关键词： 异钩藤碱   AT1R-Src信号途径   时钟基因   昼夜节律   A7r5细胞系  

摘要： 【目的】探讨异钩藤碱通过血管紧张素1型受体(AT1R)对血管平滑肌细胞(A7r5细胞)时钟基因昼夜节律改变的调控作用。【方法】采用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导A7r5细胞构建时钟基因节律改变模型。实验分为正常对照组、模型组(AngⅡ剂量为0.1μmol/L)、异钩藤碱组(异钩藤碱剂量为31μmol/L)和异钩藤碱联用缬沙坦(AT1R阻滞剂)组(异钩藤碱31μmol/L、缬沙坦10μmol/L)。采用实时定量聚合酶链反应(q PCR)法检测各个时间点不同组A7r5细胞中AT1R、Per2、Bmal1、Clock基因的表达水平,建立数学模型计算不同参数间的差别。采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测各个时间点不同组A7r5细胞中Src和p-Src蛋白表达情况。【结果】A7r5细胞经AngⅡ(0.1μmol/L)作用后,AT1R、Per2、Bmal1、Clock基因出现昼夜节律改变,呈现反杓型波动;Src蛋白磷酸化表达增加。异钩藤碱(31μmol/L)作用后,上述时钟基因表达恢复正常的杓型波动。异钩藤碱(31μmol/L)与缬沙坦(10μmol/L)联用后,上述时钟基因的昼夜节律受到一定程度的抑制,各组细胞的中值、振幅和峰相位发生不同程度的改变,Src蛋白磷酸化水平下调。【结论】异钩藤碱通过AT1R-Src信号途径可调控AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞时钟基因表达的昼夜节律改变。

关键词： 应激   抑郁症   视交叉上核   生物钟基因   生物节律   加味四逆散  

摘要： 目的:研究中药复方加味四逆散分时给药对应激性抑郁症大鼠下丘脑视交叉上核(SCN)生物钟基因的表达及其昼夜节律的影响。方法:采用慢性不可预计性轻度应激建立大鼠应激抑郁模型。采用RT-PCR法及余弦节律分析法观察分析抑郁症大鼠下丘脑SCN Bmal1、Clock的表达及其昼夜节律的变化。结果:大鼠下丘脑SCN Bmal1在3个时间点表达增强,SCN Clock在5个时间点表达增强,2^(-△△Ct)的中值、峰值、谷值均明显上升,振幅增大,时相提前。结论:加味四逆散卯、酉时给药主要是通过调节下丘脑SCN中Bmal1和Clock的表达及其时间节律达到抗抑郁的效应。

关键词： 针刺   糖尿病抑郁   昼夜节律  

摘要： 目的：观察针刺对糖尿病抑郁模型大鼠血清CORT昼夜节律及SCN内Per1、Per2基因表达的影响,探讨针刺治疗糖尿病抑郁的生物学机制。方法：将36只SD大鼠随机分为空白组（12只）、模型组（12只）和针刺组（12只）3组。模型组和针刺组运用腹腔注射链脲佐菌素＋慢性应激法建立糖尿病抑郁复合模型。针刺组于造模后每日取穴＂后三里＂（双）、＂三阴交＂（双）、＂百会＂针刺,每次留针20 min,每日1次,连续针刺7 d。空白组和模型组相同方法抓取固定,不予处理。针刺结束后检测各组血糖、旷场实验行为学变化、血清CORT昼夜节律及SCN内Per1、Per2基因的表达水平。结果：模型组血糖较空白组显著升高（P〈0.05）,而针刺组大鼠血糖较模型组显著下降（P〈0.05）;模型组水平跨格数和直立次数较空白组显著减少（P〈0.05）,针刺组大鼠水平跨格数和直立次数较模型组显著增加（P〈0.05）;模型组大鼠CORT较空白组显著升高（P〈0.05）且近似昼夜节律消失（P〉0.05）;针刺组CORT较模型组显著降低（P〈0.05）,CORT昼夜节律恢复;模型组大鼠Per2基因表达较空白组显著升高（P〈0.05）,而针刺组针刺治疗后Per2基因表达显著下调,与模型组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：针刺对糖尿病抑郁模型大鼠血糖、抑郁情绪及CORT昼夜节律具有调节作用,其作用机制可能是通过下调糖尿病抑郁大鼠SCN内Per2基因表达,从而降低对正性过程的反馈抑制而实现。

关键词： 天麻钩藤饮   时钟基因   AT1R信号通路   昼夜节律  

摘要： 目的观察天麻钩藤饮对AngⅡ诱导的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞A7r5中时钟基因(Per2、Bmal1、Clock)、AT1R基因及Src、p-Src蛋白昼夜节律表达的影响,探讨天麻钩藤饮通过AT1R信号途径调节时钟基因昼夜节律变化的可能机制。方法以AngⅡ诱导A7r5细胞建立时钟基因昼夜节律变化模型,将细胞模型分为AngⅡ诱导组、天麻钩藤饮组。AngⅡ诱导组以终浓度为100 nmol·L^(-1)的AngⅡ诱导24 h,天麻钩藤饮组以终浓度为100 nmol·L^(-1)的AngⅡ和200 mg·L^(-1)的天麻钩藤饮处理24 h,以加样时间为ZT0,每隔4小时收集细胞,提取蛋白和RNA,采用Q-PCR方法检测各时间点A7r5细胞中的时钟基因(Per2、Bmal1、Clock)和AT1R基因表达水平,Western Blot检测各时间点A7r5细胞中Src、p-Src蛋白表达水平。结果 AngⅡ作用于A7r5细胞后,时钟基因Bmal1和Per2表达中值升高,峰相位前移,呈现出与正常细胞不同的昼低夜高的反杓型节律变化;AT1R基因表达水平显著升高、Src、p-Src蛋白表达亦呈现出昼低夜高的反杓型节律变化;与AngⅡ诱导组相比,天麻钩藤饮组A7r5细胞Bmal1、Per2基因m RNA表达中值降低,呈现昼高夜低的杓型节律变化,AT1R基因及Src、p-Src蛋白的表达水平下降,呈现类似空白对照组的昼夜节律变化。结论天麻钩藤饮能够通过AT1R信号通路调节AngⅡ诱导的A7r5细胞时钟基因昼夜节律改变。

关键词： 生物钟昼夜节律调节基因(CLOCK)   节律基因   预后   生长   肝细胞肝癌  

摘要： 目的明确生物钟昼夜节律调节基因(CLOCK)在肝细胞肝癌(HCC)中的表达及对细胞生长的作用。方法采用免疫组织化学染色法检测CLOCK在158例HCC组织及对应癌旁组织中的表达,利用HCC公共数据(共356例)验证CLOCK在HCC组织中的表达变化。单因素统计分析CLOCK表达与HCC患者临床病理特征间的关系,并且采用生存分析法比较CLOCK表达水平高低对HCC患者生存的影响。敲低肝癌Hep G2细胞中CLOCK水平,采用MTS法检测CLOCK对细胞生长的影响。结果 CLOCK在HCC组织高表达,而在356例HCC公共数据中,癌组织中CLOCK表达同样显著上调。按照CLOCK的表达水平,将158例HCC患者分为低表达组和高表达组,单因素分析结果显示,CLOCK在HCC中的表达与肿瘤直径、TNM分期、门脉侵袭有关。CLOCK低表达组HCC患者的总生存时间和无复发生存时间均显著长于高表达组患者。在肝癌Hep G2细胞中,敲低肝癌细胞CLOCK后细胞增殖能力显著降低。结论 CLOCK在HCC中呈高表达趋势,与HCC的恶性程度相关,其表达上调提示HCC患者预后不良,敲低CLOCK显著抑制肝癌细胞生长。

关键词： 急性冠脉综合征   昼夜节律   斑块稳定性  

摘要： 目的:急性冠脉综合征(Acute coronary syndrome,ACS)是一组严重的临床综合征,是造成全世界发病率和死亡率的重要原因。几乎所有的生物体都表现出明显的昼夜节律。在临床中,我们发现睡眠不足或者熬夜,饮食习惯不规律,缺乏运动,都使得人们患急性冠脉综合征的风险更大。然而,目前尚未有研究报道昼夜节律是否与急性冠脉综合征相关本实验的研究目的是探讨昼夜节律以及生物钟基因与急性冠脉综合征之间的相关性。方法:在本实验中,我们收集急性冠脉综合征患者与冠脉正常者进行研究。阿森斯失眠量表(Athens Insomnia Scale,AIS)和匹兹堡睡眠指数(Pittsburgh Sleep Quality Index,PSQI)用以评估睡眠质量,国际体力活动问卷(International Physical Activity Questionnaire,IPAQ)用以评估运动量,健康饮食评分(Healthy Diet Score,HDS)用以评价饮食情况。此外,实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)用以测定脑肌类芳香烃受体转位蛋白1(muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 1,Bmal1),昼夜节律运动输出周期故障(circadian locomotor output cycles kaput,Clock),隐花色素生物钟1(Cryptochrome1,Cry1),周期昼夜节律生物钟2(Period2,Per2),核受体亚家族1,D组,成员1(nuclear receptor subfamily 1,group D,member 1,Rev-erbα),基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2,Mmp2)和Mmp9 m RNAs的相对表达。结果:对于睡眠质量的评估,我们的研究发现在ST段抬高型心肌梗死组(ST segment elevation myocardial infarction,STEMI)中AIS评分最高(9.02±4.27),其次为非ST段抬高型心肌梗死组(non-ST segment elevation myocardial infarction,NSTEMI)(8.61±5.03),然后是不稳定性心绞痛组(unstable angina pectoris,UA)(5.60±4.30),在正常对照组(normal control,NC)中最低(2.24±3.64)(P<0.05)。同样,我们观察到PSQI评分在STEMI组中最高(9.85±4.53),其次是NSTEMI组(8.82±4.97),然后是UA组(7.60±4.55),在NC组中最低(4.41±3.55)(P<0.05)。对于运动量的评估,我们的研究发现IPAQ评分在正常对照组和UA组中明显高于STEMI组和NSTEMI组(P<0.05),但是在STEMI患者和NSTEMI患者之间没有明显统计学差异(P>0.05)。而对于日常饮食的评价,我们发现HDS评分在正常对照组中明显高于UA组、STEMI组和NSTEMI组(NC,39.41±4.68;UA,36.51±3.84;NSTEMI,34.63±4.97;STEMI,31.58±3.88;P<0.05)。与此同时,我们发现与NC组相比,生物钟基因Bmal1、Clock、Cry1、Per2和Rev-erbαm RNAs表达水平在STEMI组中最低,然后是NSTEMI组,而在UA组中相对较高(P<0.05)。此外,相对于NC组、UA组和NSTEMI组,Mmp m RNAs的表达水平在STEMI组中明显升高(P<0.05),而相对于UA组,Mmp2和Mmp9 m RNAs的表达水平在STEMI组和NSTEMI组中明显升高(P<0.05),而STEMI组和NSTEMI组相比,STEMI组中Mmp m RNAs的表达水平也相对较高(P<0.05)。结论:基于我们的实验数据我们发现昼夜节律紊乱会促进急性冠脉综合征的发生,并且生物钟基因的表达水平与ACS冠脉病变严重程度相关。生物钟基因可能通过抑制基质蛋白酶的表达,来影响动脉粥样硬化斑块的稳定性。

关键词： 结直肠腺癌   PER3   Notch1   昼夜节律基因   Notch信号通路  

摘要： 目的:观察正常结直肠黏膜、结直肠腺瘤及结直肠腺癌组织中PER3、Notch1的蛋白表达情况,探讨两者与结直肠腺癌发生发展以及与临床病理特征之间的关系。方法:收集10例正常结直肠黏膜、25例结直肠腺瘤及50例结直肠腺癌组织,采用免疫组化的方法检测上述三种组织中PER3、Notch1的蛋白表达水平,计数细胞着色强度及阳性细胞所占同类型细胞的百分比相加所得总和来判定PER3、Notch1的蛋白表达水平,探讨上述两个指标的表达情况及其与临床病理特征之间的关系,并分析两者在结直肠腺癌中的相关性。结果:PER3及Notch1在结直肠腺癌中均有表达。PER3在正常结直肠黏膜、结直肠腺瘤及结直肠腺癌组织中的阳性率分别为100%(10/10)、80%(20/25)、56%(28/50),腺癌组分别和腺瘤组及正常组比较,其差异有统计学意义(P<0.05),而腺瘤组与正常组比较差异无意义(P>0.05);Notch1在上述组织中阳性率分别为10%(1/10)、52%(13/25)、74%(37/50),腺癌组分别和腺瘤组及正常组比较,其差异有统计学意义(P<0.05),而腺瘤组与正常组比较差异无意义(P>0.05)。PER3、Notch1在结直肠腺癌组织中的表达均与有无淋巴结转移、肿瘤临床分期、分化程度及肿瘤浸润深度有关(P<0.05),而与年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小无关(P>0.05)。与有淋巴结转移组对比,PER3的阳性表达率明显低于无淋巴结转移组(P<0.05),且PER3的阳性表达与肿瘤的分期以及分化程度有关,肿瘤分期越高,分化程度越低,PER3的阳性表达率越低(P<0.05),而Notch1则相反。运用Spearman检测法分析两者相关性,我们发现PER3和Notch1之间呈负相关关系(r=-0.455,P<0.01)。结论:1.与正常组织及腺瘤组织相比,PER3在腺癌中的阳性表达率逐渐下降,Notch1则表现为逐渐上调,说明PER3、Notch1的异常表达可能参与结直肠癌的发生及发展。2.在结直肠腺癌组织中,PER3、Notch1均与有无淋巴结转移、肿瘤临床分期、分化程度及肿瘤浸润深度有关,说明PER3的表达降低与Notch1的表达升高可能影响结直肠腺癌的转移能力及恶性程度。这提示未来可以将PRE3及Notch1作为预测结直肠癌预后的新指标。3.在结直肠腺癌中,PER3的表达与Notch1存在负相关关系。

关键词： 生物钟   BMAL1   NCX1   兴奋收缩偶联  

摘要： 由于地球自转导致光照等环境因子形成约24h为周期的昼夜循环变化,使得地球上的生物进化出可以适应这些环境因子周期变化的生物钟(CircadianClocks)系统。生物钟赋予生物体可以预测时间和环境变化的能力,调控自身行为和生理活动,使得机体活动与外界变化周期保持同步。哺乳动物生物钟主要由中枢生物钟和外周生物钟两部分构成,中枢生物钟位于下丘脑视交叉上核(Suprachiasmatic Nucleus,SCN),作为起搏点,通过接受外界光线刺激产生并维持日周期节律,同时通过神经体液信号传递同步调节外周生物钟,进而控制一系列生理活动和行为的生物节律,如心率、心输出量、激素分泌、能量代谢及睡眠-觉醒周期等。心脏活动和心脏疾病发作呈昼夜节律性。研究提示,这是生物钟分子控制下刺激-反应偶联的重要体现。生物钟赋予心肌预测环境变化、针对性进行自我调控的能力,其受损会导致心脏病理变化。心肌-收缩偶联是心脏舒缩活动的重要环节,由Ca2+操控蛋白协调控制下的Ca2+循环而实现。NCX1是此循环中Ca2+迅速回落至静息水平的重要执行者。我们在前期实验中观察到,12:12明暗条件饲养的小鼠心脏呈现Bmal1相关的Ncx1节律性表达。本研究通过建立全黑暗的小鼠饲养模型(允许内源性生物节律自由运转)以及马血清休克处理小鼠心房瘤细胞系HL-1细胞和原代培养的新生大鼠心肌细胞体外模拟生物钟振荡的细胞模型,进一步研究小鼠心脏核心生物时钟基因Bmal1对Ncx1表达和功能的调节作用。主要结果如下:1.在持续黑暗饲养2周的条件下,小鼠心肌Ncx1的表达存在内在的昼夜节律性振荡,表现其mRNA和蛋白表达在CT9最低,CT21最高,且其振荡的周期节律与核心生物钟基因Bmal1相似。2.利用腺病毒在小鼠HL-1细胞和原代培养的新生大鼠心肌细胞过表达钟基因Bmal1,随Bmal1节律性表达振幅的增加,Ncx1的节律性表达振幅增加;相反,在HL-1和新生大鼠心肌细胞用shRNA敲减Bmal1,随Bmal1节律性表达振幅的降低,Ncx1的节律性表达振幅也相应降低,但不论是下调或是过表达Bmal1,Ncx1节律性表达的相位并未收到改变,二者呈依从性关系。***(chromatin immunoprecipitation)检测结果显示,核心生物钟基因Bmal1可以被招募到Ncx1启动子上游序列;而荧光素酶报告基因检测进一步证明,核心生物钟基因Bmal1可以通过结合Nx1启动子上游-542bp内的4个E-box(CATATG、CATGTG、CACTTG、CAAATG,转录应答元件)位点,直接调控Ncx1的转录表达。4.用全细胞膜片钳技术在HL-1细胞记录NCX1电流(INCx1)的结果表明,与Ad-GFP组相比,过表达Bmal1使INCx1电流密度显著增加,提示BMAL1对NCX1的功能具有调节作用。上述结果表明,在小鼠心脏中Ncx1受到Bmal1的调控而呈现出内源性节律表达,这种调控是通过BMAL1直接结合到Ncx1启动子上游的4个转录应答元件而实现的。

关键词： 金黄地鼠   口腔颊黏膜   癌变   生物钟基因   细胞周期基因   昼夜节律  

摘要： 目的探讨生物钟基因Perl和细胞周期基因p53、Cyclin D1、B1、CDK在金黄地鼠口腔颊黏膜癌变不同阶段昼夜节律表达变化及与癌变发生的相关性。方法在黑暗和光照交替环境下饲养90只金黄地鼠,在地鼠的颊黏膜上涂抹二甲基苯并蒽(DMBA)以建立颊黏膜鳞状细胞癌模型,分别在涂抹DMBA前和涂抹DMBA6周、14周后的24小时开灯后时间(HALO)的第4个HALO开始,每隔4HALO处死5只金黄地鼠,分别获取正常颊黏膜和癌前病变以及鳞状细胞癌3个阶段各昼夜6个时间点的组织。按照常规将获取的组织进行切片,在HE染色下对组织的癌变情况进行观察;对各时间点组织中p53、Cyclin D1和B1、CDK1 mRNA、Perl等表达水平采用定时定量荧光PCR(RT-PCR)进行检测。结果 Perl mRNA在鳞状细胞癌组和癌前病变组以及正常颊黏膜组中各时间点的表达均有明显差异(P<0.05);鳞状细胞癌组和癌前病变组的Perl mRNA表达中值及振幅均显著低于正常颊黏膜组(P<0.05),且鳞状细胞癌组又显著低于癌前病变组(P<0.05)。细胞周期基因p53、细胞周期蛋白D1和周期蛋白依赖性激酶的mRNA在三组各时间点之间的表达差异均有统计学意义(P<0.05),而细胞周期蛋白B1的mRNA则仅在鳞状细胞癌组和正常颊黏膜组各时间点中的表达差异具有统计学意义(P<0.05)。鳞状细胞癌组和癌前病变组的p53 mRNA表达中值均显著低于正常颊黏膜组(P<0.05),且鳞状细胞癌组又显著低于癌前病变组(P<0.05)。鳞状细胞癌组和癌前病变组的CDK1 mRNA表达中值均显著高于正常颊黏膜组(P<0.05),鳞状细胞癌组的Cyclin B1 mRNA表达中值显著高于正常颊黏膜组(P<0.05)。结论金黄地鼠实验结果提示,生物钟基因Perl和细胞周期基因p53、Cyclin D1、B1、CDK的昼夜节律均随着口腔颊黏膜癌变的发生发展而变化,即细胞周期和昼夜节律之间的相互作用与癌变的发生具有极为密切的关系。