关键词： 生物钟   BMAL1   节律性基因   代谢障碍相关脂肪性肝  

摘要： 哺乳动物在行为活动与生理功能层面表现出以24 h为周期的节律性变化,被称为昼夜节律,参与调控昼夜节律的内在机制则被称为生物钟。哺乳动物生物钟由存在于视交叉上核的中枢生物钟以及存在于大多数组织器官（肝脏、肾脏和肌肉等）的外周生物钟组成。在分子机制层面,生物钟系统的节律性振荡是由生物钟基因（Bmal1、Clock、Pers、Crys等）及其编码蛋白形成的正负反馈转录、翻译调控环路所决定的。此外,一些生物钟核心转录因子通过E-box、D-box或RRE等关键顺式作用元件调控大量下游生物钟控制基因的节律性表达,进而调节机体多项生理功能（代谢、生殖、免疫与激素分泌等）的节律性变化。肝脏是机体调节新陈代谢和能量稳态的重要外周器官。前期研究证据表明,位于肝脏组织的生物钟系统参与调控肝细胞的增殖、DNA损伤反应、迁移、凋亡、代谢以及免疫等多项生理功能,在肝脏代谢稳态维持过程中发挥重要作用。流行病学调查数据表明,非酒精性脂肪肝、肝硬化以及肝细胞癌（HCC）等代谢功能障碍相关脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease,MAFLD）的发生与生物节律紊乱有关,但具体的分子机制尚不清楚。 本研究以Bmal1全身性敲除小鼠(Bmal1-/-)、Bmal1肝脏特异性敲除小鼠(L-Bmal1-/-)以及人Hep G2细胞系为研究模型,借助RNA-seq、Ch IP-seq、生物信息学软件、实时荧光定量PCR（q PCR）、真核表达载体构建、蛋白免疫印迹（Western blot,WB）、CCK-8实验和细胞划痕实验等技术手段,首先鉴定肝脏组织中生物钟直接或间接调控的节律性基因,进一步结合人类组织活检的公共数据库中人类非酒精性脂肪肝等肝脏疾病以及HCC的RNA-seq数据,对肝脏生物钟和HCC之间节点基因的功能进行预测、分析和验证,探究生物钟紊乱导致肝癌等脂肪性肝病发生发展的潜在机制。主要研究结果如下: 1.利用NCBI-GEO数据库中野生型（WT）小鼠的3组肝脏转录组数据集（GSE184303、GSE114400和GSE199061,每组数据集包含WT小鼠一个昼夜周期中6个不同时间点肝脏组织的测序数据）,通过R语言软件包Vennerable首先进行了基因的节律性分析。结果显示,三组数据集中共鉴定出536个呈现节律性表达的交集基因。进一步收集了CT条件下Bmal1-/-、L-Bmal1-/-及其相应对照组小鼠中的2个代表性时间点（CT2和CT14）的肝脏样本进行RNA-seq测序。通过R语言中的edge R包进行差异基因分析,分别筛选出Bmal1-/-与对照组（WT组）、L-Bmal1-/-与对照组（Floxp组）之间的差异表达基因（DEGs）,将上述获得的节律性基因集与测序结果分析得到的DEGs取交集,获得80个可能受BMAL1直接或间接调控的节律基因（BMAL1-regulated genes,BRGs）。GO和KEGG分析结果表明,BRGs显著富集于糖脂代谢、免疫反应和HCC等生理病理信号通路。为进一步验证鉴定结果,利用STRING和Cytoscape软件工具筛选出15个核心的BRGs,并从中选择8个核心BRGs（Nr1d1、Cry1、Gys2、Homer2、Serpina6、Slc2a2、Nmrk1和Upp2）,结合小鼠肝脏样本q PCR检测和BMAL1 Ch IP-seq数据的可视化分析,获取这些核心BRGs的表达模式。q PCR结果显示,8个核心BRGs在WT小鼠肝脏中均呈现昼夜节律性表达。与对照组小鼠相比,L-Bmal1-/-小鼠肝脏中8个所选BRGs的节律性表达完全丧失。并且除Cry1外,其余BRGs的m RNA表达量显著降低。利用R软件包Karyoplote R对BMAL1蛋白在核心BRGs基因组区域的结合峰进行了注释和可视化分析,并进一步结合JASPAR数据库进行了深入分析,结果显示BMAL1蛋白在6个时间点（CT0、CT4、CT8、CT12、CT16、CT20）均存在与8个核心BRGs基因组区域的结合峰,且呈现明显的昼夜节律性变化。 2.借助NCBI-GEO公共数据库中人类肝脏脂代谢异常相关疾病（单纯脂肪变性与非酒精性脂肪肝）和HCC的RNA-seq数据,整合分析了肝脏中BMAL1调控的节律性基因与MAFLD发生发展过程之间的联系。结果表明,从单纯脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎过程中,人类肝脏中的BMAL1 m RNA表达量呈现持续下降的趋势,且HCC患者肝脏癌症组织中BMAL1 m RNA表达量显著低于癌旁组织。进一步利用R包Vennerable和Up Set将上述BRGs与人类肝癌转录组数据集的DEGs进行联合分析,共获得2个BRGs,分别是Gys2和Upp2。此外,Gys2和Up

关键词： 乳腺癌   肿瘤预后   HGH1   昼夜节律  

摘要： 研究背景: 世界卫生组织国际癌症研究机构最新发布的《2022年全球肿瘤负担数据报告》指出,全球乳腺癌的新发病例数量已经达到了230万例,是女性中发病率第一位的恶性肿瘤,全球女性将可能面临这一疾病带来的沉重经济压力。昼夜节律作为一种特定的时间程序,能够将时间线索转化为单个细胞内的分子改变,昼夜节律的紊乱可能会引发一系列细胞生物学上的异常表现,包括细胞异常增殖、凋亡抵抗以及基因突变增加,这些都是恶性肿瘤发生的重要生物标志物。流行病学研究揭示了昼夜节律紊乱与肿瘤发生发展之间的紧密联系,这种紊乱与多种类型的肿瘤均存在显著的关联,如肝癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等。昼夜节律相关基因(如CLOCK、Per1、Per2、Per3、Cry、BMAL1等)表达水平的改变会增加乳腺癌的风险、促进侵袭和转移并增加复发率。本研究旨在深入探索乳腺癌患者中昼夜节律相关基因的表达情况,并进一步分析这些基因与乳腺癌的临床表现及预后之间的潜在联系。我们还将对经过筛选的HGH1基因展开生物学功能的验证工作,旨在进一步丰富乳腺癌中昼夜节律相关基因的研究理论及实验数据。 材料和方法: 1.生物信息学分析:借助TCGA数据库,对昼夜节律相关基因的表达差异进行了深入研究,并进行了单因素Cox回归分析,以筛选出与昼夜节律紧密相关的差异表达基因和预后相关基因。随后,利用LASSO回归和多因素Cox回归分析进一步筛选关键调控基因(CRGs),并据此构建了预后模型。为了评估该预后模型的风险评分准确性,采用了ROC曲线进行验证。此外,还构建了列线图,以便更直观地预测癌症患者复发的可能性。分析预后模型高低风险组和免疫浸润之间的关系,进行GO和KEGG富集分析探索相关的信号通路。使用TCGA和GSE96058数据集验证预后模型基因在BC中的表达和预后,并对其进行GO和KEGG分析。 2.疾病临床特征相关性研究:深入研究了经生物信息分析筛选出的昼夜节律相关基因HGH1。运用免疫组化技术,对乳腺癌组织及其邻近的非癌组织中HGH1的表达水平进行了检测,对比分析了HGH1在乳腺癌组织与癌旁组织中的表达差异。 3.体外实验:采用了蛋白免疫印迹技术和实时定量PCR方法,对正常乳腺上皮细胞系与乳腺癌细胞系中HGH1的表达水平进行了对比分析,以探究两者之间的差异。采用脂质体介导的si RNA转染技术,使用Western Blot和RT-q PCR方法对si RNA的对HGH1的干扰效率进行精准检测。为了全面评估乳腺癌细胞的相关生物学特性,我们采用了多种实验手段:集落形成实验旨在评估细胞的克隆形成潜能,而CCK-8实验则用于检测细胞的增殖状态。此外,划痕实验用于观察细胞的迁移能力,Transwell实验则用于检测细胞的侵袭能力。这些实验为我们提供了关于乳腺癌细胞在HGH1表达受干扰后的多方面表现数据。 结果: 1.经过对TCGA和GEO数据库中数据的详细剖析,我们注意到乳腺癌组织与正常组织之间,在昼夜节律相关基因的表达水平上,存在明显的不同。 2.通过对TCGA数据的深入分析,构建了一个基于SIAH2、HGH1、ADRB1、KRT17、CES1、SLC25A5、NFE2的风险模型。此模型展现了良好的预测能力,且对乳腺癌患者的总生存率(OS)具有独立的影响作用。在乳腺癌患者中,SIAH2、ADRB1、KRT17、CES1和NFE2的高表达以及HGH1、SLC25A5的低表达均与较高的总生存率密切相关。 3.通过结合年龄、T分期、N分期、M分期以及预后模型风险评分等关键信息,我们构建了一个列线图,用于预测乳腺癌患者5年、8年和10年的生存率。该列线图的校准曲线显示出良好的一致性,这充分证明了其具有较高的预测准确性和实际应用价值。 4.高低风险组GSEA分析显示,PI3K-Akt信号、癌症旁路、核糖体、P53信号通路、氧化磷酸化在高风险组中呈显著的富集;免疫浸润分析结果显示,高风险组患者的免疫评分相较于低风险患者而言较低。具体而言,低风险患者的CD8阳性T细胞、活化CD4阳性记忆T细胞、初始B细胞、记忆B细胞、单核细胞、活化NK细胞、静息树突状细胞和肥大细胞等免疫细胞的免疫活性较高,而高风险组患者在这些方面则呈现出较低的水平。 5.临床病理组织免疫组化检测结果显示,乳腺癌组织中的HGH1蛋白表达水平呈现出显著升高的趋势。根据Western Blot与RT-q PCR的检测结果,观察到HGH1在乳腺癌细胞系包括MCF-7、T47D、MDA-MB-231以及MDA-MB-361中,均呈现出高表达的特性。 ***能够有效地抑制HGH1在MDA-MB-231和MCF-7中的表达水平。通过敲低HGH1,我们观察到MDA-MB-231和MCF-7的集落形成能力、增殖能力、迁移能力

关键词： 大黄鱼   昼夜节律基因家族   节律性  

摘要： 为适应季节与昼夜的变化,生物进化出以24 h为周期的内源性基因转录振荡器—生物钟。生物钟的主要调节机制由2个高度保守的正调节器:BAML1和CLOCK,2个负调节器:CRY和PER共同决定的。鉴定了大黄鱼中cry2、cry5、clockb和per3昼夜节律基因,对这些昼夜节律基因构建系统进化树研究发现,cry2和cry5属于同源基因家族,且这些大黄鱼昼夜节律基因在功能域上与其它硬骨鱼的昼夜节律基因高度保守。根据正常光照(12L:12D)对昼夜节律基因在大黄鱼组织中的特异性表达发现,cry2、cry5、clockb和per3在脑组织中表达最显著。结合在正常光照(12L:12D)和恒暗(0L:24D)处理下发现,这些昼夜节律基因只在正常光照下呈节律性。由于光周期可以影响昼夜节律基因的表达,这说明昼夜节律基因在鱼的光敏器官内部自发表达,不同的光周期可以影响光敏器官的昼夜节律基因的节律。

关键词： 昼夜节律   时钟基因   结直肠癌  

摘要： 昼夜节律(circadian rhythm)是生物体为适应地球自转所形成的周期约为24 h的内源性计时系统^([1])。生物钟基因调控昼夜节律的正常运行,在调节人体激素水平、免疫功能、睡眠、代谢等多种生理活动中发挥重要作用,同时还参与调控细胞增殖、分化和代谢等过程^([2])。昼夜颠倒、睡眠和进食模式紊乱会干扰正常人体的昼夜节律系统,长期昼夜节律紊乱会诱发许多慢性疾病,并且也是肿瘤发生的重要致病因素之一^([3])。

关键词： 脑胶质瘤   MRI   CRY1   诊断   预后   免疫细胞浸润   生物标志物   免疫治疗靶点  

摘要： 目的本项研究探讨脑胶质瘤的MRI诊断及昼夜节律基因CRY1对脑胶质瘤表达特性的研究。方法通过MRI等主要影像学诊断脑胶质瘤,片状弥散性T1低信号、T2高信号,可无明显强化为中枢神经系统肿瘤诊断时唯一需要影像学标准的疾病。基于GEO和TCGA数据库下载CRY1基因在胶质瘤中的表达数据。生存分析采用Kapian-Meier和Cox比例-风险回归。最小绝对收缩和选择算符(LASSO)筛选与生存相关的免疫细胞。RNA-Seq分析证实了结果。结果昼夜节律基因CRY1在脑胶质瘤中的高表达与较差的预后相关。GSEA软件筛选出的与胶质瘤相关的信号通路中参与上调的通路有7条。筛选与CRY1结合的蛋白,研究TCGA数据库中CRY1改变频率、突变类型。发现CRY1表达高水平和较高的免疫细胞浸润率相关,对免疫治疗的敏感性更高。结论CRY1的高表达水平与胶质瘤的不良预后密切相关,且CRY1具有较高的免疫浸润率,对免疫治疗的敏感性更高,则CRY1可能做为胶质瘤免疫治疗的生物标志物的潜在治疗靶点。

关键词： 鸭   视黄醇相关孤儿受体B   蛋重   相关性  

摘要： 为探讨鸭昼夜节律相关基因RORB(视黄醇相关孤儿受体B)与鸭蛋重性状的相关性,采用Illumina测序的方法对90只金定鸭RORB基因序列进行测序,以分析RORB基因上3个SNP位点在不同蛋重鸭个体的差异,并与300日龄和450日龄蛋重进行相关性分析;荧光定量PCR的方法检测RORB及相关基因CLOCK、BMAL1和PER2 mRNA在不同蛋重鸭卵巢组中的表达差异。结果表明,RORB基因上Z-35251072和Z-35256947位点的SNP突变与鸭450日龄的蛋重呈显著负相关,Z-35278196位点的SNP突变与鸭300日龄和450日龄蛋重呈显著负相关;RORB和PER2在低蛋重组中的表达显著高于在中蛋重和高蛋重组的表达(P<0.05),而CLOCK和BMAL1在高蛋重组中的表达显著高于中蛋重和低蛋重组的表达(P<0.05)。结果提示,RORB在鸭的蛋重性能中可能发挥重要作用,且可能与昼夜节律相关基因间的相互调节有关,该结果为研究鸭的蛋重性能调控奠定理论基础。

关键词： 胡萝卜   生物钟   REVEILLE   转录因子   表达分析   光合特性  

摘要： 为了解胡萝卜生物钟相关基因REVEILLEs (RVEs)在昼夜节律中的分子调控机制,从胡萝卜基因组中检索获得DcRVEa和DcRVEb基因。对两个光周期不同时间点胡萝卜叶片进行光合参数测定,利用实时荧光定量PCR技术对DcRVEa和DcRVEb基因表达量进行检测与分析。结果显示:DcRVEa和DcRVEb分别含有304和307个氨基酸,均为亲水性蛋白;二级结构以α-螺旋和随机卷曲为主。胡萝卜RVE蛋白序列与其他物种同源性序列相似度为66.69%;DcRVEa与莲(Nelumbo nucifera)进化关系较近, DcRVEb与橡胶树(Hevea brasiliensis)进化关系较近。蛋白互作网络分析结果显示,胡萝卜DcRVEa和DcRVEb与LNK1、LNK2、CCA1、TOC1等生物钟核心元件具有较直接的作用。在两个光周期(48 h)中,胡萝卜叶片净光合速率(P_(n))、气孔导度(G_(s))和蒸腾速率(T_(r))在白天处于较高水平,胞间CO_(2)浓度(Ci)则相反。实时荧光定量PCR结果显示,在两个光周期(48 h)中, DcRVEa和DcRVEb的相对表达量均在黑暗条件下达到峰值。DcRVEa和DcRVEb的表达趋势相似,均响应昼夜节律的变化。本文研究结果为进一步研究胡萝卜生物钟基因DcRVEa和DcRVEb的分子机制提供参考。