关键词： 同病异证   肝癌   下丘脑   垂体   肾上腺   昼夜节律   小鼠  

摘要： 目的揭示同病异证H22肝癌小鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)昼夜节律通路基因的表达特征。方法采用小鼠计量化四诊和辨证方法筛选获得正常小鼠、早期邪毒壅盛证和气虚证肝癌小鼠,处死取其下丘脑、垂体和肾上腺。以GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array等技术检测各组织的基因表达谱。重点分析3组织各自芯片中昼夜节律通路基因的表达特征。结果肝癌发生后,同病异证肝癌小鼠昼夜节律通路基因在①下丘脑不同程度的表达下降,且以邪毒证为甚。其中气虚证的隐铬1(光解酶样)(Cry1)、阶段基因同源物1(果蝇)(Per1)、阶段基因同源物2(果蝇)(Per2)和核受体亚家族1/组D/成员1(Nr1d1)的表达明显高于邪毒组。②垂体的表达有高有低,但在两证候中表达高低趋势一致,表达下降基因中只有邪毒组的昼夜节律运动输出周期故障(Clock)基因下调明显,而表达升高基因中除气虚证的Per1外,其他均上调明显,且邪毒高于气虚。其中气虚组的Per1和Per2表达明显低于邪毒组。③肾上腺中的表达也有高有低,其中核心基因Clock和芳烃受体核转位因子样(Arntl)均明显下调(除邪毒证的Amtl),且以气虚证为甚。而其他基因的表达与本证候Clock和Arntl基因的表达趋势,以及其在两证候间的表达趋势均显示较差的一致性。其中气虚组的Clock和Per1明显低于邪毒组,而其Nr1d1明显高于邪毒组。以上Per1基因为HPA轴共有的证候特征性基因。结论肝癌小鼠HPA轴的昼夜节律均不同程度受到影响,各组织的变化不仅与疾病本身有关,还具有明显的证候差异,其中Per1可能是HPA轴昼夜节律出现证候差异的关键基因。

关键词： 动脉粥样硬化   冠心康   ApoE基因敲小鼠   时钟基因   Bmal1   Per2  

摘要： 目的:观察中药复方制剂冠心康对Apo E基因敲除动脉粥样硬化小鼠血管壁保护及斑块的稳定作用及心脏时钟基因的调节,探讨中药干预高脂血症、动脉粥样硬化,防止心血管疾病发生的可能机制。方法:在12 h光照/黑暗条件下,54只Apo E-/-小鼠西方膳食饲料饲养至12周龄并随机分为3组,模型组、冠心康组以及辛伐他汀组,每组18只。另18只C57BL/6/J小鼠直接分至正常组。正常组及模型组每日给予生理盐水灌胃,辛伐他汀以及冠心康组每日分别予以相应药物灌胃。观察至19周龄取材。设定昼夜时点(Zeitgeber time,ZT),并根据ZT于ZT0、ZT4、ZT8、ZT12、ZT16与ZT20依次取材;采用HE染色法观察载脂蛋白E基因敲除动脉粥样硬化小鼠主动脉壁损伤情况;运用RT-PCR检测技术,检测载脂蛋白E基因敲除动脉粥样硬化小鼠心脏时钟基因Bmal1、Per2 mRNA表达水平。结果:病理研究结果提示冠心康具有一定的抗动脉粥样硬化作用。ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠心脏时钟基因昼夜表达节律与正常组比较,显著改变,提示Bmal1、Per2存在昼夜表达异常;冠心康可显著调节Bmal1及Per2基因表达昼夜节律。其中与模型组相比,冠心康组小鼠心脏Per2基因在早上8点、下午16点以及午夜0点表达含量有显著差异,P<0.05。其中在下午16点表达显著升高,而在上午8点及午夜0点表达显著降低。与模型组相比,冠心康组小鼠心脏Bmal1基因在早上8点及午夜0点表达含量均显著升高,P<0.05,其基因表达水平与正常组较为相似。结论:冠心康对ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠存在抗动脉粥样硬化的作用;冠心康对ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠心脏时钟基因Bmal1、Per2基因表达节律存在干预作用,可能是中药干预动脉粥样硬化的分子机制之一。

关键词： PER1基因   昼夜节律   鳞状细胞   癌  

摘要： 目的探讨生物钟PER1基因在口腔鳞癌中的昼夜节律变化情况和与肿瘤体内生长的关系。方法 60只裸鼠置于12 h光照和12 h黑暗交替环境中饲养3周后,将人颊鳞癌BcaCD885细胞接种于裸鼠颊部,建立口腔颊鳞癌模型。3周成瘤后,在24 h内按灯亮后4、10、16、22 h(4 HALO、10 HALO、16 HALO、22 HALO)的4个时间点分别处死15只裸鼠,取出肿瘤,称量,常规切片在HE染色下计算各时间点肿瘤的有丝分裂指数(MI);分别用S-P免疫组化、Western blot和Real-time RT-PCR检测各时间点癌细胞中PER1蛋白和mRNA的表达;分别用方差分析和余弦分析检验各指标在4个时间点的差异性和是否具有昼夜节律性。结果颊鳞癌细胞PER1蛋白、PER1 mRNA、肿瘤MI和肿瘤质量在昼夜不同时间点具有显著性差异(P<0.01),其变化波动具有昼夜节律性特征(P<0.05);肿瘤MI和肿瘤质量与PER1的表达水平呈反比关系,PER1 mRNA表达的峰值与肿瘤MI和质量的谷值均位于活动相的中期,而PER1 mRNA表达的谷值与肿瘤MI和质量的峰值均位于休息相中期。结论口腔鳞癌中PER1的表达、肿瘤MI和质量在昼夜不同时间点的波动具有24 h昼夜节律性规律,PER1在口腔鳞癌中为抑癌基因。

关键词： 细胞色素P450   CYP1A1   昼夜节律   性别特性   基因表达  

摘要： 目的探究昆明种小鼠细胞色素氧化酶1A1(CYP1A1)的昼夜节律、性别差异以及对肝毒物毒性变化的影响。方法昆明小鼠在环境控制的SPF饲养室内适应性饲养2周后,于06:00,10:00,14:00,18:00,22:00和次日02:00处死取肝,用逆转录PCR方法检测24h内核激素孤儿受体α(Rev-erbα),时钟基因(Per)1,Per2和CYP1A1,CYP1A2及其调控核受体基因AhR的表达。另取小鼠于6:00和18:00 ip给予对乙酰氨基酚500mg·kg-1,12h后检测血清中丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)活性。结果细胞色素氧化酶基因CYP1A1,CYP1A2及其调节基因AhR在18:00左右表达最高,且雌鼠的表达高于雄鼠,在6:00左右表达最低,表达峰谷差为4～7倍,其节律变化的差异与Rev-erbα,Per1,Per2的节律差异大致相符。与此节律相对应,对乙酰氨基酚引起的肝毒性在18:00给药高于6:00给药。结论昆明种小鼠细胞色素氧化酶CYP1A1基因表达存在昼夜节律及性别差异,该差异可影响肝毒物如对乙酰氨基酚的代谢和毒性。

关键词： PER1基因   昼夜节律   鳞状细胞   癌   口腔  

摘要： 目的:探讨生物钟PER1基因在口腔鳞癌中的昼夜节律变化情况和与肿瘤体内生长的关系。 方法:60只裸鼠置于12h光照和12h黑暗交替环境中饲养3周后,将人颊鳞癌BcaCD885细胞接种于裸鼠颊部，建立口腔颊鳞癌模型。3周成瘤后，在24h内按灯亮后（Hours after light onset，HALO）4、10、16、22h （即4HALO、10HALO、16HALO、22HALO）的4个时间点分别处死15只裸鼠，取出肿瘤，称重，常规切片，在HE染色下计算各时间点肿瘤细胞的有丝分裂指数(MI)；分别用SP免疫组化、Western blot和Real-time RT-PCR检测各时间点癌细胞中PER1蛋白和mRNA的表达；分别用方差分析和余弦分析检验各指标在4个时间点的差异性及是否具有昼夜节律性。 结果:颊鳞癌细胞PER1蛋白、PER1mRNA、肿瘤MI和肿瘤重量在昼夜不同时间点具有显著性差异（P<0.01），其变化波动具有昼夜节律性特征（P<0.05）；肿瘤MI和肿瘤重量与PER1的表达水平呈反比关系，PER1mRNA表达的峰值与肿瘤MI和重量的谷值均位于活动相的中期，而PER1mRNA表达的谷值与肿瘤MI和重量的峰值均位于休息相中期。 结论:口腔鳞癌中PER1的表达、肿瘤MI和重量在昼夜不同时间点的波动具有24h昼夜节律性，PER1在口腔鳞癌中可能为重要的抑癌基因。

关键词： 欧洲杨树   生物钟   昼夜周期   DNA甲基化   MSAP  

摘要： 生物钟是生物体内一种复杂的计时机制。生物钟使生物体遗传、生理和代谢等过程产生昼夜的节律变化。生物钟影响植物生长发育的多个方面，包括光合作用、茎生长、气味散发、营养生长向生殖生长的过渡、休眠以及其它的季节性过程，同时生物钟也参与调控其它信号途径。研究表明，高等植物生物钟调控由多个相互关联的转录反馈环路组成，并与转录后修饰以及组蛋白修饰有关。杨树（Populus L.）不仅是重要经济和生态速生树种，也是林木基因工程的模式树种。本研究以一年生欧洲黑杨无性系N46（P. nigraN46）为材料，采用基于毛细管电泳的MSAP（Amplified fragment length polymorphism）技术，检测昼夜周期变化过程中杨树基因组CCGG位点甲基化状况，确定杨树生物钟是否受到DNA甲基化调控，以探讨生物钟调控的表观遗传学机制。主要研究结果如下： 1.优化了杨树MSAP选择性扩增体系。采用正交试验设计的方法筛选出了杨树毛细管电泳MSAP技术选择性扩增体系，其中各组分最佳浓度分别为dNTP0.5mM、选择性扩增引物0.075μM、exTaq0.625U/μL、Mg2+1.5mM和DNA22.5ng/μL。 2.揭示了欧洲黑杨叶片基因组DNA甲基化模式。采用从72对引物中筛选出的26对选择性扩增引物，对欧洲黑杨叶片基因组DNA进行了MSAP分析，总共检测了2065个CCGG位点，发现55.51%的位点发生甲基化，其中全甲基化位点占44.89%，半甲基化位点占4.65%，即欧洲黑杨叶片基因组CCGG位点全甲基化的比率远高于半甲基化比率。 3.通过检测欧洲黑杨无性系在36小时内昼夜周期变化中9个时间点2065个CCGG位点甲基化修饰模式，仅在遮光处理12时发现2个位点发生了甲基化变化，并在第16时重新恢复。因此杨树基因组CCGG位点甲基化修饰不具有明显生物钟震荡的特点。本研究表明尽管表观遗传修饰在植物生物钟调控过程中起重要作用，但基因组DNA甲基化并不是调控欧洲黑杨生物钟基因及其下游调控基因的震荡周期性表达的主要因素。

关键词： 家蚕BmN细胞   生物钟   节律基因   RNAi  

摘要： 生物钟是昆虫生命周期中的重要的调控机制，对昆虫的各种行为活动，激素代谢都有重要的调节作用。生物钟普遍存在于生物界从人类到蓝藻的各种物种，从生物体到组织、细胞的各种生物层次。体外培养细胞和组织虽然脱离了生物体中枢神经的调控，也具备信号接收器、节律振荡系统和输出系统三大生物钟原件。 家蚕中生物钟的研究主要集中在个体水平，研究内容此前主要是探讨滞育与生物钟的关联。本文利用家蚕细胞培养系BmN，运用qPCR、Western blotting、免疫细胞化学、RNAi等技术手段，研究了生物钟调控网络中Cry1、Cry2、Per、Tim、Clk和Cyc基因在光制和温度振荡变化下的表达特征。结果如下： 1.家蚕BmN细胞中存在着内源的生物钟系统 家蚕BmN细胞中生物钟基因Cry1、Cry2、Per、Tim、Clk和Cyc的表达能够响应光照和温度刺激，对光制和温度振荡也产生了节律响应，多克隆抗体检测出BmN细胞中CRY1、CRY2、PER和TIM蛋白质的存在及光照对CRY1、CRY2、PER、TIM蛋白质的表达影响。表明家蚕BmN细胞中存在内源生物钟系统，可以将家蚕BmN作为研究家蚕生物钟作用机制的模型。 2.温度对光照恒定时的家蚕BmN生物钟有补偿作用 在25℃恒明（25LL）环境中，BmN细胞中Cry1、Cry2、Per、Tim、Clk和Cyc基因的表达量降低，振荡节律减弱甚至消失；在此条件下，温度发生振荡（20：30LL）后， Cry1、Cry2、Per、Tim、Clk和Cyc基因的表达量上升，恢复了节律振荡。表明家蚕BmN细胞生物钟信号输入途径对温度授时因子具有响应，并且对恒明条件下家蚕BmN细胞的生物钟系统起一定的补偿作用。 3. BmN细胞中的Cry1和Cry2基因对光信号和温度信号的响应存在差异 Cry1基因的表达在光照刺激后出现显著的上调变化。不同光节律下，Cry1和Cry2对光照变化都十分敏感，但Cry1的表达量显著高于Cry2（P<0.05）；在光照黑暗交替的瞬间，Cry1表达量下调，而Cry2没有明显变化。推测Cry1在家蚕BmN细胞光节律调控的核心振荡器中对光节律作出响应，即具有光信号受体作用的可能。温度刺激使Cry2基因的表达表现出极显著变化；温度振荡节律下，Cry1的振荡节律紊乱，而Cry2的振荡节律表现出对温度变化及时的响应以及很强的规律性。推测Cry2是温度节律调控的振荡器中的信号接受因子。 4. Per基因在家蚕生物钟环路中的作用可能比Cry1基因更大 本实验室早期对PER蛋白结构的生物信息学分析显示，家蚕PER蛋白与TIM一样，具有蛋白质信号传导互作基序位点，家蚕PER是以蛋白质形式在生物钟环路中发挥信息传递作用。本实验室早期在个体水平和本文在细胞水平对Cry1的实验结果都提示，家蚕CRY1是作为光信号受体发挥作用。本文进一步干涉Cry1和Per中的任意一个基因，结果发现另一个基因的表达都会受到显著影响。干涉Cry1基因，只有Per和Cyc的表达量发生了变化；而干涉Per后，几乎所有调查基因都发生了显著变化，基因表达的振荡相位也发生改变，振荡节律也变弱。推测Per基因比Cry1基因发挥的作用更大，家蚕BmN细胞中可能存在Cry1基因补偿作用基因，共同承担光信号受体作用。

关键词： 原发性高血压   血压变异性   血压昼夜节律   颈动脉粥样硬化  

摘要： 目的本研究旨在探讨原发性高血压患者血压变异性、血压昼夜节律与颈动脉粥样硬化的关系。 方法选取原发性高血压患者84例,其中男性患者47例,女性患者37例;年龄40-86岁,平均年龄（71.68±10.31）岁；应用彩色多普勒超声仪测量所有入选患者颈动脉内-中膜厚度（IMT），并根据检测结果分为硬化组（n=38例）和非硬化组（n=46例）；同时对所有患者行24h动态血压监测，记录24h、白昼、夜间平均血压均值（收缩压、舒张压、脉压均值）以及各时段对应的血压标准差（收缩压标准差及舒张压标准差），根据动态血压监测结果分为勺型组（n=47例）和非勺型组（n=37例）。所有入选患者经询问病史、体检、测定血糖、血脂等生化指标后进行比较。 结果 1.硬化组与非硬化组临床及生化指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 2.硬化组24hSBP、dSBP、nSBP及24hPP、dPP、 nPP均明显高于非硬化组，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；而两组间24hDBP、dDBP、nDBP差异无统计学意义（P＞0.05）。 3.硬化组各时段的血压变异性（BPV）及颈动脉内中膜厚度（IMT）均明显高于非硬化组，差异有显著性统计学意义（P＜0.01）。 4. IMT与BPV的相关分析显示，IMT与24hSSD、24hDSD、dSSD、dDSD、nSSD及nDSD均呈正相关（P<0．05或P<0．01）。 5.与非硬化组比较，硬化组非勺型血压检出率（57.9％）较非硬化组（32.6％）增加（χ2=5.40, p<0.05）。 6.根据动态血压检测结果分组，非勺型组与勺型组临床及生化指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 7.非勺型组与勺型组24hSBP、24hDBP、24hPP及dSBP、dhSBP、dPP比较差异无统计学意义，而非杓型组nSBP、nDBP、nPP较杓型组升高（P<0.05）； 8.非勺型组的颈动脉内中膜厚度（IMT）及颈动脉粥样硬化检出率也均明显高于勺型组，差异有统计学意义（P<0.01）。 结论 1.高血压患者血压变异性及血压昼夜节律与颈动脉粥样硬化形成有关。 2.血压变异性及血压昼夜节律在一定程度上可以作为反映靶器官损害及预测心血管事件的发生的一项重要指标。

关键词： 天麻钩藤饮   昼夜节律   A7r5细胞   时钟基因   Src、P-Src蛋白  

摘要： 天麻钩藤饮具有平肝熄风、清热活血、补益肝肾之功效,临床用来治疗高血压病证的经典代表方剂。近年来应用天麻钩藤饮治疗高血压病已有大量的文献报道,本实验前期研究将天麻钩藤饮作用于高血压模型大鼠,采用遥测技术检测大鼠昼夜血压变化,同时检测大鼠主动脉中各时间点时钟基因的表达,结果显示天麻钩藤饮对高血压大鼠的血压昼夜节律有调节作用,并且能够改善大鼠的血压节律,但对于其具体的作用机制和作用靶点尚不明确。本文通过考察天麻钩藤饮及其有效成分对离体培养的胸主动脉血管平滑肌细胞(A7r5细胞)中时钟基因表达和AngⅡ-AT1下游通路蛋白的的干预作用,结合前期研究,阐明天麻钩藤饮及其有效成分调节血压昼夜节律的可能作用机制和作用靶点。实验中,通过天麻钩藤饮及其有效成分作用于AngⅡ诱导的和受体抑制剂处理A7r5细胞,考察Bmal、Clock和Per2时钟基mRNA昼夜节律性表达,阐明天麻钩藤饮及其有效成分调节时钟基因昼夜节律表达的可能作用机制和作用靶点。1天麻钩藤饮及其有效成分调节时钟基因昼夜节律表达作用通路的研究(1)天麻钩藤饮及有效成分对时钟基因mRNA昼夜节律表达的影响通过天麻钩藤饮及其有效成分作用于AngⅡ诱导的A7r5细胞,采用RT-PCR方法考察时钟基因表达变化,结果显示天麻钩藤饮及其有效成分均能使Bmall、Clock和Per2基因mRNA表达发生变化,呈现出类似正常组细胞的昼高夜低节律性变化。(2)天麻钩藤饮有效成分对经AT1受体抑制剂处理后的A7r5细胞时钟基因昼夜节律表达的影响应用AT1受体阻断剂后,异钩藤碱处理后的A7r5细胞中Bmal1、Clock和Per2时钟基因表达降低。结果表明异钩藤碱通过干预AT1受体,调节Bmal1基因节律振荡,引起细胞昼夜节律改变。(3)天麻钩藤饮及其有效成分对AT1受体mRNA表达昼夜节律的影响通过天麻钩藤饮及其有效成分作用后的AngⅡ诱导的A7r5细胞,,呈现类似时钟基因表达的昼夜节律性变化。结果显示天麻钩藤饮及有效成分对时钟基因的调节作用可能是通过干预AngⅡ-AT1受体通路实现的。2天麻钩藤饮及其有效成分调节时钟基因昼夜节律表达作用靶点的研究(1)天麻钩藤饮对AngⅡ诱导的A7r5细胞Src蛋白表达及其磷酸化的干预作用通过天麻钩藤饮及有效作用于AngⅡ诱导的A7r5细胞,采用Western-Blot方法考察细胞中的Src及其磷酸化蛋白表达变化。结果显示天麻钩藤饮及其有效成分通过降低Src及其磷酸化的蛋白表达,调节细胞时钟基因昼夜节律变化。(2)异钩藤碱对抑制剂处理的经AngⅡ诱导的A7r5细胞Src蛋白表达及其磷酸化的干预作用通过异钩藤碱调节酪氨酸激酶抑制剂处理后的A7r5细胞,结果显示Src磷酸化蛋白表达较降低,Src磷酸化产物作为AngⅡ-AT1通路下游靶点,Src蛋白可能参与调节时钟基因昼夜节律的作用靶点。

关键词： 内源性昼夜节律   精神障碍   基因   睡眠-觉醒周期   昼夜节律生物钟   觉醒周期紊乱   外部环境   生理机能  

摘要： 内源性昼夜节律系统使机体的各种生理机能及其与外部环境之间相互协调,即包括感觉信息与环境时间、机体生理和心理状态的整合作用。当这种整合功能的协调性遭到破坏时,可发生精神障碍、情绪紊乱、睡眠-觉醒周期紊乱、激素水平及分泌高峰时间的变化。本文对昼夜节律生物钟的分子机制、昼夜节律钟基因在睡眠-觉醒周期障碍中的作用及其与精神障碍的关系作一综述。