关键词:
Wilson病
铜死亡相关基因
生物信息学
临床验证
肝豆扶木汤
摘要:
目的:通过生物信息学与临床验证方法对肝豆状核变性[又称Wilson病(WD)]铜死亡相关基因筛选验证,探讨铜死亡在WD发生发展中的作用,为WD诊疗提供新的思路与方向。方法:(1)目标基因筛选:通过GeneCards数据库获取WD患者和健康人群的差异基因,利用Gene Expression Omnibus(GEO)数据库和已发表文献中得到铜死亡相关基因,取交集得到WD-铜死亡靶点基因;通过基因本体(GO)功能与精度基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析得到WD-铜死亡靶点基因所特定的生物学过程、功能或代谢途径;利用分子对接和PyMOL可视化分析技术,分析验证肝豆扶木汤调节铜死亡的可能作用机制。(2)目标基因验证:随机收集安徽中医药大学第一附属医院脑病科收治的15例WD患者和健康管理中心体检的15例健康志愿者血清,采用蛋白免疫印迹法(Western blot)及实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分析筛选所得目标基因的表达水平。结果:(1)利用Gene Expression Omnibus(GEO)数据库中GSE107323数据集得到WD差异基因3607个,通过GeneCards数据库及已发表文献中共得到铜死亡相关基因68个,将WD差异基因和铜死亡基因取交集得到12个WD-铜死亡靶点基因,其中上调基因3个[泛素结合蛋白p62(SQSTM1)、巨噬细胞迁移抑制因子1(MIF1)、Tax1结合蛋白1(TAX1BP1)]、下调基因9个[铜蓝蛋白(CP)、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1(SERPINE1)、含铜胺氧化酶3(AOC3)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、溶质载体家族27成员5(SLC27A5)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、丙酮酸脱氢酶E1亚基β(PDHB)、丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)、ATP7B];GO功能与KEGG富集分析显示WD-铜死亡靶点基因主要参与单羧酸代谢、氧化还原酶活性、分子功能负调控等代谢过程,涉及HIF-1、Ferroptosis等信号通路;分子对接及可视化分析显示肝豆扶木汤与WD-铜死亡的靶点基因PDK1、SERPINE1、VEGFA、AOC3具有较好的结合能力。(2)共收集30份临床血液样本,其中15名WD患者、15名健康人,Western blot结果显示目标基因表达水平与筛选所得的基因表达情况一致;Real-time PCR结果显示,与健康对照组相比,WD患者SERPINE1、GPX4、SLC27A5、VEGFA mRNA表达水平较低,SQSTM1、MIF1 mRNA处于较高的表达水平(P?0.05)。结论:WD患者铜死亡靶点基因表达水平与筛选所得的基因表达情况基本一致,新安医学特色制剂肝豆扶木汤与WD-铜死亡靶点基因呈现出较好的结合能力;铜死亡机制可能在WD病理生理机制中发挥了关键作用,可以为WD的诊疗提供新的靶点。