关键词： 家蚕BmN细胞   生物钟   节律基因   RNAi  

摘要： 生物钟是昆虫生命周期中的重要的调控机制，对昆虫的各种行为活动，激素代谢都有重要的调节作用。生物钟普遍存在于生物界从人类到蓝藻的各种物种，从生物体到组织、细胞的各种生物层次。体外培养细胞和组织虽然脱离了生物体中枢神经的调控，也具备信号接收器、节律振荡系统和输出系统三大生物钟原件。 家蚕中生物钟的研究主要集中在个体水平，研究内容此前主要是探讨滞育与生物钟的关联。本文利用家蚕细胞培养系BmN，运用qPCR、Western blotting、免疫细胞化学、RNAi等技术手段，研究了生物钟调控网络中Cry1、Cry2、Per、Tim、Clk和Cyc基因在光制和温度振荡变化下的表达特征。结果如下： 1.家蚕BmN细胞中存在着内源的生物钟系统 家蚕BmN细胞中生物钟基因Cry1、Cry2、Per、Tim、Clk和Cyc的表达能够响应光照和温度刺激，对光制和温度振荡也产生了节律响应，多克隆抗体检测出BmN细胞中CRY1、CRY2、PER和TIM蛋白质的存在及光照对CRY1、CRY2、PER、TIM蛋白质的表达影响。表明家蚕BmN细胞中存在内源生物钟系统，可以将家蚕BmN作为研究家蚕生物钟作用机制的模型。 2.温度对光照恒定时的家蚕BmN生物钟有补偿作用 在25℃恒明（25LL）环境中，BmN细胞中Cry1、Cry2、Per、Tim、Clk和Cyc基因的表达量降低，振荡节律减弱甚至消失；在此条件下，温度发生振荡（20：30LL）后， Cry1、Cry2、Per、Tim、Clk和Cyc基因的表达量上升，恢复了节律振荡。表明家蚕BmN细胞生物钟信号输入途径对温度授时因子具有响应，并且对恒明条件下家蚕BmN细胞的生物钟系统起一定的补偿作用。 3. BmN细胞中的Cry1和Cry2基因对光信号和温度信号的响应存在差异 Cry1基因的表达在光照刺激后出现显著的上调变化。不同光节律下，Cry1和Cry2对光照变化都十分敏感，但Cry1的表达量显著高于Cry2（P<0.05）；在光照黑暗交替的瞬间，Cry1表达量下调，而Cry2没有明显变化。推测Cry1在家蚕BmN细胞光节律调控的核心振荡器中对光节律作出响应，即具有光信号受体作用的可能。温度刺激使Cry2基因的表达表现出极显著变化；温度振荡节律下，Cry1的振荡节律紊乱，而Cry2的振荡节律表现出对温度变化及时的响应以及很强的规律性。推测Cry2是温度节律调控的振荡器中的信号接受因子。 4. Per基因在家蚕生物钟环路中的作用可能比Cry1基因更大 本实验室早期对PER蛋白结构的生物信息学分析显示，家蚕PER蛋白与TIM一样，具有蛋白质信号传导互作基序位点，家蚕PER是以蛋白质形式在生物钟环路中发挥信息传递作用。本实验室早期在个体水平和本文在细胞水平对Cry1的实验结果都提示，家蚕CRY1是作为光信号受体发挥作用。本文进一步干涉Cry1和Per中的任意一个基因，结果发现另一个基因的表达都会受到显著影响。干涉Cry1基因，只有Per和Cyc的表达量发生了变化；而干涉Per后，几乎所有调查基因都发生了显著变化，基因表达的振荡相位也发生改变，振荡节律也变弱。推测Per基因比Cry1基因发挥的作用更大，家蚕BmN细胞中可能存在Cry1基因补偿作用基因，共同承担光信号受体作用。

关键词： PER1基因   昼夜节律   鳞状细胞   癌   口腔  

摘要： 目的:探讨生物钟PER1基因在口腔鳞癌中的昼夜节律变化情况和与肿瘤体内生长的关系。 方法:60只裸鼠置于12h光照和12h黑暗交替环境中饲养3周后,将人颊鳞癌BcaCD885细胞接种于裸鼠颊部，建立口腔颊鳞癌模型。3周成瘤后，在24h内按灯亮后（Hours after light onset，HALO）4、10、16、22h （即4HALO、10HALO、16HALO、22HALO）的4个时间点分别处死15只裸鼠，取出肿瘤，称重，常规切片，在HE染色下计算各时间点肿瘤细胞的有丝分裂指数(MI)；分别用SP免疫组化、Western blot和Real-time RT-PCR检测各时间点癌细胞中PER1蛋白和mRNA的表达；分别用方差分析和余弦分析检验各指标在4个时间点的差异性及是否具有昼夜节律性。 结果:颊鳞癌细胞PER1蛋白、PER1mRNA、肿瘤MI和肿瘤重量在昼夜不同时间点具有显著性差异（P<0.01），其变化波动具有昼夜节律性特征（P<0.05）；肿瘤MI和肿瘤重量与PER1的表达水平呈反比关系，PER1mRNA表达的峰值与肿瘤MI和重量的谷值均位于活动相的中期，而PER1mRNA表达的谷值与肿瘤MI和重量的峰值均位于休息相中期。 结论:口腔鳞癌中PER1的表达、肿瘤MI和重量在昼夜不同时间点的波动具有24h昼夜节律性，PER1在口腔鳞癌中可能为重要的抑癌基因。

关键词： 欧洲杨树   生物钟   昼夜周期   DNA甲基化   MSAP  

摘要： 生物钟是生物体内一种复杂的计时机制。生物钟使生物体遗传、生理和代谢等过程产生昼夜的节律变化。生物钟影响植物生长发育的多个方面，包括光合作用、茎生长、气味散发、营养生长向生殖生长的过渡、休眠以及其它的季节性过程，同时生物钟也参与调控其它信号途径。研究表明，高等植物生物钟调控由多个相互关联的转录反馈环路组成，并与转录后修饰以及组蛋白修饰有关。杨树（Populus L.）不仅是重要经济和生态速生树种，也是林木基因工程的模式树种。本研究以一年生欧洲黑杨无性系N46（P. nigraN46）为材料，采用基于毛细管电泳的MSAP（Amplified fragment length polymorphism）技术，检测昼夜周期变化过程中杨树基因组CCGG位点甲基化状况，确定杨树生物钟是否受到DNA甲基化调控，以探讨生物钟调控的表观遗传学机制。主要研究结果如下： 1.优化了杨树MSAP选择性扩增体系。采用正交试验设计的方法筛选出了杨树毛细管电泳MSAP技术选择性扩增体系，其中各组分最佳浓度分别为dNTP0.5mM、选择性扩增引物0.075μM、exTaq0.625U/μL、Mg2+1.5mM和DNA22.5ng/μL。 2.揭示了欧洲黑杨叶片基因组DNA甲基化模式。采用从72对引物中筛选出的26对选择性扩增引物，对欧洲黑杨叶片基因组DNA进行了MSAP分析，总共检测了2065个CCGG位点，发现55.51%的位点发生甲基化，其中全甲基化位点占44.89%，半甲基化位点占4.65%，即欧洲黑杨叶片基因组CCGG位点全甲基化的比率远高于半甲基化比率。 3.通过检测欧洲黑杨无性系在36小时内昼夜周期变化中9个时间点2065个CCGG位点甲基化修饰模式，仅在遮光处理12时发现2个位点发生了甲基化变化，并在第16时重新恢复。因此杨树基因组CCGG位点甲基化修饰不具有明显生物钟震荡的特点。本研究表明尽管表观遗传修饰在植物生物钟调控过程中起重要作用，但基因组DNA甲基化并不是调控欧洲黑杨生物钟基因及其下游调控基因的震荡周期性表达的主要因素。

关键词： 天麻钩藤饮   昼夜节律   A7r5细胞   时钟基因   Src、P-Src蛋白  

摘要： 天麻钩藤饮具有平肝熄风、清热活血、补益肝肾之功效,临床用来治疗高血压病证的经典代表方剂。近年来应用天麻钩藤饮治疗高血压病已有大量的文献报道,本实验前期研究将天麻钩藤饮作用于高血压模型大鼠,采用遥测技术检测大鼠昼夜血压变化,同时检测大鼠主动脉中各时间点时钟基因的表达,结果显示天麻钩藤饮对高血压大鼠的血压昼夜节律有调节作用,并且能够改善大鼠的血压节律,但对于其具体的作用机制和作用靶点尚不明确。本文通过考察天麻钩藤饮及其有效成分对离体培养的胸主动脉血管平滑肌细胞(A7r5细胞)中时钟基因表达和AngⅡ-AT1下游通路蛋白的的干预作用,结合前期研究,阐明天麻钩藤饮及其有效成分调节血压昼夜节律的可能作用机制和作用靶点。实验中,通过天麻钩藤饮及其有效成分作用于AngⅡ诱导的和受体抑制剂处理A7r5细胞,考察Bmal、Clock和Per2时钟基mRNA昼夜节律性表达,阐明天麻钩藤饮及其有效成分调节时钟基因昼夜节律表达的可能作用机制和作用靶点。1天麻钩藤饮及其有效成分调节时钟基因昼夜节律表达作用通路的研究(1)天麻钩藤饮及有效成分对时钟基因mRNA昼夜节律表达的影响通过天麻钩藤饮及其有效成分作用于AngⅡ诱导的A7r5细胞,采用RT-PCR方法考察时钟基因表达变化,结果显示天麻钩藤饮及其有效成分均能使Bmall、Clock和Per2基因mRNA表达发生变化,呈现出类似正常组细胞的昼高夜低节律性变化。(2)天麻钩藤饮有效成分对经AT1受体抑制剂处理后的A7r5细胞时钟基因昼夜节律表达的影响应用AT1受体阻断剂后,异钩藤碱处理后的A7r5细胞中Bmal1、Clock和Per2时钟基因表达降低。结果表明异钩藤碱通过干预AT1受体,调节Bmal1基因节律振荡,引起细胞昼夜节律改变。(3)天麻钩藤饮及其有效成分对AT1受体mRNA表达昼夜节律的影响通过天麻钩藤饮及其有效成分作用后的AngⅡ诱导的A7r5细胞,,呈现类似时钟基因表达的昼夜节律性变化。结果显示天麻钩藤饮及有效成分对时钟基因的调节作用可能是通过干预AngⅡ-AT1受体通路实现的。2天麻钩藤饮及其有效成分调节时钟基因昼夜节律表达作用靶点的研究(1)天麻钩藤饮对AngⅡ诱导的A7r5细胞Src蛋白表达及其磷酸化的干预作用通过天麻钩藤饮及有效作用于AngⅡ诱导的A7r5细胞,采用Western-Blot方法考察细胞中的Src及其磷酸化蛋白表达变化。结果显示天麻钩藤饮及其有效成分通过降低Src及其磷酸化的蛋白表达,调节细胞时钟基因昼夜节律变化。(2)异钩藤碱对抑制剂处理的经AngⅡ诱导的A7r5细胞Src蛋白表达及其磷酸化的干预作用通过异钩藤碱调节酪氨酸激酶抑制剂处理后的A7r5细胞,结果显示Src磷酸化蛋白表达较降低,Src磷酸化产物作为AngⅡ-AT1通路下游靶点,Src蛋白可能参与调节时钟基因昼夜节律的作用靶点。

关键词： 内源性昼夜节律   精神障碍   基因   睡眠-觉醒周期   昼夜节律生物钟   觉醒周期紊乱   外部环境   生理机能  

摘要： 内源性昼夜节律系统使机体的各种生理机能及其与外部环境之间相互协调,即包括感觉信息与环境时间、机体生理和心理状态的整合作用。当这种整合功能的协调性遭到破坏时,可发生精神障碍、情绪紊乱、睡眠-觉醒周期紊乱、激素水平及分泌高峰时间的变化。本文对昼夜节律生物钟的分子机制、昼夜节律钟基因在睡眠-觉醒周期障碍中的作用及其与精神障碍的关系作一综述。

关键词： 光周期   基因克隆   基因表达   BaCCA1  

摘要： 昼夜节律钟基因CCA1在调解水稻和拟南芥的光周期反应中起着重要作用。利用BLAST手段以玉米中的CCA1基因序列作为靶序列,调取Genbank数据库信息,并结合RT-PCR方法获得了大麦的cDNA同源序列。BLASTx分析发现其与水稻和玉米的序列相似性分别达到72%和69%。通过ORF Finder软件分析发现,该序列包含一个2157bp的开放阅读框,编码一个由718个氨基酸残基组成的蛋白序列,其分子量为77 769.4Da,等电点为6.55。采用实时荧光定量PCR分析发现,随光照时间的变化,该基因在大麦叶片中的表达量呈现出白天不断降低而夜晚逐渐升高的昼夜变化趋势,且在华大麦1号和华大麦2号中的表达曲线存在一定的差异。本研究为进一步研究大麦CCA1基因在调控大麦光周期响应途径中的功能,阐明大麦光周期敏感机制提供了科学依据。

摘要： Cyanobacteria are photosynthetic prokaryotes that live in aquatic environments. The cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942, (hereafter S. elongatus) coordinates its day and night behaviors via a circadian clock. The clock is entrained by light/dark cycles but continues to run in constant light conditions. The core circadian clock in S. elongatus is encoded by post-translational modifications of three Kai proteins, but the extent and mechanism of circadian gene expression are unknown. We provide the first unbiased characterization of circadian gene expression in S. elongatus, demonstrating that ∼65% of genes display oscillation in continuous light conditions, with some genes peaking in expression at subjective dawn and others at subjective dusk. We next sought to identify the mechanism by which such a large fraction of the genome could be rhythmically controlled. Through bioinformatic, correlative, and perturbation experiments, we find that circadian changes in chromosome topology/supercoiling are sufficient to drive rhythmic expression (Chapter 2). To further investigate how chromosome topology can control gene expression we performed a high resolution characterization of transcripts and RNA polymerase across the S. elongatus genome (Chapter 3). Bioinformatic analysis of transcription start sites suggests that the AT/GC content a particular region of the promoter is informative in defining the phase at which a transcript is maximally expressed. We find that these sequences are sufficient to drive circadian gene expression at a particular phase and that mutation of single nucleotides in this region can reverse the expression phase of a transcript (Chapter 4). To understand the role of chromosome dynamics in circadian gene expression and cyanobacterial physiology, we tagged and followed chromosomes over multiple cell divisions. We find that S. elongatus cells harbor multiple ordered copies of a single chromosome, and the organization of chromosomes in the cyt

关键词： 昼夜节律   基因组参数   晚期胚胎发育蛋白   哺乳动物   胚胎滞育   调控机制   周期性表达  

摘要： 自然环境的周期性变化是普遍存在的，其中最明显的两种现象是昼夜交替和季节更换。生物体在长期适应环境的过程中，产生了相应的应对策略，其中哺乳动物的昼夜节律和节肢动物的胚胎滞育分别是适应昼夜交替和季节更换的典型机制。为了深入的研究哺乳动物昼夜节律和节肢动物胚胎滞育的调控机制，需要对昼夜节律基因和胚胎滞育相关基因的特征有一个系统的认识。在此框架下，我们的研究工作主要集中在以下两个方面。　　 哺乳动物昼夜节律系统通过调控大量的每天周期性表达的基因(昼夜节律基因)来支配机体许多的生理过程和行为反应。在哺乳动物基因组中，还有许多基因，它们每天的表达模式不呈现周期性(非昼夜节律基因)，这些基因是研究昼夜节律基因特征的一个最优参照组。在本研究中，基于公共数据库中小鼠肝脏和肾上腺的昼夜节律转录组数据，我们在这两个组织中重新鉴定了昼夜节律和非昼夜节律基因;并且整合了蛋白组等多个层面上的数据集对这两组基因的特征进行了比较。通过比较同一组织内鉴定的昼夜节律基因和非昼夜节律基因，我们发现前者表现出十分特殊的性质。首先，昼夜节律基因总体上具有较少的邻近基因，较长的基因组和3’端非翻译区长度，以及较短的蛋白编码区长度。其次，昼夜节律基因具有较高的基因和蛋白表达丰度，并且具有较高的时间表达变异度和较短的转录本半衰期。再次，至少有60％的昼夜节律基因位于4个主要的同峰表达节律群中，即黎明，白天，黄昏，和夜晚节律群。通过组织间的比较分析，我们发现一半以上的昼夜节律基因在组织中广泛表达，但却只在特定的一个或几个组织中周期性的表达。昼夜节律基因在不同时间点间的表达变异度比在不同组织间的表达变异度至少小3倍，这一结果提示昼夜节律系统可能在组织特异性功能的微调控中发挥着较为重要的作用。另外，编码大蛋白和小蛋白的昼夜节律基因分别在白天和夜晚同峰表达节律群中富集，因此我们认为昼夜节律基因在基因表达调控网络中的位置与它们本身的基因大小，表达约束性，和染色体结构等方面的特征密切相关。综上所述，我们认为昼夜节律系统根据不同基因的不同特征对它们进行综合调配，进而以最经济的方式对组织功能的特异性进行微调控来适应环境的即时变化，这可能是在长期的进化过程中逐渐形成的。　　 晚期胚胎发育蛋白(LEA)与滞育胚胎和滞育后胚胎的抗逆机制密切相关，从卤虫滞育后胚胎中，我们界定了14个LEA和LEA－like基因，其中包括4个新发现的基因，它们分别是Afrleal-5，Afrlea3-5，Afrlea3-like1和Afrlea3-like2。基于这些LEA和LEA-like基因编码的蛋白序列的保守性和差异性，氨基酸组成等方面的特点，并通过与细菌，植物和动物中已报道的LEA蛋白的性质进行比较，卤虫中的14个LEA和LEA－like基因被分成了4组，分别是第1组，第3组，第3组类似LEA基因，以及种子成熟蛋白(SMP)类似编码基因。我们同时对其中的6个有代表性的基因，采取RT-qPCR的方法，研究它们从滞育后胚胎到孵化为浮游幼虫期间的表达模式，3个LEA基因，2个第3组类似LEA基因在从耐受干燥的虫卵到孵化成不耐受干燥的浮游幼虫的过程中表达量呈现下调，而种子成熟蛋白类似基因的表达量却并没有呈现出明显下调。这些结果表明不同的LEA和LEA-like基因在卤虫滞育后胚胎的抗逆和发育过程中可能具有不同的功能。

关键词： 昼夜节律基因   食管癌   Eca-109细胞   凋亡   放射敏感性  

摘要： 目的探讨昼夜节律基因hPer1和hPer2对食管癌细胞株(Eca-109)放射敏感性的影响。方法体外培养食管癌Eca-109细胞株,通过避光和乙酰肉豆蔻佛波酯(PMA)分别诱导昼夜节律基因hPer1和hPer2节律性的表达,用RT-PCR检测出表达高峰和低谷。在hPer1和hPer2表达的高峰和低谷时,分别用6mV-X射线给予照射,通过Tunel及流式细胞术,检测肿瘤细胞的凋亡。结果昼夜节律基因表达高峰时照射与低谷时照射比较,肿瘤细胞凋亡率减少(P<0.05)。结论昼夜节律基因hPer1和hPer2高表达,能够降低食管癌细胞的放射敏感性。

关键词： 光周期   基因克隆   基因表达   玉米CCA1  

摘要： 昼夜节律钟基因CCA1在调解水稻和拟南芥的光周期反应中起着重要作用。本研究利用从水稻和拟南芥中分离到的CCA1基因序列作为靶序列BLAST获取Genbank中的信息,通过RT-PCR方法克隆获得了一条2326bp的玉米CCA1基因cDNA序列。BLAST比对发现其与水稻、大麦和拟南芥的序列相似性分别达73.7%、69.4%和39.8%。利用NCBI中的ORF Finder软件分析,发现该序列包含一个2163bp的开放阅读框,编码720个氨基酸残基,蛋白的分子量约为78819.17Da,等电点为6.468。推测其含有3个myb-DNA结合域、7个N-豆蔻酰化位点、1个G-box蛋白结合域以及1个蛋白跨膜结合域。采用实时荧光定量PCR分析发现,随光照时间的变化,该基因在玉米叶片中的表达量呈现出白天不断降低而夜晚逐渐升高的昼夜变化趋势。本研究为进一步研究玉米CCA1基因在调控玉米光周期敏感现象中的功能,阐明玉米光周期敏感机制提供了科学依据。