构并建立方法学标准,并采用此方法确定AGA小鼠毛发再生的重要特征和判断生长周期的不同阶段。2鹿茸提取物促进雄激素性脱发小鼠毛发再生的机制研究2.1鹿茸提取物促雄激素性脱发小鼠毛发再生的药效评估小鼠随机分为正常组、AGA组、PAE组和Min组。使用拍照观察四组小鼠毛发生长和皮肤颜色变化。采用光学断层扫描技术活体观察PAE对AGA小鼠皮肤厚度的影响。使用皮肤镜评估不同时间PAE对AGA小鼠毛发再生和毛干直径的作用。进一步采用皮肤组织矢状面切片HE染色检测PAE对AGA小鼠皮肤厚度、毛囊长度和毛囊球部直径的影响,同时通过皮肤组织冠状面切片HE染色观察PAE对AGA小鼠毛囊数量和毛干直径的作用。2.2选择探究毛囊干细胞中SHH/GLI通路和毛母质细胞中BMP/SMAD通路的时间点=将小鼠背部皮肤划分为A部分和B部分。采用双光子和二次谐波活体检测确定小鼠背部A、B两部分皮肤毛囊处在相同的生长周期。通过HE染色明确四组小鼠A部分皮肤毛囊在不同时间段对应的生长周期。利用切片免疫荧光染色和流式细胞计数观测正常小鼠中毛囊干细胞与毛母质细胞的增殖变化,结合研究报道毛囊干细胞中的SHH/GLI1信号通路和毛母质细胞中的BMP/SMAD信号通路在不同生长阶段的变化趋势,分别选择合适的生长周期阶段。根据A部分皮肤HE染色毛囊变化确定毛发生长周期所处阶段,取相应阶段的B部分皮肤进行药效评估和机制探讨。2.3鹿茸提取物促进毛囊干细胞和毛母质细胞增殖的作用和机制研究应用免疫荧光检测毛囊干细胞和毛母质细胞的增殖。应用免疫荧光、Western blot以及qRT-PCR观测四组小鼠毛囊干细胞中SHH/GLI1通路中SHH、SMO、GLI1的蛋白和mRNA表达情况。应用免疫荧光、Western blot