关键词： 帕金森病   血压昼夜节律   血压变异性   动脉粥样硬化   相关性  

摘要： 目的:探讨帕金森病(Parkinson's disease,PD)患者血压昼夜节律、血压变异性与动脉粥样硬化的关系。方法:连续收集2020年3月至2022年6月,于张家口市第一医院就诊的192例PD患者,对患者进行24h动态血压监测(ambulatory blood pressure monitoring,ABPM),记录24h、日间、夜间平均血压均值(收缩压、舒张压、脉压均值),根据ABPM结果分为正常昼夜节律组(n=58)和异常昼夜节律组(n=134)。所有入选患者记录人口学资料、病史、体检,生化指标,记录入组次日患者全天、日间、夜间各时段对应的血压标准差(收缩压、舒张压标准差),动态动脉硬化指数、完善颈动脉彩超,记录颈动脉内膜中层厚度(carotid intimamedia thickness,CIMT)、颈动脉斑块数量及性质、踝肱指数(ankle-brachial index,ABI)。采用Pearson相关性分析评估血压和动脉粥样硬化的相关性。结果:两组相比,异常昼夜节律组患者更多合并高血压、直立性低血压(orthostatic hypotension,OH),均为P<0.05。异常昼夜节律组全天收缩压标准差、晚间收缩压标准差及晚间舒张压标准差明显高于正常昼夜节律组患者(均为P<0.05)。异常昼夜节律组患者CIMT、动态动脉硬化指数、易损斑块发生率均明显增大,ABI值明显降低,斑块面积明显增加,差异有统计学意义(均为P<0.05)。Pearson相关分析结果显示,夜间收缩压(r=-0.374,P=0.014)、全天收缩压标准差(r=-0.330,P=0.018)、全天舒张压标准差(r=-0.312,P=0.025)、IMT(r=-0.153,P=0.008)、动态动脉硬化指数(r=-0.4110,P=0.025)、斑块数量(r=-0.263,P=0.040)和斑块面积(r=-0.219,P=0.037)均与ABI均呈负相关。结论:PD患者血压昼夜节律异常发生率高,夜间高血压广泛存在,血压变异性、血压昼夜节律异常与动脉粥样硬化关系密切。

关键词： 卵巢浆液性癌   Bmal1   p53   Vimentin   预后  

摘要： 目的 探讨节律基因Bmal1在卵巢癌发生、发展的作用。方法 收集2020年9月至2022年2月经山西医科大学第一医院病理确诊的卵巢浆液性癌病例,分为节律异常组和节律正常组,各30例。检测Bmal1、p53(突变型)、Vimentin在卵巢浆液性癌中的表达,采用实时荧光定量PCR技术(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)和蛋白印迹法(Western blot)分别检测两组患者肿瘤组织中Bmal1 mRNA和蛋白的表达,用免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)检测患者肿瘤组织中p53(突变型)蛋白、Vimentin蛋白的表达,并运用Image-ProPlus软件分析表达强度。运用χ2检验分析节律和临床病理特征的关系。运用Spearman相关性分析Bmal1蛋白和p53(突变型)蛋白、Bmal1蛋白和Vimentin蛋白的表达相关性。结果 节律异常组患者肿瘤组织中Bmal1 mRNA和蛋白的表达低于节律正常组(P<0.000 1),p53(突变型)MOD值和Vimentin MOD值高于节律正常组(P<0.001)。节律异常组高级别卵巢浆液性癌(high grade serous ovarian carcinoma, HGSOC)所占比例、Ⅲ+Ⅳ期者所占比例、有淋巴结转移者所占比例均高于节律正常组(P<0.05);两组<55岁人数所占比例差异无统计学意义。Bmal1 mRNA和蛋白在HGSOC、Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移患者中表达分别低于在低级别卵巢浆液性癌(low grade serous ovarian carcinoma, LGSOC)、Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移患者中表达(P<0.001);Bmal1 mRNA和蛋白在<55岁和≥55岁患者中表达量差异无统计学意义。Spearman相关性分析显示:Bmal1蛋白和p53(突变型)蛋白表达呈负相关;Bmal1蛋白和Vimentin蛋白表达呈负相关。结论 生物钟节律可以影响Bmal1的表达,Bmal1与卵巢癌患者预后相关。

关键词： 浙江大学医学院   肝细胞癌   昼夜节律   生物节律   医学研究院   基因调控   一带一路  

摘要： 2023年1月3日,浙江大学医学院附属第四医院“/一带一路”国际医学院/国际健康医学研究院曲萌研究员团队和美国南加州大学Steve ***教授合作在《美国国家科学院院刊》(PNAS)在线发表了题为“Circadian regulator BMAL1::CLOCK promotes cell proliferation in hepatocellular carcinoma by controlling apoptosis and cell cycle”的研究论文(DOI:10.1073/pnas.2214829120),报道了生物节律核心转录因子复合体BMAL1::CLOCK对肝细胞癌的促进作用。

关键词： 国际期刊   促进作用   浙江大学   昼夜节律   生物节律   肝细胞癌   医学研究院   一带一路  

摘要： 2023年1月3日,浙江大学国际健康医学研究院、“一带一路”国际医学院、医学院附属第四医院曲萌课题组和美国南加州大学Steve A. Kay课题组合作在国际期刊《PNAS》上发表了一篇研究,首次报道了生物节律核心转录因子复合体BMAL1::CLOCK对肝细胞癌的促进作用。

关键词： 高血压   昼夜节律   Bmal1基因   炎症因子   压力感受性反射   下丘脑室旁核  

摘要： 昼夜节律是生命活动的重要特征之一,它依靠自身生物钟系统调控各项生命活动,维持机体活动的正常运行。有研究报道昼夜节律调控出现紊乱时,多种疾病的发生率也会增加,如高血压、心肌梗死、动脉粥样硬化、糖尿病心肌病等。高血压是最常见的一种慢性疾病,也是威胁全球人类健康的重大问题。近些年我国高血压患病率呈上升趋势,截至到2022年我国高血压患病人数已经达到2.45亿,也就是每4个人当中有一个人罹患高血压。此前研究表明正常人生理状态下血压昼夜节律变化呈现“两峰一谷”,“昼高夜低”的特点,主要表现为杓型或深杓型,而高血压患者的血压昼夜节律波动则发生异常,表现为非杓型或者反杓型,同时这种差异性变化使得心脑血管疾病如心源性猝死、心肌梗死、脑梗死的晨起发病率增加。因此,深度探究高血压节律紊乱的发病机制很有必要。 压力感受性反射是调节血压的重要机制之一,对于维持生物机体内的血压稳态具有重要的意义。下丘脑室旁核(paraventricular nucleus,PVN)位于第三脑室下丘脑部上端的两侧,它不仅参与机体的水盐代谢,控制分泌活动,还是调节血压以及生物节律的重要神经核团之一。有研究报道核心节律基因Bmal1参与了多种器官组织细胞的节律活动过程,但有关PVN区节核心律基因Bmal1是否参与调节血压昼夜节律的研究还不是很清楚。因此,本实验应用自发性高血压大鼠(Spontaneously hypertensive rats,SHR)探究高血压大鼠的血压以及压力感受性反射的节律是否紊乱,以及PVN区的节律基因Bmal1和IL-1β表达是否参与这一过程。 目的: 探讨高血压大鼠的血压以及压力感受反射的节律是否紊乱,以及PVN区的节律基因Bmal1和IL-1β表达是否改变。 方法: 1.实验分组: 实验采用16周龄雄性自发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats,SHR),作为高血压组;正常血压16周龄雄性大鼠(Wistar-Kyoto rats,WKY),作为对照组。 2.清醒大鼠24小时动态血压心率监测: 利用无线遥测系统测量每组动物收缩压(Systolic blood pressure,SBP)、舒张压(Diastolic blood pressure,DBP)、平均动脉压(Mean arterial pressure,MAP)、心率(Heart rate,HR);分别在北京时间的早上8:00、12:00、16:00、20:00、24:00、次日凌晨4:00以及次日清晨8:00记录WKY大鼠和SHR大鼠清醒状态的SBP、DBP、MAP和HR。 3.记录清醒大鼠的压力感受性反射: 应用浓度为1mg/m L苯肾上腺素(phenylephrine,PHE)和硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)诱导SHR和WKY组清醒大鼠的压力感受性反射,每间隔4小时,分别记录两组大鼠压力感受性反射敏感性(Baroreflex sensitivity,BRS)的变化。 4.检测下丘脑室旁核(paraventricular nucleus,PVN)蛋白水平变化:利用Western blot实验方法检测SHR大鼠和WKY大鼠节律基因Bmal1以及炎症因子IL-1β蛋白变化,每次间隔时间为4小时,取材时间点依次为北京时间的早8:00、12:00、16:00、20:00、24:00以及次日的凌晨4:00。 结果: 1.通过连续监测两组大鼠的24小时动态血压,我们得出SHR大鼠的SBP、DBP以及MAP要显著高于WKY大鼠血压,WKY大鼠血压昼夜节律符合昼低夜高的特点,SHR大鼠血压的昼夜节律紊乱消失。 ***大鼠的压力感受性反射敏感性高于SHR大鼠。WKY大鼠日间高于夜间压力感受性反射敏感性,SHR大鼠无差异。 ***大鼠的Bmal1蛋白表达水平在ZT0、ZT4、ZT12以及ZT20四个时间点显著低于WKY大鼠。 4.同一天内相同时间点SHR大鼠的IL-1β表达水平高于WKY大鼠,在ZT8、ZT12以及ZT16时SHR大鼠的蛋白表达水平明显高于对照组。 结论: 实验结果发现SHR大鼠血压升高和压力感受性反射敏感性降低,并且均存在一定程度的昼夜节律紊乱现象,其昼夜节律的紊乱可能与PVN区炎症IL-1β表达升高及Bmal1表达水平下降有关。

关键词： 脑小血管病   认知功能障碍   血压昼夜节律   时钟基因   甲基化  

摘要： 目的1.验证脑小血管病(Cerebral small vessel disease,CSVD)患者不同类型的血压昼夜节律对认知功能的影响。2.探讨CSVD患者时钟基因PER1、CRY1启动子区甲基化与血压昼夜节律以及认知功能之间的关系。方法1.选取2018年5月至2022年6月在江苏大学附属连云港医院老年医学科住院的428例CSVD患者,将所有入组患者分为认知障碍组与对照组,采用独立样本t检验、Mann-Whitney U检验、c2检验等统计学方法比较两组的临床资料及动态血压监测(Ambulatory blood pressure monitoring,ABPM)参数,最后采用二元logistic回归分析评估CSVD患者不同类型的血压昼夜节律对认知功能的影响。2.招募2021年3月至2022年6月在江苏大学附属连云港医院老年医学科住院的217例CSVD患者,同样将患者分为认知障碍组与对照组,并收集所有入组患者的外周静脉血样进行甲基化特异性PCR测定,同样采用独立样本t检验、Mann-Whitney U检验、c2检验等统计学方法比较两组的临床资料、ABPM参数以及甲基化水平,探讨CSVD患者外周血PER1和CRY1基因启动子区甲基化水平与血压昼夜节律以及认知功能之间的关系。结果1.共纳入383例CSVD患者,平均年龄为73.55±12.44岁,其中男性171例(44.6%),女性212例(55.4%)。将研究对象分为两组,认知障碍组有224例(58.5%),对照组有159例(41.5%)。(1)认知障碍组患者的年龄较大,入院时血压较低,既往心脑血管疾病发生率较高(P<0.05);(2)认知障碍组中血压昼夜节律异常的患者人数较多,尤其是反杓型(P<0.001);(3)在年龄>60岁的老年人群中,认知障碍组与对照组的血压昼夜节律存在统计学差异(P<0.001),而这种差异在年龄≤60岁的人群中不存在;(4)二元logistic回归分析显示,在校正了混杂因素后,与血压昼夜节律呈杓型的患者相比,血压昼夜节律呈非杓型(OR=4.052;95%CI,1.782～9.211;P=0.001)和反杓型(OR=8.002;95%CI,3.367～19.017;P<0.001)的患者存在认知功能障碍的风险更高。2.共纳入101例CSVD患者,平均年龄为70.01±13.01岁,其中男性56例(55.4%),女性45例(44.6%)。将研究对象分为两组,认知障碍组有65例(64.4%),对照组有36例(35.6%)。(1)认知障碍组患者的年龄较大,受教育程度较低,既往有高血压病史的人数较多(P<0.05);(2)认知障碍组患者外周血PER1和CRY1基因启动子区甲基化率高于对照组(P<0.001;P=0.041);(3)不同类型的血压昼夜节律之间PER1和CRY1基因启动子区甲基化率的差异不存在统计学意义(P>0.05);(4)与对照组相比,认知障碍组的CSVD总负荷评分更高(P=0.046);(5)二元logistic回归分析显示,在校正了混杂因素后,与基因启动子区未甲基化的患者相比,PER1基因启动子区甲基化(OR=16.565;95%CI,4.057～67.628;P<0.001)和CRY1基因启动子区甲基化(OR=6.017;95%CI,1.290～28.069;P=0.022)的患者存在认知功能障碍的风险更大。结论***患者血压昼夜节律异常与认知功能障碍独立相关。血压昼夜节律紊乱可能会影响CSVD患者的认知功能,血压昼夜节律呈非杓型和反杓型的患者存在认知功能障碍的风险更高。***患者外周血PER1、CRY1基因启动子区甲基化水平与认知功能障碍相关。此外,认知功能障碍还可能与CSVD总负荷相关。

关键词： 甘蓝型油菜   昼夜节律   生物钟   异源多倍体   转录组   表观遗传修饰   亚基因组不平衡   同源表达  

摘要： 为适应地球自转产生的24 h的昼夜交替现象,生物进化产生了生物钟系统,它具有内源性和自主振荡的特点,不依赖环境变化即可维持生命活动以近似地球自转周期进行昼夜振荡。外部环境的变化可以调节生物钟组件的转录振荡相位,而生物钟的温度补偿特性可以使生命活动在不同的温度条件下保持相对稳定。目前,核心生物钟基因及其调控网络已被基本探明。核心生物钟系统组件通过转录翻译负反馈环对下游功能基因的表达进行调控,以帮助生物适应外界环境周期变化。生物钟的自主特性使得生物能够更及时、经济地应对以昼夜振荡为主的周期性环境变化。 甘蓝型油菜是一种重要的经济作物,能够提供油料、饲料、蔬菜等多种原材料,同时也可用于观赏。在我国,甘蓝型油菜的种植不与主要粮食作物争地,在盐碱地开发利用中具有很大的种植潜力,对于保障粮食安全并提高经济效益具有重要意义。中国幅员辽阔,跨越不同纬度,昼夜条件多样,因此光温适应性是甘蓝型油菜广适性品种培育的主要育种目标。作为自然产生的异源多倍体物种,甘蓝型油菜具有复杂的遗传背景却年轻且清晰的物种起源,同时甘蓝型油菜具有完善的基因组信息,这些有利因素有助于多倍体的昼夜节律研究。异源多倍体物种经历了远缘杂交和基因组加倍事件,亚基因组间是否存在昼夜振荡差异,以及多种表观遗传修饰对节律基因同源表达多样性的影响仍然未知。染色质拥有类型丰富的表观遗传修饰,能够灵活地参与基因表达调控。多种表观遗传修饰的组合和信号强度的差异联合影响基因的转录。因此,分析组蛋白修饰和基因表达之间的关系对昼夜节律研究至关重要。表观遗传修饰的昼夜振荡有助于促进基因转录的昼夜振荡,全基因组加倍事件之后,节律基因的同源表达呈现多样性。目前还没有相关研究探索生物钟基因多拷贝之间的昼夜振荡差异及其表观遗传修饰差异。 本研究以光周期敏感的甘蓝型油菜“丙409”为实验材料,利用自然昼夜条件下生长的植株,在成花转化前,于两个完整昼夜周期的48 h内每隔4 h取样一次,通过ChIP-Seq实验,建立组蛋白修饰H3K4me3和H3K9ac以及RNAPⅡ募集的昼夜振荡数据集。同时对相同样品创建相应时间点的RNA-Seq文库,产生基因转录的时间序列数据。另外,我们还通过ATAC-Seq实验探究染色质可及性与基因转录昼夜振荡之间的关系。主要研究结果如下: 1.创建了甘蓝型油菜多周期以4 h为间隔的基因组转录和表观遗传修饰昼夜节律数据集。本研究产生了78个高质量的测序文库,数据集包含了两个昼夜内甘蓝型油菜全部蛋白质编码基因转录及其组蛋白修饰H3K4me3和H3K9ac以及RNAPⅡ募集的时间序列数据。 2.表征了甘蓝型油菜基因组转录的昼夜振荡特征。我们发现23.16%的蛋白质编码基因的转录是昼夜节律的。基因由于自身生物学功能以及所受调控的影响,其表达通常具有波动性,节律基因具有更加显著的昼夜振荡特征,如周期稳定性、更高的振幅与峰谷比。结合转录本的分析显示节律基因更多是由外显子昼夜振荡贡献的。节律基因广泛具有结合、催化等活性,参与代谢、细胞等过程等。同源基因对和亚基因组特异基因存在昼夜节律差异,前者在昼夜节律中的表现更加活跃。 3.表征了甘蓝型油菜中促进基因活跃转录的相关组蛋白修饰的昼夜振荡特征。组蛋白修饰H3K4me3和H3K9ac以及RNAPⅡ募集均呈现出稳健的昼夜振荡。表观遗传修饰的昼夜节律促进基因转录的昼夜节律的维持。H3K9ac的昼夜振荡相位早于基因转录,而H3K4me3的昼夜振荡相位迟滞于基因转录。 4.从白菜到甘蓝型油菜的物种演化过程中,远缘杂交和多倍化进程广泛改变了A基因组的昼夜节律转录行为。我们比较了亚基因组水平的昼夜节律转录特征,甘蓝型油菜An亚基因组上基因转录的振荡特征与其两位祖先之一的白菜A基因组存在广泛的差异。尽管全局状态下甘蓝型油菜An亚基因组的基因表达水平和活性表观遗传修饰高于Cn亚基因组,但Cn亚基因组的昼夜节律转录和组蛋白修饰高于An亚基因组。我们发现基因转录的节律特性和昼夜振荡特征在同源基因对中的差异分布等均受到染色质可及性的影响。 5.表观遗传修饰差异是同源基因差异表达的重要影响因素。同源基因转录的昼夜节律差异与它们分别介入不同的生物学途径有关。同源基因上的表观遗传修饰差异或许与它们在不同细胞类型和发育阶段以及差异环境下的表达调控不同有关。 6.多元组蛋白修饰的昼夜振荡促进同源基因节律表达呈现多样性。同源基因节律转录的昼夜振荡特征存在的差异与多样的表观遗传修饰组合有关。多种表观遗传修饰影响下的同源基因的节律表达差异可能与复杂基因组背景生物对外部环境的高适应性有关。 综上所述,为了表征甘蓝型油菜基因组的昼夜振荡特征,我们在甘蓝型油菜成花转换前通过RNA-Seq和ChIP-Seq产生了高质量的基因转录和表观遗传修饰数据集。我们发现蛋白质编码基因的转录和组

关键词： 电针   抑郁症   时钟基因   昼夜节律   伏隔核   前额叶皮层   缰核   终纹床核   视交叉上核  

摘要： 目的: 抑郁症是一种常见的精神障碍性疾病,其主要表现为情绪低落、兴趣减退、自我感觉无价值感,伴有睡眠障碍、头痛、胸闷等,最严重的抑郁症患者会出现自杀倾向,从而导致终身残疾,给社会和家人都带来严重的负担。已有的研究表明引发抑郁症的原因复杂,目前治疗上仍以作用于单胺类神经递质及其受体的药物为主,但此类药物起效时间慢、副作用大、病人的依从性差,且有30%的患者对药物无效,因此还需要挖掘其他确有疗效的补充替代疗法。循证医学证据表明针灸是治疗抑郁症的一种有效的手段,其中“百会”、“印堂”穴的穴位配伍最常用,但是通过该两穴的针刺或电针抗抑郁的机制目前并不明确。 研究发现抑郁症的产生与脑中某些特定脑区的功能异常有关,这些区域包括内侧前额皮层(Medial prefrontal cortex,mPFC)、缰核(Habenula,HB)、终纹床核(Bed nucleus of the stria terminalis,BNST)、伏隔核(Nucleus accumben,Nac)等。而时钟基因是指一类参与并维持生物钟调控的基因,包括Bmal1、Clock Per1、Per2、Per3、Dbp等,这些基因的转录翻译活动是昼夜节律分子的生物学基础,具有维持生物体正常昼夜节律的作用。视交叉上核(SCN)是哺乳类动物生物钟的中央起搏器,它整合光信息,最终调节基因表达、生理和行为的节律。已有尸检及基础研究证据表明生物钟基因的位点突变或表达改变与抑郁样行为有关,然而生物钟基因具体如何参与抑郁症的机制尚不清楚。本课题组前期通过对抑郁模型大鼠的前额叶皮层(Prefrontal Cortex,PFC)进行基因组学测序筛查,发现该脑区中Bmal1、Dbp、Per2、Per3等的时钟基因表达异常,且电针百合、印堂能够对PFC中这种异常有改善作用。然而SCN以及抑郁症发病相关的上述其他脑区的时钟基因表达的情况尚不明确。 为了进一步了解节律控制脑区、抑郁症相关脑区的时钟基因表达与抑郁症的发病、电针抗抑郁的关系,本实验采用慢性不可预测温和应激(Chronic Unpredictable Mild Stress,CUMS)来建立小鼠抑郁模型,并观察电针“百会”、“印堂”穴对小鼠抑郁样行为的影响;同时采用实时定量聚合酶链式反应(qPCR)同步检测SCN主钟脑区和上述与抑郁症发病密切相关的脑区中Bmal1、Per1、Per2、Per3、Dbp等时钟基因的昼夜表达水平,以探讨SCN和抑郁相关脑区是否会发生时钟基因昼夜节律表达的紊乱,这种紊乱又能否被电针百会印堂所调节。研究结果不仅为解析抑郁症的发病提供思路,也为针灸督脉穴位产生的抗抑郁作用机制研究提供方向。 方法: 1.电针“百会”、“印堂”穴对CUMS小鼠的抑郁样行为的影响 本实验使用了 43只8周龄体重20(±)2g的C57BL/6雄性小鼠,饲养一周后,随机分为3组:对照+假电针(Con)组、模型+假电针(CUMS)组、模型+电针(EA)组,其中CUMS和EA组接受CUMS刺激。EA组在CUMS刺激结束后在“百会”、“印堂”两穴针剌结合Master-8电刺激仪的刺激进行电针治疗,治疗持续时间为20min,隔天一次,总疗程7次。然后对动物进行抑郁相关行为学检测,通过代表“快感缺失”和“行为绝望”两大抑郁核心症状的糖水偏好实验和悬尾实验,观察小鼠的行为表现以评价小鼠的抑郁程度,并通过旷场实验的总路程及在中央停留时间、十字高架迷宫实验的开臂停留的时间,来鉴别小鼠是否具有焦虑表现。 2.电针“百会”、“印堂”穴对CUMS小鼠抑郁相关脑区昼夜时钟基因的影响在行为学测试结束后,分别于9:00和21:00两个时间点,使用异氟烷麻醉小鼠,待小鼠的生命体征消失后,断头取脑;将脑组织切成100μm厚的脑片,再使用精细锥分离出SCN、mPFC、BNST、HB、Nac脑区组织并快速冷冻;用miRNeasy Micro Kit试剂提取总RNA后,采用qPCR技术检测Bmal1、Per1、Per2、Per3、Dbp基因表达量,分析统计SCN、mPFC、BNST、HB、Nac脑区上述各时钟基因昼夜节律的表达。 结果: ***刺激导致小鼠糖水摄入显著减少,同时在悬尾实验中表现出不动时间显著增加,而电针“百会”、“印堂”两穴可以改善小鼠的糖水偏好、不动时间的异常,各组动物在高架开臂停留时间中无明显改变。 2.在SCN脑区,CUMS刺激或电针均未引起白天或夜间生物钟基因Bmal1、Per1、Per2、Per3、Dbp组间表达异常。另外Con组、CUMS组、EA组的Bmal1基因的昼夜节律仍然存在。而Per1基因的Con组、CUMS组的昼夜节律不存在,但EA组仍有昼夜节律。Per3基因Con组的昼夜节律存在,CUMS组、EA组的昼夜节律则

关键词： 型胶原   昼夜节律基因   褪黑素1a受体   昙花提取物  

摘要： 【目的】本文通过研究人真皮成纤维细胞(Primary Dermal Fibroblast,Normal,Human,Adult,HDFa)中节律基因PER2、CRY1与I型胶原合成之间的联系,以及褪黑素受体1a(Melatonin Receptor 1a,MT1)与节律基因CRY1、PER2的细胞信号通路对I型胶原合成的影响,并基于上述通路,对天然植物提取物进行筛选、通路验证及评价。【方法】1.本研究通过利用小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)干扰节律基因CRY1的表达,使用RT-PCR检测节律基因CRY1、PER2及衰老相关指标——基质金属酶1(Matrix metalloproteinase1,MMP1)、I型胶原(Collagen Type 1,Collagen I)基因表达情况。2.选择MT1受体的内源性配体-褪黑素(Melatonin)作用HDFa后,检测24h内CRY1、PER2节律基因表达情况,同时检测MMP1、Collagen I的基因及蛋白表达水平。3.建立活细胞MT1过表达系统:在293T细胞上过表达MT1受体,褪黑素作用后通过Glo-sensor实验检测活细胞c AMP水平。4.使用c AMP/PKA细胞信号转导通路激活剂Forskolin和抑制剂H-89分别作用HDFa后检测CRY1、PER2、MMP1、Collagen I的基因表达水平。5.使用GPCRome实验对昙花提取物进行筛选、Glo-sensor实验检测昙花提取物与MT1受体的关系,昙花提取物作用HDFa细胞后使用RT-PCR、免疫荧光、Elisa检测CRY1、PER2、Collagen I的表达情况。【结果】1.节律基因和I型胶原合成的关系:在小干扰RNA敲低实验中,当转染si CRY1 24h时,CRY1(p<0.0001)基因表达水平明显降低,证明该敲低模型成立。敲低CRY1时,PER2(p=0.003)在m RNA水平上升高,MMP1(p=0.0019)和Collagen I(p=0.0111)在m RNA水平上分别降低与增加。2.褪黑素对I型胶原合成的影响:褪黑素作用于HDFa,利用RT-PCR检测m RNA水平,结果显示:CRY1降低(p<0.0001),PER2增加(p<0.0001),MMP1降低(p=0.0022),Collagen I增加(p<0.0001)。***1过表达系统的建立:在293T细胞中过表达MT1受体,褪黑素作用后Glo-sensor检测293T细胞c AMP增高。4.节律基因CRY1、PER2与MT1受体细胞信号转导通路及分子机制:用5μM Forskolin作用HDFa细胞后能够上调PER2(p<0.0001),下调MMP1(p<0.0001),上调Collagen I(p<0.0001);10μM H-89作用HDFa细胞后能上调CRY1(p=0.0245),上调MMP1(p<0.0001),下调Collagen I(p=0.0001)。5.昙花对节律基因CRY1、PER2的影响:昙花提取物有机相(EPI-DMSO相)与昙花提取物水相(EPI-HO相)不同浓度:0.125%(v/v)、0.5%(v/v)作用HDFa细胞24h后,RT-PCR检测发现在昙花提取物水相(EPI-HO相)0.125%(v/v)组与昙花提取物有机相(EPI-DMSO相)0.5%(v/v)组中PER2转录水平上升(p分别为0.0116、0.0412);而CRY1转录水平在昙花提取物水相(EPI-HO相)0.5%(v/v)和昙花提取物有机相(EPI-DMSO相)0.125%(v/v)组中均降低(p分别为0.0088、0.0137)。【结论】1.在利用si RNA敲低HDFa细胞中CRY1基因后,在转录水平上CRY1基因表达降低同时PER2基因的表达增加,推测CRY1可能对PER2基因形成了负反馈调节。2.在293T MT1受体过表达系统中,MT1受体内源性配体-褪黑素能与MT1受体结合,并能够招募下游G蛋白,激活下游c AMP/PKA通路。实验验证了CRY1/PER2基因位于c AMP/PKA细胞信号转导通路下游。褪黑素作用HDFa细胞后检测CRY1、PER2基因表达发现,褪黑素可降低CRY1的表达,增加PER2的表达。由此可得到结论:褪黑素可通过结合MT1受体,激活c AMP/PKA通路,进而促进PER2的表达,同时使CRY1表达降低。3.上述实验表明:PER2基因表达升高是促进I型胶原合成的重要因素,PER2基因的表达缺失可能会导致I型胶原合成减少。褪黑素作用HDFa细胞24h后,能够抑制MMP1的表达、促进Collagen I的表达,发挥抗衰老的作用,这与CRY1表达的降低、PER2表达

关键词： 前列腺癌   昼夜节律基因   癌症预后   生物钟   前列腺癌   昼夜节律基因   miR-6883-5p   AR-V7   恩杂鲁胺  

摘要： 前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是男性最常见的恶性肿瘤之一,目前前列腺癌已经成为男性泌尿系统恶性肿瘤中发病率排名第一的癌症。根据2020年全球癌症统计数据,前列腺癌占所有男性癌症的约13.6%,是男性癌症死亡的第四大原因,占男性癌症死亡的约7.1%。在美国,根据美国癌症协会(American Cancer Society,ACS)的数据,估计2023年将有约288,300名男性被诊断出前列腺癌,约34,700名男性死于前列腺癌。 昼夜节律基因是控制人体昼夜节律的基因,以适应地球的自转周期。这些基因编码了蛋白质,它们构成了生物钟的核心,这个核心负责调节一系列生理过程,如睡眠—觉醒周期、体温和代谢率等。目前已经发现了一系列昼夜节律基因,包括 CLOCK、BMAL1、PER1、PER2、PER3、CRY1、CRY2、CSNK1D、CSNK1E、NR1D1、RORA、NR1D2和RORB等。这些基因通常以负反馈回路的形式调控相关基因的表达,它们编码的蛋白质能够抑制它们自己的表达,从而形成周期性的表达模式。研究表明,生物钟的紊乱与多种疾病的发生有关,包括肥胖、糖尿病、心血管疾病、精神疾病以及癌症等。 昼夜节律对前列腺癌有一定的影响。研究表明,昼夜节律紊乱可能会增加前列腺癌的风险,如夜班工作可能会打乱人体的生物节律,从而增加前列腺癌的发生率。前列腺细胞的昼夜节律基因与癌症的发生和发展密切相关,如CLOCK和BMAL1基因的表达在前列腺癌组织中明显下降。这可能会导致前列腺细胞的生物节律失调,从而促进肿瘤的生长和扩散。此外,昼夜节律基因的突变也与前列腺癌的风险增加有关,如PER1和PER2基因的突变被认为是前列腺癌的潜在风险因素,这些基因的突变可能会导致昼夜节律紊乱、DNA损伤修复异常以及细胞周期的改变。 最近有研究表明,miRNA与昼夜节律之间存在着复杂的相互作用关系。miRNA是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA,其作用机制复杂,目前研究比较多的是通过与靶基因mRNA的3' UTR结合,以调控目标基因的表达。昼夜节律基因的表达和miRNA的表达存在周期性的变化,它们之间可能存在着相互调节的关系。研究发现PER2能够抑制miR-183的表达,从而影响视网膜色素上皮细胞的功能;而一些miRNA也能够影响昼夜节律基因的表达,如miR-132和miR-212能够调控CLOCK基因的表达,从而影响昼夜节律的调节。对这种相互作用关系的深入研究有助于更好地理解生物节律和调节机制的复杂性,并有可能为预防和治疗与生物钟有关的疾病提供新的思路和策略。 miRNA与前列腺癌的关系已经得到了广泛的研究,miRNA在前列腺癌的发生发展、诊断、治疗以及预后评估中都具有重要作用。深入研究miRNA与前列腺癌的关系,将有助于更好地理解前列腺癌的分子机制。 目前对昼夜节律基因与前列腺癌发生发展的关系还需要进一步的研究。虽然已经发现了一些相关的基因和生物发展过程,但是具体的调节机制和相互作用关系还需要更深入地探究。对于预防和治疗前列腺癌,深入了解这种关系对于制定更有效的预防和治疗策略也具有潜在的价值。 第一部分:核心昼夜节律基因的表达水平与前列腺癌预后的关系 目的:通过生物信息学技术挖掘公共数据库以试图进一步阐明核心昼夜节律基因的表达水平在前列腺癌预后预测中的重要作用。 方法:(1)从癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)和基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)中收集了 605例前列腺癌患者,分别对每个昼夜节律核心基因进行生存分析。(2)用Cox回归分析考察核心昼夜节律基因的预后能力,提取独立的预后特征,建立基于核心昼夜节律基因的风险预后评分模型。(3)探索TCGA训练集和独立GEO数据集中风险评分模型的预测能力。(4)评估了核心昼夜节律基因的风险预后评分模型与临床病理参数、生物学过程和信号通路之间的关系。 结果:(1)核心昼夜节律基因的表达水平与前列腺癌患者年龄、肿瘤分期、淋巴结转移、无病生存期(DFS)、无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)广泛相关。(2)9个核心昼夜节律基因,包括CSNK1D、BTRC、CLOCK、CSNK1E、FBXL3、PRKAA2、DBP、NR1D2和RORB,被确定为前列腺癌的重要预后因素,并用于构建基于生物钟的风险评分模型。(3)对于DFS,3年或5年受试者特征曲线下的面积在0.728-0.821之间,具有更好的预测能力。(4)与T3-4N1期相比,T2N0期前列腺癌患者可能更受益于基于核心节律基因的风险评分模型。(5)此外,较高的风险评分与较短的DFS(p<0.0001),早期进展(p<0.0001),以及更高的前列腺