关键词：
乳腺癌
肿瘤预后
HGH1
昼夜节律
摘要：
研究背景:
世界卫生组织国际癌症研究机构最新发布的《2022年全球肿瘤负担数据报告》指出,全球乳腺癌的新发病例数量已经达到了230万例,是女性中发病率第一位的恶性肿瘤,全球女性将可能面临这一疾病带来的沉重经济压力。昼夜节律作为一种特定的时间程序,能够将时间线索转化为单个细胞内的分子改变,昼夜节律的紊乱可能会引发一系列细胞生物学上的异常表现,包括细胞异常增殖、凋亡抵抗以及基因突变增加,这些都是恶性肿瘤发生的重要生物标志物。流行病学研究揭示了昼夜节律紊乱与肿瘤发生发展之间的紧密联系,这种紊乱与多种类型的肿瘤均存在显著的关联,如肝癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等。昼夜节律相关基因(如CLOCK、Per1、Per2、Per3、Cry、BMAL1等)表达水平的改变会增加乳腺癌的风险、促进侵袭和转移并增加复发率。本研究旨在深入探索乳腺癌患者中昼夜节律相关基因的表达情况,并进一步分析这些基因与乳腺癌的临床表现及预后之间的潜在联系。我们还将对经过筛选的HGH1基因展开生物学功能的验证工作,旨在进一步丰富乳腺癌中昼夜节律相关基因的研究理论及实验数据。
材料和方法:
1.生物信息学分析:借助TCGA数据库,对昼夜节律相关基因的表达差异进行了深入研究,并进行了单因素Cox回归分析,以筛选出与昼夜节律紧密相关的差异表达基因和预后相关基因。随后,利用LASSO回归和多因素Cox回归分析进一步筛选关键调控基因(CRGs),并据此构建了预后模型。为了评估该预后模型的风险评分准确性,采用了ROC曲线进行验证。此外,还构建了列线图,以便更直观地预测癌症患者复发的可能性。分析预后模型高低风险组和免疫浸润之间的关系,进行GO和KEGG富集分析探索相关的信号通路。使用TCGA和GSE96058数据集验证预后模型基因在BC中的表达和预后,并对其进行GO和KEGG分析。
2.疾病临床特征相关性研究:深入研究了经生物信息分析筛选出的昼夜节律相关基因HGH1。运用免疫组化技术,对乳腺癌组织及其邻近的非癌组织中HGH1的表达水平进行了检测,对比分析了HGH1在乳腺癌组织与癌旁组织中的表达差异。
3.体外实验:采用了蛋白免疫印迹技术和实时定量PCR方法,对正常乳腺上皮细胞系与乳腺癌细胞系中HGH1的表达水平进行了对比分析,以探究两者之间的差异。采用脂质体介导的si RNA转染技术,使用Western Blot和RT-q PCR方法对si RNA的对HGH1的干扰效率进行精准检测。为了全面评估乳腺癌细胞的相关生物学特性,我们采用了多种实验手段:集落形成实验旨在评估细胞的克隆形成潜能,而CCK-8实验则用于检测细胞的增殖状态。此外,划痕实验用于观察细胞的迁移能力,Transwell实验则用于检测细胞的侵袭能力。这些实验为我们提供了关于乳腺癌细胞在HGH1表达受干扰后的多方面表现数据。
结果:
1.经过对TCGA和GEO数据库中数据的详细剖析,我们注意到乳腺癌组织与正常组织之间,在昼夜节律相关基因的表达水平上,存在明显的不同。
2.通过对TCGA数据的深入分析,构建了一个基于SIAH2、HGH1、ADRB1、KRT17、CES1、SLC25A5、NFE2的风险模型。此模型展现了良好的预测能力,且对乳腺癌患者的总生存率(OS)具有独立的影响作用。在乳腺癌患者中,SIAH2、ADRB1、KRT17、CES1和NFE2的高表达以及HGH1、SLC25A5的低表达均与较高的总生存率密切相关。
3.通过结合年龄、T分期、N分期、M分期以及预后模型风险评分等关键信息,我们构建了一个列线图,用于预测乳腺癌患者5年、8年和10年的生存率。该列线图的校准曲线显示出良好的一致性,这充分证明了其具有较高的预测准确性和实际应用价值。
4.高低风险组GSEA分析显示,PI3K-Akt信号、癌症旁路、核糖体、P53信号通路、氧化磷酸化在高风险组中呈显著的富集;免疫浸润分析结果显示,高风险组患者的免疫评分相较于低风险患者而言较低。具体而言,低风险患者的CD8阳性T细胞、活化CD4阳性记忆T细胞、初始B细胞、记忆B细胞、单核细胞、活化NK细胞、静息树突状细胞和肥大细胞等免疫细胞的免疫活性较高,而高风险组患者在这些方面则呈现出较低的水平。
5.临床病理组织免疫组化检测结果显示,乳腺癌组织中的HGH1蛋白表达水平呈现出显著升高的趋势。根据Western Blot与RT-q PCR的检测结果,观察到HGH1在乳腺癌细胞系包括MCF-7、T47D、MDA-MB-231以及MDA-MB-361中,均呈现出高表达的特性。
***能够有效地抑制HGH1在MDA-MB-231和MCF-7中的表达水平。通过敲低HGH1,我们观察到MDA-MB-231和MCF-7的集落形成能力、增殖能力、迁移能力
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