关键词： 东方蝙蝠   昼夜节律   生物钟   高通量测序   夜行性动物  

摘要： 昼夜节律现象几乎存在于所有的生命体中,是生命体最基本的特征之一,它能够调控生物体内多种生理生化过程,使生物体适应外界环境变化。蝙蝠因独特的昼伏夜出生活习性,使其成为哺乳动物研究领域最为神秘的研究类群之一。本论文以野外自然状态下的东方蝙蝠(Vespertilio sinensis)为研究对象,主要利用转录组测序技术,辅以荧光定量PCR验证实验,并结合适应性进化分析方法等,对东方蝙蝠脑区表达基因开展系统研究。首先,我们在一天内布设了四个时间间隔相等的采样时间点,分别采集不同生理活动状态下的东方蝙蝠脑组织并对其进行转录组测序与分析,随后获得了四个具有不同表达水平的基因集。这四个采样时间点分别对应蝙蝠的四种生理状态,分别是休息(Rest)、睡眠(Sleep)、觉醒(Wake)和活动状态(Activity)。通过对四个时间点基因集进行两两差异表达基因分析比较,共获得了六组差异表达基因集,并对其分别进行了系列功能富集分析。其中,对于生理活动状态差别较大的两组基因集,即休息vs觉醒(Rest vs Wake)和睡眠vs活动(Sleep vs Activity)两个比较组的富集结果表明:与进食前相比,东方蝙蝠在进食后呈高表达水平的基因显著富集于与药物代谢(drug metabolism)相关通路;而与进食后相比,东方蝙蝠在进食前的觉醒状态高表达水平的基因显著富集于多种内分泌(internal secretion)生理通路;与活动状态相比,东方蝙蝠在睡眠状态时高表达水平基因显著富集于核糖体(ribosome)相关通路;而与睡眠状态相比,东方蝙蝠在活动状态时脑区内多种信号传导通路(signal transduction)和生物钟(circadian rhythm)相关通路被高表达水平基因富集。上述结果共同表明蝙蝠脑区基因在不同的生理状态或时间节点所主导的生理过程具有明显的差异。其次,我们对蝙蝠脑区中在四个时间点共同表达的所有差异基因进行表达趋势分析和节律性表达基因分析,筛选出了一个包含27个基因且具有显著表达趋势的聚类模块6和6个节律性表达基因。根据趋势分析结果显示,模块6所包含的27个基因在一天中具有显著性表达变化趋势:在蝙蝠休息状态时这些基因的表达水平居中,到睡眠状态时基因表达水平逐渐降至最低,而后在觉醒状态时这些基因表达水平逐渐升高,最后到活动状态时表达水平达上升至最高值。由此我们推测模块6所包含的基因表达变化趋势与蝙蝠昼伏夜出的生物学习性相吻合。随后,我们对模块6中的基因进行富集分析,结果表明这些基因显著富集于多种内分泌、信号通路及生物钟相关通路,揭示出蝙蝠昼伏夜出活动模式对参与相关生理活动基因的表达变化需求。此外,根据趋势分析和相应的富集分析结果,我们还发现了一个重要的生物钟基因,Per1基因参与多条与昼夜节律相关的条目和通路,可能是东方蝙蝠脑区重要的生物钟基因。最后,我们对东方蝙蝠脑区的Per1基因开展了细致的适应性进化分析,我们共构建了两个适应性进化分析数据集。其一为基于东方蝙蝠Per1基因转录组序列,比对获得的包含23个具有不同昼夜活动模式的哺乳动物在内的数据集,共765 bp;另一个为基于Per1基因编码区序列全长的数据集,共3927 bp,包含22个具有基因组信息的且表现为不同昼夜活动模式的哺乳动物。从建树结果来看,两个数据集所构建的系统发育树都有较高的支持度,且都与真实物种树基本一致,并展现出相似的拓扑结构,表明该基因在进化上较为保守。然而,通过对Per1基因进行深入多模型正选择分析,结果表明所有夜行性动物,即蝙蝠分支和啮齿目分支的ω值均显著大于日行性物种分支的ω值,表明Per1基因在夜行性物种受到较强的选择压力作用。综上所述,本论文以夜行性的东方蝙蝠为主要研究对象,利用转录组测序技术、荧光定量PCR实验和多种分子进化等分析方法对其脑区节律性表达基因开展系统研究,发现东方蝙蝠脑区不同时间节点处的基因表达和所主导生理过程具有差异性,并鉴定出Per1可能是重要的生物钟基因。我们的研究结果有助于揭示蝙蝠特殊的昼伏夜出生活习性的生理基础和进化机制,为其他非模式生物的生物节律相关研究提供新的数据参考和研究思路。

关键词： 缢蛏   心率   性激素   转录组   Bmal1   Period  

摘要： 缢蛏(Sinonovacula constricta)是我国四大养殖贝类之一,因肉多味鲜深受大众喜爱,是重要的经济贝类。近年来,缢蛏人工育苗技术已被突破,但是产卵机制尚不清楚。缢蛏与其它双壳贝类不同,即使在白天采用升温、阴干、流水刺激、降低盐度、遮光等催产手段均无效,产卵时间严格限定在夜间,推测缢蛏产卵可能受环境因子之外的内源生物钟的严格调控。为探讨生物钟对缢蛏夜间产卵的调控机制,本研究通过测量缢蛏摄食率、心率和性激素的昼夜变化,初步确定缢蛏的生活方式及性激素是否存在昼夜节律变化;基于成熟卵巢的转录组分析鉴定与产卵相关的节律基因和生物钟基因;克隆获得关键生物钟基因Bmal1和Period的c DNA全长序列,并利用q RT-PCR、Western blotting、免疫荧光技术、si RNA技术研究Bmal1和Period基因与缢蛏产卵的相关性。本研究通过关键生物钟基因与生理指标、性激素的关联分析,旨在初步探讨生物钟调控缢蛏夜间产卵的生理和分子机制,这将对其它贝类产卵分子机制研究和工厂化育苗育种实践具有重要应用价值和借鉴意义。1.利用无损伤性心跳红外监测仪实时跟踪测量缢蛏雌、雄个体72 h心率变化。结果发现缢蛏雌、雄的心率均是夜间20:00-04:00高于白天,存在昼夜规律变化,初步推测缢蛏是夜行性动物;利用血球计数板计数缢蛏昼夜摄食牟式角毛藻(Chaetoceros musculi)的颗粒数,结果显示缢蛏的摄食在72 h内均在夜间00:00-02:00和06:00-08:00时间段高于白天12:00-14:00和18:00-20:00,并存在夜高昼低的显著差异(P<0.05);利用ELISA技术检测了缢蛏繁殖期卵巢/精巢72 h内昼夜不同时间(00:00、06:00、12:00和18:00)性激素含量变化,结果表示卵巢雌二醇和精巢睾酮含量均是在00:00最高,18:00最低,呈现先降低再升高的昼夜变化规律(P<0.05)。本实验发现缢蛏的摄食、心率均存在昼夜节律变化规律,表示生物钟可能调控了缢蛏的多个生命活动,同时性激素的昼夜规律性变化进一步表明生物钟可能参与缢蛏的夜间产卵。2.利用高通量RNA-Seq测序技术对缢蛏繁殖盛期的卵巢组织进行昼(12:00和18:00)/夜(00:00和06:00)转录组测序分析,共筛选得到3379个DEGs。通过GO富集、KEGG显著富集分析,鉴定出与产卵相关的Gn RH信号通路、Wnt信号通路、TGF-β信号通路等;在转录组文库中筛查到了关键生物钟基因Bmal1、Period、Timeless等;利用q RT-PCR技术研究了卵巢生物钟基因(ROR、Timeless)和与产卵相关节律基因(EGR3、DHCR7、STS、cyp19、WNT、SRD5A)在缢蛏5个组织(卵巢、精巢、鳃、肝胰腺、水管)昼夜不同时间(00:00和12:00)的表达分析,结果显示在5种组织中,基因ROR、EGR3和STS表达量均在00:00高于12:00;Timeless、DHCR7、cyp19、WNT和SRD5A表达量均在12:00高于00:00(P<0.05);对关键生物钟基因Bmal1和Period进行连续72 h的昼夜时间表达,结果表示Bmal1和Period均具有稳定的昼夜节律表达。本实验发现了多个与缢蛏产卵相关的KEGG通路和卵巢生物钟基因、节律基因,表明生物钟存在于缢蛏的卵巢组织中,并可能参与调控缢蛏的夜间产卵活动。3.利用RACE克隆技术获得Bmal1、Period基因的c DNA全长序列,Bmal1基因的c DNA全长为1944 bp,编码647个氨基酸;Period基因的c DNA全长为3327 bp,编码1108个氨基酸。Bmal1基因在缢蛏5种组织(卵巢、精巢、鳃、肝胰腺、水管)中的表达量均是夜间00:00-06:00高,白天12:00-18:00低;而Period基因在鳃组织中的表达量与Bmal1基因表达一致,其余组织中的Period基因表达与Bmal1基因表达趋势截然相反,均是在白天12:00-18:00高,夜间的00:00-06:00低。蛋白水平上,Bmal1和Period蛋白含量变化均是比m RNA水平延迟6 h-12 h,且均是在成熟卵母细胞、精子细胞、肝胰腺中的肝细胞、鳃丝边缘和水管末端边缘的上皮细胞中荧光信号强。si RNA干扰结果表明Bmal1、Period基因均是在第5d干扰效率达到最高(P<0.01),其蛋白表达量变化与m RNA水平基本一致。生化水平上,本研究测定了Bmal1、Period基因在si RNA干扰后精巢的睾酮和卵巢的雌二醇含量变化,结果发现睾酮和雌二醇含量在干扰后1 d至9 d均显著下降(P<0.01)。综合表明,缢蛏Bmal1、Period基因存在于多个组织

关键词： 睡眠呼吸暂停低通气综合征   阻塞性   生物信息学   遗传风险评分   风险评估  

摘要： 目的:探讨睡眠与昼夜节律基因变异位点及其累积效应与阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)的相关性。方法:1.本研究连续收集2016年4月至12月在新疆维吾尔自治区人民医院高血压中心就诊并疑似OSAHS的患者,进行整夜多导睡眠监测(PSG),根据排除标准及OSAHS诊断标准,选取50例重度OSAHS患者和50例非OSAHS患者。2.通过公共数据库和现有文献收集与睡眠和昼夜节律相关基因,对所有研究对象进行全部外显子以及侧翼序列进行高通量二代测序,筛选出OSAHS的易感位点,进行单个位点与OSAHS及其临床表型的相关分析。3.探讨多个位点构成的遗传风险评分(GRS)对OSAHS风险及其与传统因素的交互作用对OSAHS的预测能力。结果:本研究共纳入44个候选基因,进行生物信息学分析表明44个候选基因参与了睡眠与昼夜节律相关生物学过程和信号通路,其次进行单因素Logistic回归分析得出12个基因对应的56个单核苷酸多态性(SNP)位点在不同遗传模式下两组间差异有统计学意义,并调整了年龄、性别和体质指数(BMI)等潜在的混杂因素后得到KSR2、NPAS2、OXTR、GHRL等四个基因与OSAHS仍有明显的相关性,同时发现KSR2及OXTR基因多个SNP位点与各睡眠阶段及睡眠效率等临床表型存在一定的关联。对上述4个基因的6个SNP位点(KSR2-rs2592290、rs1992750、rs66837180,NPAS2-rs2278727,OXTR-rs3806675,GHRL-rs10490816)进行GRS,结果显示:高GRS组人群比低GRS组人群有着更高的OSAHS风险(OR=2.901,95%CI:1.288-6.534,P=0.01),此外将GRS加入到OSAHS传统风险因素(年龄、性别及BMI)组成的回归模型后,其曲线下面积(AUC)值从0.877增加到0.902。结论:睡眠与昼夜节律基因(KSR2、NPAS2、OXTR、GHRL)可能是OSAHS的遗传易感基因;GRS与传统因素的联合作用,更能提高OSAHS的预测模型。

关键词： 脆性X综合征   睡眠障碍   昼夜节律   FMRP   Per1  

摘要： 脆性X综合征((Fragile X syndrome,FXS)是造成智力发育迟缓和孤独症谱系障碍最常见的单基因遗传病,男性发病率为1/4000～1/9000,女性发病率为1/8000～1/11000。FXS主要是由Fmr1基因的5’UTR区域CGG重复异常扩增引起的FMRP蛋白表达缺失所致。FMRP的缺失导致靶mRNA的表达失调,引起患儿神经系统发育异常,临床表现为智力发育迟缓、语言缺陷、孤独症样表型,同时患者多表现出夜间难以入睡、睡眠不安、早醒和白天过度嗜睡等睡眠节律紊乱的表型,然而其具体机制还不明确。FMRP昼夜节律调控相关的靶mRNA靶基因的鉴定和功能研究不仅可以促进FXS的诊治,而且将有助于揭示FXS睡眠节律紊乱的分子机制。目的对筛选出来的FMRP靶基因Per1进行分析,研究FMRP对Per1的影响,并探索FMRP调控昼夜节律的分子机制。方法利用RNA免疫沉淀、qPCR和蛋白质免疫印迹等方法分析FMRP和Per1 mRNA的结合以及翻译调控作用;利用Fmr1基因敲除小鼠研究FMRP对FXS昼夜节律表型的影响。结果(1)FMRP与Per1 mRNA结合。在U2OS细胞系进行的RNA免疫沉淀实验,结果显示FMRP和哺乳动物Per1 mRNA特异性结合,鉴定了Per1为FMRP的靶mRNA。(2)FMRP抑制Per1翻译。在U2OS细胞系和FXS小鼠中利用Western blotting检测PER1蛋白表达量,结果显示FMRP缺失引起Per1蛋白水平增加,且在小鼠中具有组织和时间差异性;过表达FMRP则Per1蛋白水平降低。(3)FMRP缺失小鼠的昼夜节律行为没有明显改变。当小鼠在在持续黑暗(DD)的环境中,Fmr1基因敲除小鼠相对于野生型小鼠,它们的自发昼夜节律活动的周期没有明显的改变;同时,光脉冲(Light-pulse)诱导小鼠自发昼夜节律运动相位迁移实验中,野生型小鼠与Fmr1基因敲除小鼠昼夜节律运动相位迁移时间并没有显著差异。结论我们鉴定了一个新的FMRP靶基因Per1,FMRP与Per1 mRNA特异性结合并抑制其表达,FXS小鼠中FMRP对Per1的调控在FXS小鼠的昼夜节律行为中作用仍需进一步研究。图11幅,表1个,参考文献81篇

关键词： 昼夜节律   黑素细胞   PER2   CRY1   神经内分泌   siRNA转染  

摘要： 目的:精准的时序调控对于机体健康至关重要。起源于神经嵴的人表皮黑素细胞除了具有经典的黑色素合成特性,还具备神经内分泌、光敏感等功能,是人体重要的功能细胞。然而目前尚不明确昼夜节律是否参与调节黑素细胞各种生理活动。本研究旨在探讨正常人表皮黑素细胞生理特征并进一步探究核心昼夜节律基因对其生理活动的调控作用。方法:首先利用从正常人皮肤组织中分离培养的表皮黑素细胞,通过形态学观察和多巴染色的方法对其进行鉴定。使用RT-qPCR法验证了黑素细胞内光敏视蛋白基因(OPN1-OPN5)和神经内分泌合成关键酶(PC1,PC2,AANAT,TPH1)等功能基因的表达。使用地塞米松同步处理建立体外节律振荡模型,检测时钟基因的节律表达;并分析了包括黑素合成、细胞增殖、DNA损伤修复、神经内分泌功能的关键基因在24小时内的表达规律。摸索确定最佳的siRNA干扰条件后,利用干扰核心时钟基因CRY1和PER2来构建时钟基因扰乱模型,进一步分析昼夜节律扰乱后受生物钟调控下游基因的表达差异性,从而探索昼夜节律机制对黑素细胞各种生理过程的调控关系。结果:1.正常人包皮组织所分离的黑素细胞表达光敏视蛋白家族基因(OPN1,OPN2,OPN3,OPN4,OPN5);表达褪黑素合成限速酶(AANAT,TPH)、POMC合成过程关键酶(PC1,PC2)以及表达雌激素受体ER和雄激素受体AR基因,为皮肤神经内分泌网络重要组成部分。2.利用100nM地塞米松孵育处理,成功构建了正常人表皮黑素细胞体外节律振荡模型,核心时钟基因(PER2,PER3,CRY1,CLOCK,BMAL1,REV ERBα)的表达均表现为24小时为周期的波动。在体外同步模型中验证了黑色素合成关键基因MITF,DNA损伤修复关键基因XPA,细胞增殖相关基因cMyc以及黑素细胞褪黑素合成关键酶AANAT和糖皮质激素合成关键酶PC1基因表达均为节律波动(P<0.05)。3.摸索确定了最适合黑素细胞的siRNA的干扰体系,并使用siRNA技术沉默时钟基因CRY1成功构建了体外节律扰乱模型,并在干扰时钟基因CRY1后48小时发现MITF,TYR,PC1基因上调,cMyc基因下降,表明生物钟基因CRY1与黑色素合成、糖皮质激素合成以及细胞增殖存在相关性。进行连续分点监测提示,干扰组MITF,cMyc基因表达失去节律性。结论:黑素细胞内具有以24小时为周期的内源性昼夜节律调节机制。昼夜节律对人表皮黑素细胞黑素合成、DNA损伤修复、神经内分泌合成活动具有一定调节作用。对黑素细胞时间生理学的深入研究将为理解黑色素相关疾病的发生以及开发新的治疗靶点提供新的思路。

关键词： 直立不耐受   血管迷走性晕厥   体位性心动过速综合征   昼夜节律   24-h动态血压监测   直立心率增加幅度   生物钟基因  

摘要： 目的:直立不耐受（Orthostatic intolerance,OI）是指因不能耐受直立姿势而出现的一系列症状和体征,平卧后可缓解。血管迷走性晕厥（Vasovagal syncope,VVS）和体位性心动过速综合征（Postural tachycardia syndrome,POTS）是儿童OI的两种常见类型。昼夜节律紊乱参与许多疾病的发生、发展,如高血压、心血管疾病、肥胖、糖尿病、肿瘤等。但目前关于儿童OI的昼夜节律紊乱了解甚少。本研究旨在探讨儿童VVS和POTS是否存在昼夜节律紊乱,研究其昼夜节律紊乱的具体形式,并初步研究可能的机制,为VVS和POTS的精准诊断和治疗提供依据。方法:本研究将通过24-h动态血压监测（24-hour ambulatory blood pressure monitoring,24-h ABPM）指标、直立试验的直立心率（Heart rate,HR）相关指标、生物钟基因表达水平等方面研究VVS患儿和POTS患儿的昼夜节律。（1）选择2015年1月至2019年12月在我院儿科确诊的80例VVS患儿和94例POTS患儿为研究对象,80例健康儿童为对照组。收集对照组、VVS组和POTS组基线时的24-h ABPM资料并进行分析,描绘心率血压乘积（Rate pressure product,RPP）的24 h变化趋势。其中有62例VVS患儿和61例POTS患儿完成3（2,4）个月短期随访,根据症状改善情况将其分为治疗有反应组和无反应组,分析24-h ABPM各指标对VVS和POTS预后的影响。（2）选择2019年7月至2021年3月在我院儿科住院的56例VVS患儿和52例POTS患儿为研究对象,39例健康儿童为对照组。所有受试者均完成3个不同时间段的直立试验（上午7:00-9:00,下午15:00-17:00,夜间20:00-22:00）。另收集在我院儿科住院的21例VVS患儿和20例POTS患儿为验证组。52例POTS患儿经美托洛尔治疗后均完成了3个月的短期随访和平均9（6,12）个月的长期随访。短期随访时根据症状改善情况将POTS患儿分为有反应组和无反应组。采用受试者工作特征曲线分析下午和夜间直立心率增加幅度（Orthostatic heart rate increment,ΔHR）对POTS诊断和治疗疗效的预测价值。（3）选择2020年7月至2021年5月在我院儿科住院的20例VVS患儿和19例POTS患儿为研究对象,15例健康儿童为对照组。分别采集7:00和17:00外周静脉血,分离血浆和外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。检测PBMCs中生物钟基因（BMAL1、CLOCK、PER1、PER2、CRY1、CRY2、REV-ERBα）m RNA表达、氧化应激指标[PBMCs的核因子E2相关因子2（Nuclear factor E2-related factor 2,NRF2）、血红色加氧酶1（Haeme oxygenase1,HO-1）m RNA表达水平和血浆超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活力]和血管内皮功能指标[血浆一氧化氮（Nitric oxide,NO）水平]。因POTS患者存在直立血浆去甲肾上腺素（Norepinephrine,NE）水平过度增加,用NE处理人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）模拟高肾上腺素状态,检测HUVECs生物钟基因m RNA表达水平。结果:（1）VVS组和POTS组血压昼夜节律异常,以非勺型血压为主,比例明显高于对照组（62.5%比66.0%比43.8%,P<0.001）。3组24 h RPP值的昼夜变化趋势均呈现相似模式,峰值在醒后2 h至3 h,但POTS组醒后1 h至醒后4 h的RPP值显著高于VVS组和对照组。醒后1 h RPP值≥95.3×10～2 bpm·mm Hg预测诊断POTS灵敏度和特异度分为61.7%、75.0%;醒后2 h RPP值≥107.2×10～2 bpm·mm Hg预测诊断POTS的灵敏度和特异度分为46.8%、85.5%。在VVS组和POTS组随访儿童中,无论是治疗有反应组还是无反应组,治疗前与治疗后的非勺型血压比例未见明显改变。（2）VVS组、POTS组直立ΔHR在上午显著高于下午和夜间,对照组的ΔHR在3个时间段间未见显著差异（除ΔHR 10 min）;POTS组3个时间段的ΔHR均显著高于VVS组和对照组。所有POTS患儿上午直立试验达到诊断标准[ΔHR≥40次/min（beats/min,bpm）],仅46.2%的POTS患儿下午ΔHR≥40 bpm,

关键词： 噪声性听力损失   单核苷酸多态性   昼夜节律基因   易感性  

摘要： 背景及目的:噪声是指一类不规则的信号,广泛存在于生活和生产环境中,影响着人们正常的学习、工作和休息。在过去几十年中,由于世界工业化进程不断加快且现代化企业的不断新生并崛起,人们有越来越多的机会接触职业性噪声。此外,由于生活环境的现代化和智能化,人们日常生活中也能接触到各种娱乐噪声和交通噪声,这些噪声暴露正导致许多健康问题。已有的研究表明,长期暴露于高强度噪声环境中对人体多个系统都存在着不可逆的损伤,如心血管系统,内分泌系统,神经系统和免疫系统等。此外噪声还会与其他职业有害因素存在交互作用影响人体正常的生理功能。值得关注的是,噪声对这些系统的损伤都是非特异性的,其对听觉系统的影响表现出特异性,常见的临床表现有听阈升高(暂时性听阈位移(Temporary threshold shift,TTS)和永久性听阈位移(Permanent threshold shift,PTS))、听觉和声音敏感度下降、语言接受和识别能力减弱,严重时可导致永久性且不可逆的听力损失和持续性耳鸣。有动物实验表明,小鼠耳蜗中存在着可被噪声影响的昼夜节律,从而影响小鼠听觉系统的功能。这些研究证明了昼夜节律同样参与调节听觉系统功能,且节律受噪声影响。本研究的目的是探讨昼夜节律基因的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)与中国汉族人群职业性噪声性听力损失(Noise-induced hearing loss,NIHL)易感性的关联,为研究职业性噪声性听力损失易感性基因提供线索以及为其预防提供科学依据。研究方法:本次研究采用病例-对照研究方法,以江苏省某大型化纤公司和某大型煤炭能源公司中参加职业健康体检的工人作为研究对象,共2069人。首先根据其接触的有害职业因素是否包括噪声筛选研究对象,再根据统一的纳入和排除标准进一步筛选研究对象,剔除不符合标准的以及体检资料严重缺失并无法补全的体检工人,本次研究中共纳入研究对象1509人。通过职业健康体检和现场卫生学测量获得研究对象一般资料和职业有害因素接触情况并采集研究对象的外周血。通过纯音气导听阈测试(Pure-tone audiometry,PTA)获取研究对象各频率的听力阈值。参考中国《职业性噪声聋诊断标准》(GBZ49-2014)和WHO 1997年关于听力损失程度分级标准,将纳入的全部研究对象分为病例组(双耳高频平均听阈≥25d B)和对照组(双耳高频平均听阈<25d B)。通过倾向性评分匹配(Propensity matching score,PMS)的方法,匹配混杂因素:年龄、性别和接触噪声年限,最终获得病例组432人,对照组837人。通过美国国家生物技术信息中心数据库(National Center for Biotechnology Information,NCBI)(http://***/SNP)及相关文献参照一定的筛选标准(汉族人群中最小等位基因频率(Minor allele frequency,MAF)、突变区域和是否符合哈迪-温伯格平衡检验等)筛选昼夜节律基因和神经营养因子的候选SNP位点,最终在6个基因中筛选出12个SNP位点(PER1:rs2253820,rs2585405;PER2:rs56386336,rs934945;CRY1:rs1056560,rs3809236;CRY2:rs2292910,rs6798;BDNF:rs11030099,rs7124442,rs6265;NT-3:rs1805149)。采用Taq Man-探针-PCR技术对筛选的SNP位点进行基因分型,比较筛选位点的各基因型在病例组和对照组之间的分布差异。采用多因素降维法(Multifactor dimensionality reduction analyses,MDR)分析筛选位点与环境因素和自身因素之间的交互作用对NIHL发病风险的影响。使用染料法q RT-PCR定量试剂盒测量筛选基因m RNA的表达量并计算相对表达量。使用Graphpad Prism 9.0软件绘制筛选基因相对表达量的箱点图。通过SAS9.4进行敏感性分析,验证是否存在单个影响较大的混杂因素对研究结果造成偏倚。结果:根据统一的纳入和排除标准和倾向性匹配评分,共获得病例组432人,对照组837人。统计学分析结果显示,性别、年龄、抽烟和饮酒情况、噪声暴露水平和接触噪声年限这些因素在病例组和对照组之间的分布没有统计学差异。且病例组听阈位移(31.59±9.62 d B)大约是对照组(14.54±4.65 d B)的2.03倍,差异具有统计学意义(P<0.001)。哈迪-温伯格遗传平衡检验结果表明,所有位点的各基因型分布均符合哈迪温伯格遗传定律(P>0.05)。在共显性模型和显性模型中

关键词： 花生   昼夜节律   铝诱导细胞程序性死亡   生物信息学   生理生化特性  

摘要： 花生是一年生重要的油料作物,其适宜的pH值为中性。花生大多种植在中国南方的酸性土壤上,受铝(Al)毒性严重影响。昼夜节律是植物适应外部环境的内在分子机制,涉及对植物生长、代谢、开花、激素信号传导、生物和非生物胁迫反应等各种生理过程的调节。昼夜节律在植物对铝应激响应中的作用及其分子机制尚不清楚。为此,我们研究了花生昼夜节律基因及其在铝诱导的程序性细胞死亡(PCD)调节中的作用。 1.花生昼夜节律基因的生物信息学分析。从拟南芥数据库中下载到72个昼夜节律基因,通过开放阅读框(ORF)分析和保守域搜索,在花生中发现了71个昼夜节律基因。这些基因分布在花生的20条染色体上,其中19号染色体最长,具有基因最多(8个),而8号染色体最短,10号、11号、13号和15号染色体基因数量最少,均为1个基因。71个蛋白质中有12种具有跨膜结构域。Ahy000382的分子量最高(87997.77),Ahy16709的分子量最低(11146.99)。Ahy001085的等电点最小(3.58),而Ahy00249的最高(10.51)。进化树分析将拟南芥和花生昼夜节律基因分为17簇。与99-1507(耐铝型)相比,中花2号(ZH2,铝敏感型)的昼夜节律基因表达量变化较大,最高在ZH2铝处理后8小时,最低为ZH2处理后24小时。71个基因中,有33个被注释,其中最多为组织系统12个,占36.36%,其次是遗传信息处理和代谢,均为4个,占12.12%。 2.光周期和铝胁迫对花生根尖细胞程序性死亡的影响。在三种光周期条件下(8/16,SD;12/12,ND;16/8 h,LD),用100μM AlCl3处理了两个花生品种99-1507和ZH2一天。根长和根尖细胞死亡受到光周期、铝胁迫单独处理影响,二者共同处理影响更大。铝胁迫引起根长生长抑制和细胞死亡产生在LD下高于ND,SD下最低。根尖和根尖细胞壁铝含量为LD>ND>SD,ZH2大于99-1507。长日照和铝胁迫增加根尖MDA含量,PME和LOX活性,ROS含量。长日照降低APX、SOD、CAT和POD活性,而铝胁迫增加这些酶活性。 3.花生昼夜节律基因AhLHY和AhSTS的克隆和表达分析。AhLHY编码736aa,分子量为79.87 kDa,等电点为5.185。有三种与Myb相关的基序,包括Myb＿DNA结合(PF00249)、Myb样DNA结合结构域Myb＿DNA-bind＿7(PF15963)、Myb＿DNA bind＿6(PF13921)。 AhSTS编码389aa,分子量为42.69 kDa,等电点为6.05。AhSTS存在六个基序,即Chal＿sti＿synt＿N 7(PF00195)、Chal＿sti＿synt＿C(PF02797)、ACP＿syn＿III＿C(PF08541)、3-氧酰基-[酰基载体蛋白(ACP)]合酶III C末端FAE1＿CUT1＿Rpp A(PF08392)、FAE1/III型聚酮合酶样蛋白ACP＿syn＿III(PF08545)和3-氧酰基-[酰基载体蛋白(ACP)]合酶III DUF6568(PF20207)。 在三个不同的光周期处理或光周期加铝处理下,AhLHY表达上调,呈现ND>SD>LD以及品种99-1507>ZH2。在无铝或铝胁迫下,AhSTS表达均为SD>LD>ND以及品种99-1507>ZH2。 综上所述,在花生中存在大量昼夜节律基因,它们能够调控铝胁迫下的铝吸收,调节根尖活性氧含量和清除酶活性而参与铝诱导PCD,其中长日照促进铝吸收,降低活性氧清除酶活性,提高膜脂过氧化水平,加快铝诱导PCD,AhLHY和AhSTS基因可能在其中发挥重要作用。

关键词： 肿瘤干细胞   昼夜节律   PER3   Wnt通路   化疗耐药   去势抵抗  

摘要： 研究背景和目的:恶性肿瘤已成为人类的第二大死亡原因,晚期恶性肿瘤患者常常出现化疗耐药和复发而导致治疗失败。本研究以临床上常发生治疗抵抗的两种恶性肿瘤(口腔鳞状细胞癌[oral squamous cell carcinoma,OSCC]和前列腺癌[prostate cancer,PCa])为研究对象,旨在从OSCC和PCa耐药机制的共性和差异中探索恶性肿瘤治疗抵抗的根源。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是肿瘤组织中一小部分具有干细胞特征的细胞亚群,研究表明CSCs与肿瘤复发、转移和耐药关系密切。昼夜节律紊乱被证实与多种疾病(例如心血管疾病、代谢紊乱疾病和肿瘤)密切相关。同时,昼夜节律相关基因(包括PER3)被报道可以参与恶性肿瘤的发生、发展之中,依据机体昼夜节律而设计的肿瘤时辰治疗具有重要的治疗价值。然而,关于CSCs的昼夜节律特性以及昼夜节律基因PER3在CSCs中的调控机制还不明确。因此,本研究旨在探究CSCs的昼夜节律特性并初步阐明PER3调控CSCs自我更新的分子机制,为恶性肿瘤时辰治疗方案提供一定的补充。 方法:采用流式细胞仪(Fluorescence activated cell sorting,FACS)分选出CD44和ALDH1双阳性表达(double positive,DP)的细胞亚群以及双阴性表达(double negative,DN)的细胞亚群,并通过克隆形成、连续成球、有限稀释成瘤等实验对DP和DN细胞进行CSCs特性的验证。采用转录组测序分析DP和DN细胞在化疗耐药、去势抵抗以及昼夜节律等通路的富集情况,并在化疗以及去势治疗条件下使用克隆形成、连续成球、有限稀释成瘤等实验进行验证。采用慢病毒沉默和过表达PER3后,检测DP和DN细胞的CSCs特性变化,并通过转录组测序、RT-q PCR、western blot、免疫共沉淀、免疫荧光、动物造模等实验探究PER3对CSCs干性调控的分子机制。此外,通过TCGA数据库、免疫组化实验分析PER3在OSCC和PCa中的表达以及与预后的关系。 结果:1.与DN细胞相比,DP细胞在体外和体内具有更显著的CSCs特征,同时对紫杉醇化疗和去势治疗更加抵抗,并且显著下调昼夜节律信号通路和昼夜节律基因PER3;2.昼夜节律基因PER3可通过Wnt/β-catenin信号通路参与CSCs的干性调控;3.与正常组织相比,PER3在OSCC和PCa肿瘤组织中表达降低,并且PER3的表达与OSCC和PCa患者的临床预后负相关。 结论:1.通过FACS分选DP和DN细胞的方法可以稳定富集CSCs;2.与DN细胞相比,DP细胞对化疗和去势治疗更加抵抗;***细胞的昼夜节律通路以及相关基因显著下调,其中PER3是下调最显著的基因;***3可通过Wnt/β-catenin信号通路负反馈调控CSCs的自我更新;***3可作为OSCC和PCa患者的预后评价指标。

关键词： 肉鸡   胆汁酸   糖皮质激素   昼夜节律  

摘要： 胆汁酸主要由肝脏中的胆固醇合成,是一类两性小分子,不仅在机体营养吸收中起重要作用,还是关键的信号分子参与调节葡萄糖、脂类、能量、药物和胆汁酸自身的代谢。动物胆汁酸的稳态依赖于肠肝循环的正常运行,对机体的健康有重要意义。现代生活中,昼夜颠倒、失眠和不规律的饮食等都可以导致胆汁酸昼夜节律的紊乱,诱发胆汁淤积等肝胆疾病以及肥胖等代谢综合征。 在规模化养殖过程中,肉鸡长期暴露于多种应激源,比如:高温高湿、高养殖密度、持续光照和频繁的免疫接种。这导致家禽血液中持续高水平的皮质酮,也造成了肉鸡生物节律的紊乱,从而使饲料转化效率下降,糖脂代谢紊乱以及免疫力下降,造成了巨大的经济损失。目前关于应激如何扰乱机体胆汁酸池的研究主要集中在人类以及啮齿类动物中,家禽上鲜有报道。因此,本研究拟通过连续皮质酮注射建立肉鸡慢性应激模型,探究慢性应激扰乱家禽胆汁酸池昼夜节律的可能调节机制。 1慢性皮质酮暴露对肉鸡肝脏生物钟和胆汁酸稳态的影响 本试验选用健康、体重相近的63日龄中速型矮脚黄羽公鸡,共72只,随机分为对照组(Control,Con)和皮质酮组(Corticosterone,Cort)各36只,Cort组接受2 mg每千克体重的皮质酮皮下注射(每天两次,9:00-10:00和18:00-19:00),Con组则注射同体积的溶剂,共计11天。试验期间采用12小时光照12小时黑暗的光照制度,肉鸡自由采食和饮水,每天记录采食量,每两天记录体重变化。样品采集从9:00 am(ZT 2)开始,间隔4 h采集一次,每次随机选择6只Con组和6只Cort组肉鸡,最后一个时间点是次日5:00 am(ZT 22)。采集了血浆,肝脏,小肠内容物等样品,检测了其中的胆汁酸浓度,检测了肝脏中胆汁酸相关基因和钟基因的表达。结果显示,Cort组肝脏中胆汁酸浓度和Con组呈现相反的波动形式,整体含量显著(P<0.05)减少。夜间(ZT 10以后)Cort组胆汁以及小肠中胆汁酸含量异常升高并在凌晨(ZT 22)达到峰值。不同于Con组有节律的血浆胆汁酸浓度起伏,Cort组的浓度在早上(ZT 2)显著(P<0.05)高于Con组,之后逐渐降低并在黎明前(ZT 22)显著(P<0.05)低于Con组。慢性皮质酮暴露下,鸡肝脏生物钟基因BMAL1、NPAS2的m RNA表达曲线出现振幅下降以及峰值延迟,Cry1、Per2、Per3的振幅明显减小并出现位移。Cort组肝脏中CYP7A1、CYP27A1、FXR、MRP2基因m RNA表达峰值出现时间发生变化,CYP8B1的振幅明显增加,NTCP的表达量显著(P<0.05)提高并且保持原有节律。以上结果表明:慢性皮质酮暴露导致肉鸡胆汁酸池的整体稳态被扰乱,肝脏钟基因以及胆汁酸代谢相关基因发生明显节律改变。 2慢性皮质酮暴露对肉鸡肠肝循环胆汁酸谱和肠道微生物群落的影响 由于慢性皮质酮暴露能够显著影响肉鸡胆汁酸池的大小以及胆汁酸的分布节律,我们选取胆汁酸池变化以及肝脏转录水平变化最有代表性的ZT 2时刻的样品作为研究对象,运用靶向胆汁酸代谢组学技术以及16s r RNA基因测序进一步探究慢性皮质酮暴露对肉鸡肝脏、小肠和血清胆汁酸谱以及小肠微生物群落的影响。结果显示,慢性皮质酮暴露显著(P<0.05)降低了肝脏中CDCA的含量,显著(P<0.05)提高了小肠中次级胆汁酸和初级胆汁酸的比值以及非结合型胆汁酸和结合型胆汁酸的比值,显著(P<0.05)提高了肠道CA以及血浆TCA、TLCA的含量,没有对小肠微生物组成造成影响。上述结果表明:慢性皮质酮暴露显著影响肝脏、小肠内容物和血浆胆汁酸谱,提示慢性皮质酮暴露增加了胆汁酸从肝细胞向胆管的转运。 3糖皮质激素对AML12肝细胞MRP2基因转运胆汁酸的影响 由于慢性皮质酮暴露造成了肉鸡胆汁酸池紊乱且影响了肝细胞胆汁酸外排能力,因此本章使用AML12细胞进行体外试验,通过在细胞培养基中添加500n M地塞米松(dexamethasone,DEX)模拟肝细胞应激状态来对上述问题进行体外验证。结果显示,DEX显著(P<0.05)提升了AML12细胞转运TCA的能力,显著(P<0.05)降低了MRP2的m RNA表达水平,显著(P<0.05)上调了BSEP的m RNA表达水平,显著(P<0.05)上调了MRP2的膜蛋白表达,对BSEP的总蛋白水平没有显著影响,时钟基因PER3的蛋白表达水平也显著(P<0.05)升高。这些结果表明:糖皮质激素通过增强AML12细胞MRP2基因的蛋白表达,从而增强了肝细胞内胆汁酸向顶膜外胆管转运。