关键词： 直立不耐受   血管迷走性晕厥   体位性心动过速综合征   昼夜节律   24-h动态血压监测   直立心率增加幅度   生物钟基因  

摘要： 目的:直立不耐受（Orthostatic intolerance,OI）是指因不能耐受直立姿势而出现的一系列症状和体征,平卧后可缓解。血管迷走性晕厥（Vasovagal syncope,VVS）和体位性心动过速综合征（Postural tachycardia syndrome,POTS）是儿童OI的两种常见类型。昼夜节律紊乱参与许多疾病的发生、发展,如高血压、心血管疾病、肥胖、糖尿病、肿瘤等。但目前关于儿童OI的昼夜节律紊乱了解甚少。本研究旨在探讨儿童VVS和POTS是否存在昼夜节律紊乱,研究其昼夜节律紊乱的具体形式,并初步研究可能的机制,为VVS和POTS的精准诊断和治疗提供依据。方法:本研究将通过24-h动态血压监测（24-hour ambulatory blood pressure monitoring,24-h ABPM）指标、直立试验的直立心率（Heart rate,HR）相关指标、生物钟基因表达水平等方面研究VVS患儿和POTS患儿的昼夜节律。（1）选择2015年1月至2019年12月在我院儿科确诊的80例VVS患儿和94例POTS患儿为研究对象,80例健康儿童为对照组。收集对照组、VVS组和POTS组基线时的24-h ABPM资料并进行分析,描绘心率血压乘积（Rate pressure product,RPP）的24 h变化趋势。其中有62例VVS患儿和61例POTS患儿完成3（2,4）个月短期随访,根据症状改善情况将其分为治疗有反应组和无反应组,分析24-h ABPM各指标对VVS和POTS预后的影响。（2）选择2019年7月至2021年3月在我院儿科住院的56例VVS患儿和52例POTS患儿为研究对象,39例健康儿童为对照组。所有受试者均完成3个不同时间段的直立试验（上午7:00-9:00,下午15:00-17:00,夜间20:00-22:00）。另收集在我院儿科住院的21例VVS患儿和20例POTS患儿为验证组。52例POTS患儿经美托洛尔治疗后均完成了3个月的短期随访和平均9（6,12）个月的长期随访。短期随访时根据症状改善情况将POTS患儿分为有反应组和无反应组。采用受试者工作特征曲线分析下午和夜间直立心率增加幅度（Orthostatic heart rate increment,ΔHR）对POTS诊断和治疗疗效的预测价值。（3）选择2020年7月至2021年5月在我院儿科住院的20例VVS患儿和19例POTS患儿为研究对象,15例健康儿童为对照组。分别采集7:00和17:00外周静脉血,分离血浆和外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。检测PBMCs中生物钟基因（BMAL1、CLOCK、PER1、PER2、CRY1、CRY2、REV-ERBα）m RNA表达、氧化应激指标[PBMCs的核因子E2相关因子2（Nuclear factor E2-related factor 2,NRF2）、血红色加氧酶1（Haeme oxygenase1,HO-1）m RNA表达水平和血浆超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活力]和血管内皮功能指标[血浆一氧化氮（Nitric oxide,NO）水平]。因POTS患者存在直立血浆去甲肾上腺素（Norepinephrine,NE）水平过度增加,用NE处理人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）模拟高肾上腺素状态,检测HUVECs生物钟基因m RNA表达水平。结果:（1）VVS组和POTS组血压昼夜节律异常,以非勺型血压为主,比例明显高于对照组（62.5%比66.0%比43.8%,P<0.001）。3组24 h RPP值的昼夜变化趋势均呈现相似模式,峰值在醒后2 h至3 h,但POTS组醒后1 h至醒后4 h的RPP值显著高于VVS组和对照组。醒后1 h RPP值≥95.3×10～2 bpm·mm Hg预测诊断POTS灵敏度和特异度分为61.7%、75.0%;醒后2 h RPP值≥107.2×10～2 bpm·mm Hg预测诊断POTS的灵敏度和特异度分为46.8%、85.5%。在VVS组和POTS组随访儿童中,无论是治疗有反应组还是无反应组,治疗前与治疗后的非勺型血压比例未见明显改变。（2）VVS组、POTS组直立ΔHR在上午显著高于下午和夜间,对照组的ΔHR在3个时间段间未见显著差异（除ΔHR 10 min）;POTS组3个时间段的ΔHR均显著高于VVS组和对照组。所有POTS患儿上午直立试验达到诊断标准[ΔHR≥40次/min（beats/min,bpm）],仅46.2%的POTS患儿下午ΔHR≥40 bpm,

关键词： 花生   昼夜节律   铝诱导细胞程序性死亡   生物信息学   生理生化特性  

摘要： 花生是一年生重要的油料作物,其适宜的pH值为中性。花生大多种植在中国南方的酸性土壤上,受铝(Al)毒性严重影响。昼夜节律是植物适应外部环境的内在分子机制,涉及对植物生长、代谢、开花、激素信号传导、生物和非生物胁迫反应等各种生理过程的调节。昼夜节律在植物对铝应激响应中的作用及其分子机制尚不清楚。为此,我们研究了花生昼夜节律基因及其在铝诱导的程序性细胞死亡(PCD)调节中的作用。 1.花生昼夜节律基因的生物信息学分析。从拟南芥数据库中下载到72个昼夜节律基因,通过开放阅读框(ORF)分析和保守域搜索,在花生中发现了71个昼夜节律基因。这些基因分布在花生的20条染色体上,其中19号染色体最长,具有基因最多(8个),而8号染色体最短,10号、11号、13号和15号染色体基因数量最少,均为1个基因。71个蛋白质中有12种具有跨膜结构域。Ahy000382的分子量最高(87997.77),Ahy16709的分子量最低(11146.99)。Ahy001085的等电点最小(3.58),而Ahy00249的最高(10.51)。进化树分析将拟南芥和花生昼夜节律基因分为17簇。与99-1507(耐铝型)相比,中花2号(ZH2,铝敏感型)的昼夜节律基因表达量变化较大,最高在ZH2铝处理后8小时,最低为ZH2处理后24小时。71个基因中,有33个被注释,其中最多为组织系统12个,占36.36%,其次是遗传信息处理和代谢,均为4个,占12.12%。 2.光周期和铝胁迫对花生根尖细胞程序性死亡的影响。在三种光周期条件下(8/16,SD;12/12,ND;16/8 h,LD),用100μM AlCl3处理了两个花生品种99-1507和ZH2一天。根长和根尖细胞死亡受到光周期、铝胁迫单独处理影响,二者共同处理影响更大。铝胁迫引起根长生长抑制和细胞死亡产生在LD下高于ND,SD下最低。根尖和根尖细胞壁铝含量为LD>ND>SD,ZH2大于99-1507。长日照和铝胁迫增加根尖MDA含量,PME和LOX活性,ROS含量。长日照降低APX、SOD、CAT和POD活性,而铝胁迫增加这些酶活性。 3.花生昼夜节律基因AhLHY和AhSTS的克隆和表达分析。AhLHY编码736aa,分子量为79.87 kDa,等电点为5.185。有三种与Myb相关的基序,包括Myb＿DNA结合(PF00249)、Myb样DNA结合结构域Myb＿DNA-bind＿7(PF15963)、Myb＿DNA bind＿6(PF13921)。 AhSTS编码389aa,分子量为42.69 kDa,等电点为6.05。AhSTS存在六个基序,即Chal＿sti＿synt＿N 7(PF00195)、Chal＿sti＿synt＿C(PF02797)、ACP＿syn＿III＿C(PF08541)、3-氧酰基-[酰基载体蛋白(ACP)]合酶III C末端FAE1＿CUT1＿Rpp A(PF08392)、FAE1/III型聚酮合酶样蛋白ACP＿syn＿III(PF08545)和3-氧酰基-[酰基载体蛋白(ACP)]合酶III DUF6568(PF20207)。 在三个不同的光周期处理或光周期加铝处理下,AhLHY表达上调,呈现ND>SD>LD以及品种99-1507>ZH2。在无铝或铝胁迫下,AhSTS表达均为SD>LD>ND以及品种99-1507>ZH2。 综上所述,在花生中存在大量昼夜节律基因,它们能够调控铝胁迫下的铝吸收,调节根尖活性氧含量和清除酶活性而参与铝诱导PCD,其中长日照促进铝吸收,降低活性氧清除酶活性,提高膜脂过氧化水平,加快铝诱导PCD,AhLHY和AhSTS基因可能在其中发挥重要作用。

关键词： 肿瘤干细胞   昼夜节律   PER3   Wnt通路   化疗耐药   去势抵抗  

摘要： 研究背景和目的:恶性肿瘤已成为人类的第二大死亡原因,晚期恶性肿瘤患者常常出现化疗耐药和复发而导致治疗失败。本研究以临床上常发生治疗抵抗的两种恶性肿瘤(口腔鳞状细胞癌[oral squamous cell carcinoma,OSCC]和前列腺癌[prostate cancer,PCa])为研究对象,旨在从OSCC和PCa耐药机制的共性和差异中探索恶性肿瘤治疗抵抗的根源。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是肿瘤组织中一小部分具有干细胞特征的细胞亚群,研究表明CSCs与肿瘤复发、转移和耐药关系密切。昼夜节律紊乱被证实与多种疾病(例如心血管疾病、代谢紊乱疾病和肿瘤)密切相关。同时,昼夜节律相关基因(包括PER3)被报道可以参与恶性肿瘤的发生、发展之中,依据机体昼夜节律而设计的肿瘤时辰治疗具有重要的治疗价值。然而,关于CSCs的昼夜节律特性以及昼夜节律基因PER3在CSCs中的调控机制还不明确。因此,本研究旨在探究CSCs的昼夜节律特性并初步阐明PER3调控CSCs自我更新的分子机制,为恶性肿瘤时辰治疗方案提供一定的补充。 方法:采用流式细胞仪(Fluorescence activated cell sorting,FACS)分选出CD44和ALDH1双阳性表达(double positive,DP)的细胞亚群以及双阴性表达(double negative,DN)的细胞亚群,并通过克隆形成、连续成球、有限稀释成瘤等实验对DP和DN细胞进行CSCs特性的验证。采用转录组测序分析DP和DN细胞在化疗耐药、去势抵抗以及昼夜节律等通路的富集情况,并在化疗以及去势治疗条件下使用克隆形成、连续成球、有限稀释成瘤等实验进行验证。采用慢病毒沉默和过表达PER3后,检测DP和DN细胞的CSCs特性变化,并通过转录组测序、RT-q PCR、western blot、免疫共沉淀、免疫荧光、动物造模等实验探究PER3对CSCs干性调控的分子机制。此外,通过TCGA数据库、免疫组化实验分析PER3在OSCC和PCa中的表达以及与预后的关系。 结果:1.与DN细胞相比,DP细胞在体外和体内具有更显著的CSCs特征,同时对紫杉醇化疗和去势治疗更加抵抗,并且显著下调昼夜节律信号通路和昼夜节律基因PER3;2.昼夜节律基因PER3可通过Wnt/β-catenin信号通路参与CSCs的干性调控;3.与正常组织相比,PER3在OSCC和PCa肿瘤组织中表达降低,并且PER3的表达与OSCC和PCa患者的临床预后负相关。 结论:1.通过FACS分选DP和DN细胞的方法可以稳定富集CSCs;2.与DN细胞相比,DP细胞对化疗和去势治疗更加抵抗;***细胞的昼夜节律通路以及相关基因显著下调,其中PER3是下调最显著的基因;***3可通过Wnt/β-catenin信号通路负反馈调控CSCs的自我更新;***3可作为OSCC和PCa患者的预后评价指标。

关键词： 肉鸡   胆汁酸   糖皮质激素   昼夜节律  

摘要： 胆汁酸主要由肝脏中的胆固醇合成,是一类两性小分子,不仅在机体营养吸收中起重要作用,还是关键的信号分子参与调节葡萄糖、脂类、能量、药物和胆汁酸自身的代谢。动物胆汁酸的稳态依赖于肠肝循环的正常运行,对机体的健康有重要意义。现代生活中,昼夜颠倒、失眠和不规律的饮食等都可以导致胆汁酸昼夜节律的紊乱,诱发胆汁淤积等肝胆疾病以及肥胖等代谢综合征。 在规模化养殖过程中,肉鸡长期暴露于多种应激源,比如:高温高湿、高养殖密度、持续光照和频繁的免疫接种。这导致家禽血液中持续高水平的皮质酮,也造成了肉鸡生物节律的紊乱,从而使饲料转化效率下降,糖脂代谢紊乱以及免疫力下降,造成了巨大的经济损失。目前关于应激如何扰乱机体胆汁酸池的研究主要集中在人类以及啮齿类动物中,家禽上鲜有报道。因此,本研究拟通过连续皮质酮注射建立肉鸡慢性应激模型,探究慢性应激扰乱家禽胆汁酸池昼夜节律的可能调节机制。 1慢性皮质酮暴露对肉鸡肝脏生物钟和胆汁酸稳态的影响 本试验选用健康、体重相近的63日龄中速型矮脚黄羽公鸡,共72只,随机分为对照组(Control,Con)和皮质酮组(Corticosterone,Cort)各36只,Cort组接受2 mg每千克体重的皮质酮皮下注射(每天两次,9:00-10:00和18:00-19:00),Con组则注射同体积的溶剂,共计11天。试验期间采用12小时光照12小时黑暗的光照制度,肉鸡自由采食和饮水,每天记录采食量,每两天记录体重变化。样品采集从9:00 am(ZT 2)开始,间隔4 h采集一次,每次随机选择6只Con组和6只Cort组肉鸡,最后一个时间点是次日5:00 am(ZT 22)。采集了血浆,肝脏,小肠内容物等样品,检测了其中的胆汁酸浓度,检测了肝脏中胆汁酸相关基因和钟基因的表达。结果显示,Cort组肝脏中胆汁酸浓度和Con组呈现相反的波动形式,整体含量显著(P<0.05)减少。夜间(ZT 10以后)Cort组胆汁以及小肠中胆汁酸含量异常升高并在凌晨(ZT 22)达到峰值。不同于Con组有节律的血浆胆汁酸浓度起伏,Cort组的浓度在早上(ZT 2)显著(P<0.05)高于Con组,之后逐渐降低并在黎明前(ZT 22)显著(P<0.05)低于Con组。慢性皮质酮暴露下,鸡肝脏生物钟基因BMAL1、NPAS2的m RNA表达曲线出现振幅下降以及峰值延迟,Cry1、Per2、Per3的振幅明显减小并出现位移。Cort组肝脏中CYP7A1、CYP27A1、FXR、MRP2基因m RNA表达峰值出现时间发生变化,CYP8B1的振幅明显增加,NTCP的表达量显著(P<0.05)提高并且保持原有节律。以上结果表明:慢性皮质酮暴露导致肉鸡胆汁酸池的整体稳态被扰乱,肝脏钟基因以及胆汁酸代谢相关基因发生明显节律改变。 2慢性皮质酮暴露对肉鸡肠肝循环胆汁酸谱和肠道微生物群落的影响 由于慢性皮质酮暴露能够显著影响肉鸡胆汁酸池的大小以及胆汁酸的分布节律,我们选取胆汁酸池变化以及肝脏转录水平变化最有代表性的ZT 2时刻的样品作为研究对象,运用靶向胆汁酸代谢组学技术以及16s r RNA基因测序进一步探究慢性皮质酮暴露对肉鸡肝脏、小肠和血清胆汁酸谱以及小肠微生物群落的影响。结果显示,慢性皮质酮暴露显著(P<0.05)降低了肝脏中CDCA的含量,显著(P<0.05)提高了小肠中次级胆汁酸和初级胆汁酸的比值以及非结合型胆汁酸和结合型胆汁酸的比值,显著(P<0.05)提高了肠道CA以及血浆TCA、TLCA的含量,没有对小肠微生物组成造成影响。上述结果表明:慢性皮质酮暴露显著影响肝脏、小肠内容物和血浆胆汁酸谱,提示慢性皮质酮暴露增加了胆汁酸从肝细胞向胆管的转运。 3糖皮质激素对AML12肝细胞MRP2基因转运胆汁酸的影响 由于慢性皮质酮暴露造成了肉鸡胆汁酸池紊乱且影响了肝细胞胆汁酸外排能力,因此本章使用AML12细胞进行体外试验,通过在细胞培养基中添加500n M地塞米松(dexamethasone,DEX)模拟肝细胞应激状态来对上述问题进行体外验证。结果显示,DEX显著(P<0.05)提升了AML12细胞转运TCA的能力,显著(P<0.05)降低了MRP2的m RNA表达水平,显著(P<0.05)上调了BSEP的m RNA表达水平,显著(P<0.05)上调了MRP2的膜蛋白表达,对BSEP的总蛋白水平没有显著影响,时钟基因PER3的蛋白表达水平也显著(P<0.05)升高。这些结果表明:糖皮质激素通过增强AML12细胞MRP2基因的蛋白表达,从而增强了肝细胞内胆汁酸向顶膜外胆管转运。

关键词： PER3   棕榈酸   足细胞   氧化应激   炎症因子  

摘要： 目的:高脂诱导足细胞损伤是导致肥胖相关性肾病(obesity relatedglomerulopathy,ORG)的重要因素之一,但机制并不明确。本研究探讨昼夜节律时钟基因3(period circadianclock 3,PER3)在抑制棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导的小鼠足细胞氧化应激及炎症因子分泌中的作用和机制。方法:正常及高脂饮食喂养C57BL/6J小鼠16周,取小鼠肾组织,采用蛋白印迹法检测正常体重组和肥胖组PER3的表达;以不同体积浓度(0、50、150和300μmol/L)PA分别干预足细胞48 h,检测各浓度组PER3 mRNA及蛋白质的表达;以150μmol/L PA分别干预足细胞0、24、36及48 h,检测各时间点PER3 mRNA及蛋白质的表达;在足细胞中转染腺病毒(adenovirus,Ad)-PER3或小干扰RNA(small interferingRNA,siRNA)-PER3后48 h,再以150μmol/L PA干预48 h,检测PA组、Ad-PER3+PA组和siRNAPER3+PA组足细胞中三酰甘油(triglyceride,TG)的含量;利用RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)检测siRNA-PER3组和siRNA-对照组差异基因的表达;在足细胞中转染Ad-PER3或Ad-对照48 h后再以150μmol/L PA干预48 h,检测Ad-PER3+PA组和Ad-对照+PA组肾病蛋白(nephrin)、足蛋白(podocin)、足细胞标记蛋白(podocalyxin)、肾小球足突细胞膜黏蛋白(podoplanin)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)、谷胱甘肽过氧化物酶1(glutathione peroxidase 1,GPX1)、过氧化氢酶(catalase,CAT)的表达,以及足细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosisfactor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)的含量。结果:在肥胖组小鼠肾组织中,PER3的表达较正常体重组小鼠下调(P<0.05);150μmol/L PA干预足细胞48 h较0、24、36 h PER3 mRNA表达均显著下调(均P<0.01);与PA组相比,Ad-PER3+PA组足细胞内TG含量显著减少,相反,siRNA-PER3+PA组足细胞内TG的含量增加(均P<0.05);在足细胞转染siRNA-PER3后,siRNA-PER3组较siRNA-对照组差异基因在氧化磷酸化、细胞外基质受体的相互作用、TNF-α信号通路、游离脂肪酸代谢及游离脂肪酸降解通路中富集(均P<0.05);Ad-PER3+PA组在足细胞标志基因(nephrin、podocin、podocalyxin和podoplanin)、足细胞内的氧化应激(SOD1、GPX1、CAT和GSH)及炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-2)的分泌较PA组均显著下调(均P<0.05)。结论:PER3可通过抑制足细胞内的脂质合成而减少PA诱导的氧化应激及炎症因子分泌。

关键词： 慢性肾脏病   昼夜节律   时钟基因  

摘要： 研究表明,昼夜节律在维持肾脏正常生理功能中起着重要作用,而睡眠问题或其他不良生活习惯引起的昼夜节律紊乱可能是导致慢性肾脏病(CKD)发生发展的重要因素。生物钟的核心时钟元件由经典时钟基因组成,时钟基因表达紊乱可能通过自噬失调、炎症反应、氧化应激及诱导肾纤维化等机制参与CKD的发生发展。在针对CKD的治疗中,昼夜节律是不可忽视的因素,深入了解时钟基因在CKD发生发展中的分子机制可以为临床上改进治疗策略提供参考。

关键词： 昼夜节律   基因   非酒精性脂肪性肝病  

摘要： 近年来昼夜节律与代谢性疾病的关系逐渐受到人们重视。大量临床研究表明,经常熬夜、轮班的人群非酒精性脂肪性肝病的发生风险明显高于作息规律的人群。基于现有数据,重点从脂质代谢、葡萄糖代谢、肠道菌群、氧化应激、内质网应激五个方面总结了昼夜节律基因在非酒精性脂肪性肝病中的作用机制。

关键词： 动脉粥样硬化   昼夜节律   生物钟  

摘要： 地球上几乎所有的生命都存在昼夜节律,控制昼夜节律的生物钟具有重要的生理功能,同时也是疾病的重要调节器。昼夜节律与动脉粥样硬化关系密切。研究表明受损的生物钟会影响造血过程和糖脂代谢,并改变局部斑块病变中的细胞功能。在分子水平上,昼夜节律可以通过Toll样受体(TLR)通路调节动脉粥样硬化炎症状态和血管重塑,通过蛋白激酶B(Akt)通路改善内皮功能和胰岛素信号传导,并通过CCL2-CCR2信号轴影响单核细胞的招募与淋巴细胞的活化。本篇综述讨论了动脉粥样硬化中昼夜节律的作用及分子机制,以及动脉粥样硬化与生物钟系统的联系。

关键词： 酒精有害使用   昼夜节律基因   睡眠   多导睡眠监测  

摘要： 目的:探讨酒精有害使用(HUA)对昼夜节律相关基因mRNA表达及其对睡眠行为的影响。方法:收集网络招募的22例HUA者(HUA组)及21名健康对照者(对照组)的基本信息,并对入组者进行匹兹堡睡眠质量指数(PSQI)评估、多导睡眠监测(PSG)及外周血白细胞中昼夜节律相关基因[钟基因(Clock)、周期基因1(Per1)、Per2、Per3、大脑和肌肉ARNT样蛋白-1基因(Bmal1)]mRNA表达测定;对结果进行组间比较,分析昼夜节律相关基因mRNA表达及其对睡眠行为的影响。结果:HUA组Clock、Per3、Bmal1基因mRNA表达明显低于对照组(P<0.05或P<0.01);PSQI总分及睡眠效率评分明显高于对照组(P均<0.05);PSG观察指标中,总睡眠时间、睡眠效率、非快速眼动2期睡眠及快速眼动期睡眠时间明显低于对照组(P均<0.05),睡眠潜伏期和入睡后清醒时间明显高于对照组(P均<0.05)。HUA组Clock mRNA表达与饮酒年限呈负相关(r=-0.434,P<0.05)。结论:HUA者Clock、Per3、Bmal1基因表达下降,并且出现睡眠时间、效率、睡眠连续性的下降和睡眠起始困难。

关键词： 小鼠实验   睡眠限制   睡眠剥夺   睡眠不足   下丘脑   钟基因   昼夜节律紊乱   组织样本  

摘要： 在本课题组之前的研究中,我们发现短时间(72h)的完全睡眠剥夺能够造成小鼠下丘脑钟基因节律表达的紊乱。相比较于短时间内完全没有睡眠的情况,长时间的睡眠不足在现代社会中更为常见。因此我们利用水平台睡眠剥夺法,设计了为期28d、每天仅4h睡眠的睡眠限制小鼠实验。并在实验结束后从8∶00开始,每隔4h收集小鼠的下丘脑组织,至次日4∶00,共采集6个时间点的组织样本。