关键词：
东方蝙蝠
昼夜节律
生物钟
高通量测序
夜行性动物
摘要：
昼夜节律现象几乎存在于所有的生命体中,是生命体最基本的特征之一,它能够调控生物体内多种生理生化过程,使生物体适应外界环境变化。蝙蝠因独特的昼伏夜出生活习性,使其成为哺乳动物研究领域最为神秘的研究类群之一。本论文以野外自然状态下的东方蝙蝠(Vespertilio sinensis)为研究对象,主要利用转录组测序技术,辅以荧光定量PCR验证实验,并结合适应性进化分析方法等,对东方蝙蝠脑区表达基因开展系统研究。首先,我们在一天内布设了四个时间间隔相等的采样时间点,分别采集不同生理活动状态下的东方蝙蝠脑组织并对其进行转录组测序与分析,随后获得了四个具有不同表达水平的基因集。这四个采样时间点分别对应蝙蝠的四种生理状态,分别是休息(Rest)、睡眠(Sleep)、觉醒(Wake)和活动状态(Activity)。通过对四个时间点基因集进行两两差异表达基因分析比较,共获得了六组差异表达基因集,并对其分别进行了系列功能富集分析。其中,对于生理活动状态差别较大的两组基因集,即休息vs觉醒(Rest vs Wake)和睡眠vs活动(Sleep vs Activity)两个比较组的富集结果表明:与进食前相比,东方蝙蝠在进食后呈高表达水平的基因显著富集于与药物代谢(drug metabolism)相关通路;而与进食后相比,东方蝙蝠在进食前的觉醒状态高表达水平的基因显著富集于多种内分泌(internal secretion)生理通路;与活动状态相比,东方蝙蝠在睡眠状态时高表达水平基因显著富集于核糖体(ribosome)相关通路;而与睡眠状态相比,东方蝙蝠在活动状态时脑区内多种信号传导通路(signal transduction)和生物钟(circadian rhythm)相关通路被高表达水平基因富集。上述结果共同表明蝙蝠脑区基因在不同的生理状态或时间节点所主导的生理过程具有明显的差异。其次,我们对蝙蝠脑区中在四个时间点共同表达的所有差异基因进行表达趋势分析和节律性表达基因分析,筛选出了一个包含27个基因且具有显著表达趋势的聚类模块6和6个节律性表达基因。根据趋势分析结果显示,模块6所包含的27个基因在一天中具有显著性表达变化趋势:在蝙蝠休息状态时这些基因的表达水平居中,到睡眠状态时基因表达水平逐渐降至最低,而后在觉醒状态时这些基因表达水平逐渐升高,最后到活动状态时表达水平达上升至最高值。由此我们推测模块6所包含的基因表达变化趋势与蝙蝠昼伏夜出的生物学习性相吻合。随后,我们对模块6中的基因进行富集分析,结果表明这些基因显著富集于多种内分泌、信号通路及生物钟相关通路,揭示出蝙蝠昼伏夜出活动模式对参与相关生理活动基因的表达变化需求。此外,根据趋势分析和相应的富集分析结果,我们还发现了一个重要的生物钟基因,Per1基因参与多条与昼夜节律相关的条目和通路,可能是东方蝙蝠脑区重要的生物钟基因。最后,我们对东方蝙蝠脑区的Per1基因开展了细致的适应性进化分析,我们共构建了两个适应性进化分析数据集。其一为基于东方蝙蝠Per1基因转录组序列,比对获得的包含23个具有不同昼夜活动模式的哺乳动物在内的数据集,共765 bp;另一个为基于Per1基因编码区序列全长的数据集,共3927 bp,包含22个具有基因组信息的且表现为不同昼夜活动模式的哺乳动物。从建树结果来看,两个数据集所构建的系统发育树都有较高的支持度,且都与真实物种树基本一致,并展现出相似的拓扑结构,表明该基因在进化上较为保守。然而,通过对Per1基因进行深入多模型正选择分析,结果表明所有夜行性动物,即蝙蝠分支和啮齿目分支的ω值均显著大于日行性物种分支的ω值,表明Per1基因在夜行性物种受到较强的选择压力作用。综上所述,本论文以夜行性的东方蝙蝠为主要研究对象,利用转录组测序技术、荧光定量PCR实验和多种分子进化等分析方法对其脑区节律性表达基因开展系统研究,发现东方蝙蝠脑区不同时间节点处的基因表达和所主导生理过程具有差异性,并鉴定出Per1可能是重要的生物钟基因。我们的研究结果有助于揭示蝙蝠特殊的昼伏夜出生活习性的生理基础和进化机制,为其他非模式生物的生物节律相关研究提供新的数据参考和研究思路。
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