关键词： 机械通气肺损伤   基因芯片   昼夜节律   差异表达基因1  

摘要： 背景和目的 机械通气肺损伤（ventilation-induced lung injury, VILI）是一种伴有细胞因子释放的广泛肺泡毛细血管膜的损伤,其发生率约占机械通气的5%-39%。VILI的发生涉及到传统的气压伤、容积伤、不张伤,以及生物性损伤。但VILI的发病机制复杂,迄今尚未完全阐明。目前很多报导指出肺肿瘤、慢性肺阻塞性疾病、哮喘等呼吸系统疾病以及缺血缺氧性脑损伤打破机体昼夜节律性而致病,运用时间疗法能有效诊治。VILI作为呼吸系统急性损伤,昼夜节律失衡亦可能是其发病机制之一。另外VILI是全身炎症反应的一部分,或是针对肺组织的特异反应,由多种细胞和因子参与,伴随着多个基因和通路的表达。研究这些基因和通路,对于阐明VILI的发病机理具有重要意义。现已发现了许多这方面的基因,但我们还需要在全基因组的水平上进行检测,以全面研究VILI相关基因的表达。基因芯片（gene chip或DNA microarray）作为一种高通量、高效能的筛选工具,是研究基因表达的有效方法。本研究采用全基因表达谱芯片技术,筛选VILI大鼠差异表达基因,并分析这些基因的功能以及是否与昼夜节律相关基因关联,以进一步探讨VILI发病的分子机制。 材料和方法 1 VILI模型的制备以及昼夜节律变化的探讨 72只SD大鼠,适应性饲养（12h-day/12h-night）2周,将大鼠按照预进行通气处理的四个时间点（1AM,7AM,1PM,7PM）随机分为四个组,每组18只,每个时间点再随机分为三组（FB组n=6、LV组n=6、HV组n=6）:FB组,自由呼吸组,不予机械通气干预;LV组,保护性机械通气组,给予Vt 8ml/Kg,PEEP 0mmHg;HV组,大潮气量通气组,给与Vt 40ml/Kg,PEEP 0mmHg。共维持3h。监测每只大鼠的平均动脉压、心率、血气变化。3h后放血处死大鼠,并留取标本。HE染色观察大鼠肺组织,并运用液相芯片技术检测血浆促肾上腺皮质激素（ACTH）、褪黑素（MT）水平。 2基因芯片技术筛选大鼠VILI差异表达基因 选取1AM、1PM时间段FB组及HV组雄性大鼠,每组大鼠的不同时间段肺组织提取RNA,等量混合,采用Affymetrix公司的Rat Genome 230 2.0 Array,检测大鼠的基因表达谱。在基因芯片结果中,选取Cyp1a1、Npas2、Nr1d1 3个差异基因,并对72只大鼠行RT-PCR,检验表达谱芯片的准确性,并进一步探讨VILI的分子机制。 3统计分析 实验结果以均数±标准差(（x|-）±s)表示。基因芯片统计分析参照Affymetrix文件。其余统计分析应用统计软件SAS 9.1进行统计分析,P<0.05表示差异有统计学意义,P<0.01表示差异有显著统计学意义。定量资料经正态和方差齐性检验后,组间比较采用单因素方差分析（One Way ANOVA）,多因素方差分析,组内两两比较采用Tukey法进行。利用余弦节律函数F（t）=M+A cos（ωt+Φ）构建模型并进行节律分析,P<0.05,说明模型拟合,节律存在且具有统计学意义。Mesor代表余弦模型中的M值,Amplitude代表A值,通过A/M值判定,比值越高,说明节律性越强。 结果 1.动脉血压、心率、MT组间差异无统计学意义,余弦分析无节律性,P>0.05。ACTH组间比较差异具有统计学意义,P<0.01。 2.动脉血气变化,实验前3组大鼠动脉血pH值、PaCO2和PaO2的差异无统计学意义,P>0.05;3h通气处理后,HV组的PaCO2明显降低,P<0.05。 3.肺损伤评分,与FB组、LV组比较,HV组的肺损伤评分具有显著的差异,P<0.01。 4.基因芯片检查差异表达基因:HV组与FB组比较,共同差异基因56个,其中上调43个,下调13个。Il-6、Cox-2、Ccl2基因表达上调。对差异基因进行功能分类有以下几种:a.炎症相关基因,b.代谢相关基因,c.免疫相关基因,d.信号转导相关基因,e.其它如氧化抗氧化基因等。 5. RT-PCR检测Cyp1a1、Npas2、Nr1d1基因,与基因芯片表达趋势相同。相对于FB组及LV组,HV组Nr1d1基因表达显著下降,p<0.05。余弦分析Nr1d1基因在FB组具有节律性,P<0.05,余未见明显节律性。 结论 1.本文成功地建立机械通气肺损伤的大鼠在体模型（VILI）,探讨了机械通气相关性肺损伤的病理生理改变及其可能原因与机制,为后续研究提供依据。 2.血浆ACTH水平在机械通气中存在组间差异,本次实验未见MT、ACTH存在节律性。 3. VILI的分子机制极为复杂,是多基因

关键词： 人工昼夜节律   视网膜   生物钟基因   生物节律   复方中药  

摘要： 本课题采用动物实验的研究方法,探讨在改变了自然昼夜节律的人工光环境下,大鼠视网膜的形态、功能改变与视网膜生物钟基因Cryl的表达,同时观察应用夏桂成老中医阴阳钟调整理论对视网膜光损伤及视网膜钟基因表达的保护与调整作用。 目的通过动物实验的方法探讨人工昼夜节律对SD大鼠视网膜功能、形态以及视网膜生物钟基因Cryl的影响,并观察夏桂成阴阳钟调整理论对视网膜光损伤的保护与生物钟基因的调整作用。 方法健康无眼病的雄性SD大鼠48只,随机分成4组,每组12只。对照组饲养在正常昼夜交替节律的环境中,接受自然光线的照射；实验组分为模型组,和A、B两个中药组,饲养在人工昼夜节律环境下,接受人工光源的循环照射,设定每日的光照时间为：明(早6：00至晚24：00),暗(晚24：00至早6：00),循环交替时间为18h/6h。根据夏桂成阴阳钟调整理论及其所拟补阳、补阴两种复方中药制剂每日灌胃两次,出于对大鼠昼伏夜出生活习性的考虑,中药A组大鼠予以上午10：00补阳方灌胃,夜晚22：00补阴方灌胃；中药B组大鼠予以上午10：00补阴方灌胃,夜晚22：00补阳方灌胃。实验第3月时,对各组大鼠行眼部常规检查、闪光-视网膜电图检查、视网膜HE染色光镜检查、透射电镜观察, Cryl免疫组化,视网膜钟基因Cry1提取。对实验光源日光灯进行光学参数的测定。 结果各组SD大鼠眼部前节组织结构检查未见明显差异。自然昼夜节律对照组大鼠HE染色光镜观察见视网膜各层间分界清晰,内、外核层细胞核排列整齐,有规则,外核层约排列10-12层胞核,内核层约排列4-5层胞核,内丛状层呈网状,比较疏松、比外丛状层厚,神经节细胞核淡染,在神经纤维层内散在分部。人工昼夜节律光环境模型组大鼠HE染色光镜下见视网膜萎缩变薄,结构不清,层数减少,外核层和内核层界限不清,细胞核层数明显减少,核层排列紊乱,核染色深,内丛状层变薄,外丛状层消失,神经纤维层变薄,神经节细胞稀疏。中药A组HE染色光镜下见视网膜层数减少,内、外核层细胞核层数减少,核染色深,与模型组相类似,程度略轻。中药B组大鼠视网膜普遍萎缩变薄,层数减少,外核层和内核层无明显分界,细胞核层数减少,核深染,排列紊乱,内丛状层变薄，外丛状层消失,神经节细胞水肿,稀疏,排列紊乱,神经纤维层可见水肿,变薄。 自然昼夜节律对照组SD大鼠透射电镜下观察见视网膜神经节细胞呈椭圆形,细胞膜完整,细胞核染色质清晰,分布均匀,内质网及线粒体等细胞器形态正常,光感受器外节膜盘排列整齐,内节线粒体嵴连续,呈长圆形。人工昼夜节律光环境模型组透射电镜观察见视网膜神经节细胞胞质内有空泡样改变,内核层及外核层胞质均出现空泡样改变,线粒体肿胀,外节膜盘结构紊乱,板层轻度离散。中药A组透射电镜观察见视网膜神经节细胞椭圆形,形态基本正常,胞质内可见空泡样改变,内核层及外核层胞质内均有空泡样改变,个别线粒体肿胀,外节盘膜结构紊乱,板层结构轻度离散。中药B组见神经节细胞层胞质肿胀,大量空泡样改变,可见有细胞器褪变形成的髓样小体,内核层细胞胞质肿胀,呈大量空泡样,细胞膜破裂,外核层细胞胞质肿胀,大量空泡样改变,细胞排列紊乱,稀少,部分胞膜破坏,线粒体嵴断裂,高度肿胀,外节膜盘组织结构紊乱,板层结构消失,空泡样改变。 自然昼夜节律对照组大鼠闪光-视网膜电图(F-ERG)检查波形为典型视网膜电图波形,各波分化性好。各实验组引出的波形均不典型。人工昼夜节律模型组与自然昼夜节律对照组F-ERG比较,Rod-R的b波潜时延长,Max-R的a,b波振幅下降,潜时延长,Cone-R的a,b波振幅下降,Ops OS值和30Hz Flicker N1-P1振幅均下降,两组比较差异有显著性(P<0.05)。中药A组与对照组大鼠F-ERG比较,Rod-R的b波潜时延长,Max-R的a,b波振幅下降,潜时延长,Cone-R的a,b波振幅下降,Ops OS值和30Hz Flicker N1-P1振幅均下降,两组比较差异有显著性(P<0.05)。中药A组与模型组大鼠F-ERG比较,Max-R的a,b波振幅升高,Cone-R的b波振幅升高,两组比较差异有显著性(P<0.05)。中药B组与模型组大鼠F-ERG比较,Max-R的a波潜时延长,Max-R的b波振幅下降,差异有显著性(P<0.05)。视网膜生物钟基因Cryl免疫组化定位于视网膜神经节细胞层。RT-PCR基因定量检测基因含量,模型组及中药A组含量减少,对与照组比较有显著性差异(P<0.05),中药B组含量亦减少,但与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。自然节律对照组大鼠比较安静,实验组中中药A组大鼠比较安静,其余各组表现为比较惊觉,躁动不安。日光灯频闪大,稳定性差,紫外区的辐射非常明显。 结论日光灯人

关键词： 甘肃鼢鼠   黑视蛋白   基因   昼夜节律  

摘要： 昼夜节律是哺乳动物最常见的一种生物节律,是生物界的各种功能为了适应地球自转的昼夜环境周期性的变化而产生的。生物机体内生物钟,用来协调各种不同组织和器官的昼夜节律。动物昼夜节律起始于对外界光周期的感知。以往认为动物对外界光周期的感知只存在视锥和视杆细胞两条路径,但是近年来对视锥和视杆细胞缺失的小鼠研究发现,还存在黑视蛋白调节路径,即黑视蛋白基因→黑视蛋白(视网膜神经节细胞)→视交叉上核→调节昼夜节律。 黑视蛋白是一种新的维生素A类视蛋白,在哺乳动物中,黑视蛋白主要分布在视网膜神经节细胞中。从发现至今,其生理功能就受到科学家的关注。推测黑视蛋白参与多种生理功能,主要包括昼夜节律的调节、瞳孔对光反应、睡眠及行为。黑视蛋白基因(OPN4)编码合成黑视蛋白,近来研究发现脊椎动物有两种类型的黑视蛋白基因存在,即OPN4m和OPN4x,研究表明可能OPN4x基因在哺乳动物进化过程中由于染色体重组已经过早地消失了。 本文运用常规PCR及测序技术,测定并分析甘肃鼢鼠(Myospalax cansus)黑视蛋白基因,采用腹腔注射N-甲基-N-亚硝基脲的方法使甘肃鼢鼠视锥和视杆层缺失,阻断视锥和视杆细胞光周期感知传递路径,运用行为学方法,初步探讨甘肃鼢鼠黑视蛋白基因在调节昼夜节律上的作用。得到结论如下： 1.甘肃鼢鼠黑视蛋白基因没有因为其生活环境的特殊而消失,在与其他物种相同基因对比研究发现,甘肃鼢鼠黑视蛋白基因及预测的蛋白序列与鼹形鼠的同源性最高。 2.甘肃鼢鼠黑视蛋白基因序列中的外显子与内含子与其他啮齿动物基本相似,但在第一和第二个外显子之间,出现一个23个重复的CT序列微卫星结构。而在其他物种中没有出现。 3.在预测的蛋白序列中,甘肃鼢鼠与鼹形鼠fSpalax ehrenbergi)、小家鼠(Mus musculus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)及黑线毛足鼠(Phodopus sungorus)等啮齿类黑视蛋白氨基酸序列有差异,表现为物种某些氨基酸不同甚至缺失。 4.甘肃鼢鼠是昼夜活动的动物,活动明显具有节律性。表现出夜间活动时间多于白天。休息睡眠时间约占总时间的70%,活动时间约占30%。这说明甘肃鼢鼠具有有功能的生物钟,能对外界光周期做出反应。 5.视锥、视杆缺失甘肃鼢鼠与正常甘肃鼢鼠在休息和睡眠、跑动、筑巢和取食等重要行为活动频次和持续时间上都无显著差异,说明视网膜对外界光周期的感知,不完全依赖于视锥和视杆细胞层,黑视蛋白基因及其编码蛋白作为感光视蛋白调节控制了昼夜节律。 总之,以上结果表明,甘肃鼢鼠黑视蛋白基因没有退化,功能没有丢失,且与鼹形鼠的同源性最高。另外通过行为学方法,观察到视锥、视杆细胞缺失甘肃鼢鼠和正常甘肃鼢鼠在休息和睡眠、跑动、筑巢和取食等重要活动中,都未出现明显的差异,说明甘肃鼢鼠视锥和视杆细胞缺失后,视网膜对外界光周期的感知,不局限在视锥和视杆细胞层,黑视蛋白基因编码蛋白作为感光视蛋白充当感光物质,在昼夜节律通路中发挥重要的作用,但这还需要进一步的研究。

关键词： 家蚕   滞育   生物钟基因   分子进化   信号途径  

摘要： 家蚕（Bombyx mori）是卵滞育性鳞翅目模式昆虫,其滞育卵的活化与滞育发育时间间隔测定酶酯酶A4密切相关。TIME-EA4具备稳定的Cu/Zn SOD活性和只在卵滞育末期出现的生物钟测时功能瞬时酯酶ATPase活性。 昼夜节律是最普遍的生物节律现象,受遗传生物钟基因调控,而家蚕的卵滞育是其对昼夜节律授时因子（温度和光照等）响应的一种现象,这为我们研究家蚕昼夜节律生物钟基因提供了一个很好的参照。为了深入研究家蚕TIME-EA4的分子作用机制,本文首先从蛋白质分子进化角度研究了TIME-EA4双重酶活性的发生机制;同时为了进一步研究TIME-EA4生物测时与昼夜节律生物钟信号途径的关系,本文克隆、分析和初步整合了家蚕昼夜节律生物钟基因反馈环路。 本文首先克隆了17个物种的Time-ea4同源基因Time-likes,从NCBI中获得17-20个物种的Cu/Zn SOD、羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶蛋白序列,通过比对、MOTIFS、进化踪迹、位点扫描、聚类等方法系统的分析了TIME-EA4的分子进化。同时,通过RT-PCR和RACE方法克隆了家蚕昼夜节律生物钟基因Bmcry1与Bmcry2的全长cDNA序列,电子克隆（in silico cloning）了Bmvri,Bmcyc,Bmtim2,Bmpdp完整的ORF序列,以及Bmclk基因的ORF片段。在此基础上,对上述基因及其表达产物进行了结构分析、染色体定位和系统的分子进化分析,最后根据这些基因及其表达产物的结构特征结合现有的数据资源,初步整合了家蚕昼夜节律生物钟反馈环路。结果如下: 1家蚕TIME-EA4起源于Cu/Zn SOD 家蚕TIME-EA4及多物种中其同源蛋白（TIME-likes）都与Cu/Zn SOD的序列相似性较高（33%100%）,属于Cu/Zn SOD超家族,都具有Cu/Zn SOD特征序列（SODCUZN1和SODCUZN2 motifs）。TIME-EA4具有稳定的Cu/Zn SOD活性和Cu/Zn离子结合位点,进化踪迹分析显示TIME-EA4的重要氨基酸残基（coverage < 25%）的91.2%都用来维持与Cu/Zn SOD的序列一致性。在选取的非昆虫物种中,TIME-like就是该物种的Cu/Zn SOD,而在一些昆虫物种中TIME-like是有别于Cu/Zn SOD蛋白。根据进化史,自从有光合生物,就有Cu/ZnSOD的结论,本文仅在昆虫中找到TIME-EA4和TIME-likes,说明TIME-EA4比Cu/Zn SOD出现得晚,因此推测家蚕TIME-EA4起源于Cu/Zn SOD。 2家蚕TIME-EA4是一种新型酯酶 家蚕TIME-EA4最初是通过酯酶分离纯化方法获得的一种酯酶,能够被酯酶特异性染料着色,其N-末端有ATPase结构域,是发挥时间间隔测定功能的位点。TIME-EA4与Cu/Zn SOD的Cu/Zn离子绑定位点在氨基酸残基组成、极性和接触原子等方面存在着差异。TIME-EA4除具有Cu/Zn SOD功能位点外,还具有酯酶的功能位点。家蚕TIME-EA4和野桑蚕（Bombyx mandarina）的TIME-like（Bm-TIME-like）与酯酶进化距离较近,其他4个昆虫物种的TIME-likes与酯酶和非脊椎动物的Cu/Zn SOD聚为一大类。推测TIME-EA4（TIME-likes）是起源于Cu/Zn SOD的新型酯酶,在不同的昆虫物种中,TIME-EA4（TIME-likes）以不同速率向酯酶进化,家蚕由于数千年的人工驯化加速了这一进化过程。 3家蚕具有两类昼夜节律核心钟基因Bmcry1与Bmcry2 通过电子克隆、RT-PCR和RACE技术获得了家蚕Bmcry1与Bmcry2全长cDNA序列,长度分别为2 166 bp和2 389 bp（HM747059和HM747060）,拼接了全基因序列（HM747057和HM747058）。Bmcry1基因具有12个外显子和11个内含子,Bmcry2具有9个外显子,8个内含子。染色体定位表明Bmcry1和Bmcry2分别位于17号和15号染色体。同源建模获得了BmCRY1和BmCRY2蛋白的三维结构,其FAD入口大而深,与CRY不结合嘧啶二聚体相符;BmCRY1和BmCRY2表面多为负电荷,只在FAD入口位置有正电荷富集。多序列比对、蛋白质基序、功能域、聚类分析等结果显示,BmCRY1和BmCRY2分属昆虫CRY1和CRY2,与柞蚕（Antheraea pernyi）等鳞翅目昆虫CRY蛋白亲缘关系最近。家蚕的2类CRY与其他昆虫CRY相似,都具有DNA光解酶和FAD结合功能域,但保守位点和基序位点不同。本实验为进一步研究家蚕

关键词： 高血压   肝阳上亢证   天麻钩藤饮   血压昼夜节律   时钟基因per2、bmal1  

摘要： 防治靶器官损害与降压是高血压病治疗的基本原则,血压昼夜节律异常与高血压靶器官损害和心血管事件发生呈明显的相关关系,是独立于血压水平的重要致病因素。血压昼夜节律的产生和维持与时钟基因的周期性表达有关。时钟基因bmal1、per2是体内生物钟系统运行的关键基因,其表达水平和节律变化直接调节血压的昼夜节律。肝阳上亢证是高血压病各期及不同病程中构成比最高的中医证型。天麻钩藤饮是平肝潜阳治法的代表方剂,对高血压病肝阳上亢证具有确切的治疗作用。尽管在认识高血压中医证候本质和天麻钩藤饮作用机制研究方面已经取得一定进展,但仍存在许多问题：①虽然国际上己将动态血压指标体系(血压水平、血压变异性、血压昼夜节律)作为评价降压药物疗效的基本指标,但国内尚未见有将这一指标体系用于中药复方研究的报道；②仍限于单纯考察药物对某一指标静态水平的考察,缺乏对其调节机体动态平衡作用的研究,未能充分体现中药复方的特点；③机制研究缺乏系统性和深度,对其具体作用靶点和作用机制尚无准确解释。因此本实验从调节高血压所致的时钟基因bmall,、per2的表达节律异常方面来探讨平肝潜阳法代表方剂天麻钩藤饮对高血压病肝阳上亢证的治疗作用及其通过干预AngⅡ-AT1(血管紧张素11-血管紧张素Ⅰ型)受体信号通路的可能作用途径。 实验中,我们复制高血压病肝阳上亢证大鼠模型,通过考察时钟基因bmal1、per2等的表达来阐明天麻钩藤饮调节血压昼夜节律的机制和可能作用途径。 1高血压病肝阳上亢证动物的血压昼夜节律特征及天麻钩藤饮的干预作用 (1)高血压病肝阳上亢证大鼠模型的建立 据病症结合原则,采用双肾一夹加灌附子汤法建立高血压病肝阳上亢证大鼠模型。结果表明此方法模型大鼠存活率为95.83%,成功率为83.41%,可用于本实验的研究。 (2)天麻钩藤饮对模型大鼠血压昼夜节律的调节作用研究 采用无线遥测技术测定24小时动态血压后以血压昼夜节律曲线的特征值(调整中值、振幅、峰值相位)为指标运用ChronoS-Fit程序进行分析评价。结果表明天麻钩藤饮对模型大鼠血压昼夜节律有调节作用。 2天麻钩藤饮对模型大鼠血压节律影响机制的研究 (1)天麻钩藤饮影响模型大鼠血浆血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、儿茶酚胺(CA)含量及昼夜节律的研究 使用Elisa试剂盒检测不同时间点的AngⅡ和CA含量,建立数学模型,以节律特征值为指标评价天麻钩藤饮对模型大鼠血浆AngⅡ和CA的节律调节作用。结果表明天麻钩藤饮调节模型大鼠血浆AngⅡ和CA的节律。 (2)天麻钩藤饮对模型大鼠血管紧张素Ⅰ型受体(AT1)的影响 建立RT-PCR方法考察AT1受体mRNA表达水平。结果表明天麻钩藤饮影响模型大鼠血管紧张素Ⅰ型受体(AT1)的表达。 (3)天麻钩藤饮对模型大鼠per2、bma11 mRNA表达的影响 建立RT-PCR方法考察per2、bma11 mRNA的表达水平,结果表明天麻钩藤饮影响模型大鼠per2、bma11的表达。 3血压昼夜节律与时钟基因的相关性分析 对实验指标运用Chronos-Fit、LabFit程序进行统计分析,表明血压昼夜节律与时钟基因per2、bma11有相关性。

关键词： Clock基因   Bmal1基因   昼夜节律   外周血淋巴细胞   人   南极  

摘要： 人和动物的生理机能、生化代谢、行为表现等常以24 h为周期发生规律性变动,这种变化的节律称为昼夜节律。产生昼夜节律的结构基础是分子计时器—昼夜节律生物钟(circadian clock)。对于主导节律调节的一些重要基因,称之为生物钟基因。机体的各种内在昼夜节律性变化可在外界环境因素的作用下得到重设性调节,以使机体活动与环境变化达成和谐统一。 引发和调控昼夜节律生物钟的分子机制是在钟输入信号(如光照、温度等)的作用下,若干钟基因、钟相关基因和钟控基因及其蛋白产物通过转录—翻译—翻译后事件的相互衔接,组成钟振荡器的自身调控反馈环路,实现钟信号的精确输出。其中作为环路中正向调节成分的核心钟基因Clock和Bmal1,已被证实不但24h节律性表达于中枢钟组织如视交叉上核与松果体,而且也表达于包括血细胞在内的各种外周钟组织。上述基因产物以杂二聚体形式形成正向转录因子,与下游钟基因Per(Period)、Cry(Cryptochromes)或tim (Timeless)启动子区的E-box元件结合,激活一系列基因的转录和翻译,因此,Clock和Bmal1在生物钟的分子振荡机制中被认为起着极其重要的作用。然而,有关人外周血淋巴细胞核心钟基因Clock和Bmal1的昼夜节律性转录在南极大陆特殊环境下有着怎样的表现,至今未明,这正是本文所要探讨的内容。 目的 探讨赴南极前后科考队员外周血淋巴细胞核心钟基因Clock和Bmal1的昼夜节律性表达规律,旨在解析、拓展特殊环境下人类外周免疫钟运行的分子调控机制。 方法 8名健康、男性中国南极科考队员志愿者,年龄24～30岁,平均25岁。赴南极前在昼夜节律模式条件(自然光制,16 h-light : 8 h-dark cycle, LD)下生活1周:室温25±1 oC,起床时间:7:00,睡眠时间(无光照期):23:00～7:00,早餐时间:7:30～8:00,午餐时间:11:30～12:00,晚餐时间:5:30～6:00;睡眠时光照强度<0.1 Lux;受试者自由饮水,无烟酒嗜好,在过去6个月内未做过跨时区旅行和未接受过药物治疗,日常活动和饮食成分基本一致。随后在一昼夜内,随机选择2位受试者,每隔4 h抽取各自外周血6 ml,血样采集在4个不连续的随机昼夜内完成。分离其淋巴细胞,提取总RNA,逆转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR方法,测定不同昼夜时点(zeitgeber time,ZT,共6个,每个时点n=8)每个样品中Clock和Bmal1基因的mRNA表达量,并以熔解曲线和凝胶电泳条带加以验证,通过余弦法和Clock Lab软件获取节律参数,并经振幅F检验分析是否存在昼夜节律性表达。 选取相同8名男性科考队员,赴南极后生活一年,经历了极昼与极夜光照差异、季节与气候差异、气温与气压差异等自然环境变化。其昼夜模式生活条件、采血方式、取样时间、实验检测方法及数据统计学处理同上。 结果 1.科考队员赴南极前外周血淋巴细胞核心钟基因Clock和Bmal1的昼夜表达 1.1在LD(16:8)光制下,科考队员外周血淋巴细胞钟基因Clock和Bmal1的mRNA表达呈现明显的昼夜节律性振荡(振幅F检验,P<0.05); 1.2 Clock基因的峰值相位-335.85±13.80,表达振幅3.46±1.27,中值-11.40±1.59,峰时和谷时分别位于ZT22和ZT10,峰时与谷时mRNA水平分别为-7.95±2.55和-14.85±1.32; 1.3 Bmal1基因的峰值相位-307.12±108.17,表达振幅2.77±1.11 ,中值-5.50±1.32,峰时和谷时分别位于ZT20和ZT8,峰时与谷时mRNA水平分别为-2.74±0.71和-8.25±2.33; 1.4 Clock和Bmal1昼夜节律性转录的比较:两个基因LD(16:8)光制下在所检测的6个昼夜时点中表达水平均有明显差异(P<0.05),Clock基因的表达水平较Bmal1基因降低;从昼夜节律性参数比较看出,两个基因表达的峰值相位、振幅无差异(P>0.05),而Clock基因转录的中值水平以及峰时mRNA水平和谷时mRNA水平均降低(P<0.05),Clock峰时和谷时比Bmal1推后约2小时(P<0.05)。 2.科考队员赴南极后外周血淋巴细胞核心钟基因Clock和Bmal1的昼夜表达 2.1八名科考队员中分别有2人钟基因Clock、3人Bmal1的转录表达具有明显的昼夜节律性(振幅F检验,P<0.05); 2.2二人Clock基因的峰值相位-42.28±5.27,表达振幅0.79±0.29,中值-9.02±0.24,峰时和谷时分别位于ZT3和Z

关键词： Clock   Bmal1   昼夜节律   外周血淋巴细胞  

摘要： 探讨自然光制下正常成年人外周血淋巴细胞钟基因Clock和Bmal1的昼夜节律性表达。用实时定量RT-PCR方法,测定不同昼夜时点(ZT)受试者外周血淋巴细胞总RNA中核心钟基因Clock和Bmal1的mRNA表达量,通过余弦法和Clock Lab软件获取节律参数,并经振幅检验分析是否存在昼夜节律。结果发现正常成年人外周血淋巴细胞钟基因Clock和Bmal1的mRNA表达呈昼夜节律性振荡(P<0.05),Clock的峰时和谷时分别位于ZT13和ZT1,Bmal1的峰时和谷时分别位于ZT12和ZT24;两个基因在所检测的各个昼夜时点中表达水平均有明显差异(P<0.05),Bmal1的表达水平较Clock降低;二者表达的峰值相位、振幅、峰时和谷时相一致(P>0.05),但Bmal1转录的中值水平以及峰时mRNA水平和谷时mRNA水平降低(P<0.05)。提示正常成年人外周血淋巴细胞钟基因Clock和Bmal1的表达存在同步化的昼夜节律性转录特征。

关键词： ACE2   基因多态性   高血压  

摘要： 目的:研究血管紧张素转换酶2(ACE2)基因多态性与高血压患者血压昼夜节律变化的关系。方法:选择符合入选标准的高血压患者336例,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法,进行ACE2基因分型。根据血压昼夜节律变化,将高血压患者分为勺型与非勺型两组。分析基因型是否为非勺型血压的危险因素。结果:男性勺型组与非勺型组ACE2基因型多态性的分布存在显著差异,勺型组以G等位基因携带者为主。结论:ACE2基因多态性与男性高血压患者血压昼夜节律相关,携带G等位基因的患者可能更易发生夜间血压升高。

关键词： 择时运动   荧光定量RT-PCR   PerlmRNA   Per2mRNA  

摘要： 目的研究择时运动调节昼夜节律的分子生物学机制。方法金黄地鼠在昼夜节律时相点CT6做力竭运动,2h后采用荧光定量RT-PCR技术,对(CT6)择时运动引起金黄地鼠自发性活动超前间脑中Per1mRNA(mPer1)、Per2mRNA(mPer2)表达水平进行测定。结果在CT6择时运动,金黄地鼠间脑中的mPer1、mPer2基因表达显著性降低。结论在CT6时相点力竭运动引起动物相位超前的分子生物学机制,可能是通过降低间脑细胞内昼夜节律基因转录-翻译负反馈调节环路实现的。