关键词： Clock   Per1   Cry2   载体   双荧光素酶报告基因检测系统  

摘要： 背景:结直肠癌是世界第三大恶性肿瘤,近年来的多项研究揭示了肠道菌群失调通过多种机制促进结直肠癌的发生、发展。昼夜节律钟基因影响细胞增殖的周期和凋亡,与肿瘤密切相关。目的:研究肠道微生物对结直肠癌细胞昼夜节律基因的调控,为进一步利用微生态制剂辅助治疗结直肠癌以及依据昼夜节律选择用药时机提供实验基础。方法:利用生物信息学软件UCSC Genome Browser Gateway和Promoter Scan预测人体昼夜节律基因Clock、Per1、Cry2三个基因的启动子,利用Primer Premier网站设计启动子引物。人结肠癌HCT116细胞和RKO细胞培养后提取DNA,使用上述三个基因启动子引物进行模板DNA的扩增。扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳鉴定后胶回收,回收产物与p GEM?-T Easy载体连接后转化,进行蓝白斑筛选,菌液PCR鉴定后送基因公司测序。菌液提取启动子质粒后双酶切,双荧光素酶报告基因载体(PGL3-Basic)双酶切,酶切产物PCR鉴定后利用T4 DNA连接酶连接启动子质粒与双荧光素酶报告基因。基因测序鉴定重组载体,验证重组载体构建成功。使用转染试剂将三种重组载体质粒共转染到HCT116细胞,加入大肠杆菌及其代谢产物,利用双荧光素酶基因检测系统检测活性(每4小时一次,共检测12次共48小时),进而确定大肠杆菌对三种昼夜节律基因表达的节律性调控。结果:含有启动子的重组质粒菌液测序结果与Gene Bank的序列一致,成功构建了含有Clock、Per1、Cry2启动子的双荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告基因测定结果表明:大肠杆菌及其代谢产物能使Per1基因表达高峰前移,大肠杆菌及其代谢物能调控Per1基因的表达。结论:成功构建三组重组载体,双荧光素酶报告基因检测结果显示大肠杆菌及其代谢产物能调控Per1基因的表达。

关键词： 卵巢癌   顺铂耐药   昼夜节律基因   CRY1   细胞自噬  

摘要： 目的:检测昼夜节律基因CRY1与细胞自噬在卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP及其亲本细胞株A2780中的表达差异,探讨CRY1与细胞自噬的相关性及其是否参与A2780/DDP耐药性的产生。方法:***-PCR及Western Blot检测A2780及A2780/DDP细胞株中细胞自噬和昼夜节律基因及相关蛋白表达水平;细胞免疫荧光检测LC3和CRY1的表达及分布情况。2.顺铂处理肿瘤细胞后,CCK8检测细胞1～5天的存活率;吖啶橙及Hoechst33342观察自噬囊泡和细胞核形态;Western Blot检测自噬和昼夜节律基因表达。3.3-甲基腺嘌呤处理肿瘤细胞后,Western Blot检测自噬和昼夜节律基因的表达变化。4.慢病毒介导CRY1干扰及过表达质粒分别调控A2780和A2780/DDP细胞CRY1基因的表达水平;qRT-PCR和Western Blot检测CRY1稳定转染细胞CRY1及细胞自噬相关蛋白;CCK8比较调控CRY1前后细胞顺铂敏感性变化。结果:1.与A2780细胞相比,qRT-PCR结果显示A2780/DDP中CRY1、CRY2、CLOCK、LC3表达明显上调,p62/SQSTM1下调;Western Blot结果示LC3上调,p62/SQSTM1、CRY1、CRY2、CLOCK的表达明显下调,其中CRY1和CLOCK差异最为明显;细胞免疫荧光法结果显示A2780/DDP细胞中LC3的表达明显增加、CRY1减少。2.顺铂处理A2780和A2780/DDP后,CCK8结果显示A2780/DDP的顺铂抵抗性明显强于A2780,A2780/DDP的24h和48h IC50分别为22.131μg/ml、25.378μg/ml,A2780 IC50分别为6.066μg/ml、4.316μg/ml。3.顺铂处理48h后,吖啶橙结果显示顺铂可诱导A2780和A2780/DDP的自噬效应。Hoechst33342观察细胞核形态,结果为当顺铂浓度分别为5μg/ml和10μg/ml时A2780和A2780/DDP的凋亡效应明显增加。与A2780相比,Western Blot结果显示:顺铂浓度≤5μg/ml时,诱导A2780/DDP细胞自噬效应增加不明显,CRY1呈上升趋势。但当顺铂浓度达到20μg/ml时,A2780/DDP自噬效应明显增加,CRY1下调。4.3-MA抑制细胞自噬后,Western Blot结果显示:A2780及A2780/DDP细胞CRY1表达均呈上升趋势,且两者增加程度差异相当。5.分别将慢病毒介导的shCRY1和3xflag CRY1重组质粒稳定转染到A2780和A2780/DDP细胞中并获得稳转株,前者CRY1的mRNA和蛋白水平均呈下降趋势,后者为上调显著。Western Blot检测LC3,结果显示干扰CRY1后,自噬效应变化差异均无统计学意义;CRY1过表达后,A2780自噬效应无明显变化,A2780/DDP细胞自噬效应明显增加。CCK8检测稳定转染细胞株顺铂处理后1～5天的存活率,发现CRY1过表达,自噬效应增加,但细胞的存活率下降;而CRY1敲减后,自噬表达差异无统计学意义,但其存活率却呈现上升趋势。结论:1.与A2780细胞相比,昼夜节律基因CRY1在A2780/DDP中表达明显降低,自噬效应显著增加。顺铂可诱导细胞自噬效应的增加,降低CRY1的表达。2.抑制细胞自噬CRY1表达明显增加。CRY1基因沉默使A2780和A2780/DDP细胞对顺铂的敏感性下降,且前者下降更为明显。CRY1过表达能有效逆转A2780/DDP细胞对顺铂的耐药性。3.细胞自噬可能通过下调CRY1表达在A2780/DDP细胞中发挥作用,上调CRY1可增加A2780/DDP的顺铂敏感性。CRY1可能成为难治性卵巢癌的靶向治疗的新靶点。

关键词： 婴儿痉挛症   褪黑素   ACTH   昼夜节律   昼夜节律基因  

摘要： 研究背景及目的:婴儿痉挛症(IS)是儿童期最常见的灾难性癫痫综合征之一。该综合征主要表现为痉挛发作、脑电图高度失律和精神运动发育迟滞。其痉挛发作具有昼夜节律性。而褪黑素作为人体分泌的一种胺类激素,由昼夜节律调节,同时亦可反过来调节昼夜节律。昼夜节律形成的关键点在于昼夜节律基因的表达,其中核心基因为BMAL1和CLOCK基因,以及其靶基因Per及Cry基因。目前对婴儿痉挛症的发病机制并未完全明确,但是相关文献报道癫痫与褪黑素及昼夜节律关系密切。故本实验旨在探讨婴儿痉挛症与褪黑素及昼夜节律因子的关系,并进一步探索新的治疗方案。方法:①根据2010年婴儿痉挛症诊断标准选取解放军总医院2017年3月-2017年9月间住院3岁以内婴儿痉挛症患儿39例作为病例组,从呼吸道或泌尿系感染病人中,选取无癫痫及其他神经精神疾病42例作为对照组,使用酶联免疫法(ELISA法)检测两组血清中的褪黑素(MT)、5-羟色胺(5-HT)、催乳素(PRL)及一氧化氮(NO)水平,并比较血清中的MT、5-HT、PRL及NO水平在对照组与病例组,以及病例组ACTH治疗前后的差异。②选择雄性SD大鼠9只,雌性SD大鼠18只,部分雌鼠怀孕后给予冷水游泳产前应激,在其子代出生后给予NMDA注射,建立婴儿痉挛大鼠模型,对其痉挛发作潜伏期、频率以及严重程度予以记录,并通过Western blot对其下丘脑的昼夜节律基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Cry1、Cry2的表达水平进行分析。结果:①病例组血清MT(7.1±1.9)pg/ml及5-HT(1183.3±258.9)mIU/L水平相比对照组可见明显减低(P<0.05),而PRL(523.1±109.4)mIU/L及NO(101.3±22.1)μmol/L相比对照组可见明显增高(P<0.05)。病例组在 ACTH 治疗后 MT(9.2±1.9)pg/ml 及 5-HT(1366.0±236.9)mIU/L较治疗前升高(P<0.05);PRL(408.2±93.4)mIU/L较治疗前减低(P<0.05);NO(96.3±21.9)μmol/L与治疗前无明显差异(P=0.261)。②与健康对照组相比,可见产前应激+NMDA组大鼠的痉挛发作的发作潜伏期、痉挛程度评分均存在明显差异。对比产前应激+NMDA组,产前应激+NMDA+ACTH组、产前应激+NMDA+褪黑素组、产前应激+NMDA+ACTH+褪黑素组中大鼠的痉挛发作的发作潜伏期、临床评分在均可见明显差异。而与健康对照组相比,所有产前应激+NMDA组中大鼠的昼夜基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Cry1、Cry2均呈低表达状态,在给予ACTH或(及)MT治疗后,其表达可见明显增强。结论:婴儿痉挛症患儿的血清MT、5-HT、PRL及NO的表达水平可见明显异常,经过ACTH治疗后可以发现MT、5-HT的水平明显回升,PRL水平则出现回落,NO水平未见显著变化。推测褪黑素及其相关激素水平的异常以及互相作用,在婴儿痉挛症发病过程中可能起到重要作用;婴儿痉挛症大鼠模型中的昼夜节律因子可见明显的低表达状态,而在给予ACTH或(及)MT治疗后可见明显的回升,故昼夜节律因子的低表达可能是婴儿痉孪症发病的基础。

关键词： 内分泌干扰物   邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯   视交叉上核   昼夜节律   下丘脑  

摘要： 目的:通过检测出生前DEHP暴露的成年后大鼠下丘脑昼夜节律调控相关基因Clock、Arntl、Dbp、Per1、Per2的表达水平,以及CLOCK和DBP蛋白在SCN核区和大脑皮质的表达水平,探讨出生前DEHP暴露对成年大鼠昼夜节律基因及其产物的影响。方法:将32只孕鼠随机分为溶剂(玉米油)对照组和2、10、50mg/kg DEHP剂量组,每组8只,从孕14至孕19天,10mL/kg/天进行灌胃染毒。将子代大鼠出生日记为PND0,于PND21断乳并分笼饲养。在子代大鼠10周龄时每窝随机选取雌、雄各1只,每组雌、雄各8只,断头处死,取出脑组织后用脑模具制成1mm厚的切片,在下丘脑包含SCN的区域打孔并提取总RNA,用实时荧光定量PCR检测昼夜节律相关基因在大鼠下丘脑SCN核区的表达水平。用同样的方法选择每组雌、雄大鼠各8只,取出脑组织,用振荡切片机制成40μm厚的脑切片。根据大鼠脑立体定位图谱,挑选含有SCN核区的脑片,用免疫荧光组织化学法结合激光扫描共聚焦显微镜检测CLOCK蛋白和DBP蛋白的表达水平。结果:(1)雄性子代大鼠各组间SCN核区Clock基因表达水平差异无统计学意义(F=0.200,P=0.896)。雌性子代大鼠各组间SCN核区Clock基因表达水平差异有统计学意义(F=5.390,P=0.007),与对照组相比,50mg/kg DEHP剂量组雌性子代大鼠SCN核区Clock基因表达水平上调(P<0.05)。(2)雄性子代大鼠各组间SCN核区Arntl基因表达水平差异无统计学意义(F=0.293,P=0.830)。雌性子代大鼠各组间SCN核区Arntl基因表达水平差异无统计学意义(F=0.688,P=0.569)。(3)雄性子代大鼠各组间SCN核区Dbp基因表达水平差异有统计学意义(F=4.179,P=0.015),与对照组相比,10、50mg/kg DEHP剂量组雄性子代大鼠SCN核区Dbp基因表达水平下调(P<0.05)。雌性子代大鼠各组间SCN核区Dbp基因表达水平差异无统计学意义(F=1.837,P=0.170)。(4)雄性子代大鼠各组间SCN核区Per1基因表达水平差异无统计学意义(F=0.341,P=0.796)。雌性子代大鼠各组间SCN核区Per1基因表达水平差异有统计学意义(F=3.535,P=0.031),与对照组相比,50mg/kg DEHP剂量组雌性子代大鼠SCN核区Per1基因表达水平上调(P<0.05)。(5)雄性子代大鼠各组间SCN核区Per2基因表达水平差异无统计学意义(F=0.673,P=0.576)。雌性子代大鼠各组间SCN核区Per2基因表达水平差异无统计学意义(F=0.688,P=0.569)。(6)雄性子代大鼠各组间SCN核区CLOCK蛋白表达水平差异有统计学意义(F=3.271,P=0.043),与对照组相比,2、50mg/kg DEHP剂量组雄性子代大鼠SCN核区CLOCK蛋白表达水平下调(P<0.05)。雌性子代大鼠各组间SCN核区CLOCK蛋白表达水平差异有统计学意义(F=4.283,P=0.017),与对照组相比,2、50mg/kg DEHP剂量组雌性子代大鼠SCN核区CLOCK蛋白表达水平上调(P<0.05)。(7)雄性子代大鼠各组间皮质CLOCK蛋白表达水平差异无统计学意义(F=0.798,P=0.510)。雌性子代大鼠各组间皮质CLOCK蛋白表达水平差异无统计学意义(F=0.743,P=0.539)。(8)雄性子代大鼠各组间SCN核区DBP蛋白表达水平差异无统计学意义(F=2.199,P=0.121)。雌性子代大鼠各组间SCN核区DBP蛋白表达水平差异无统计学意义(F=2.045,P=0.140)。结论:(1)出生前DEHP暴露可能通过改变部分SCN核区昼夜节律调控相关基因和蛋白的表达水平干扰昼夜节律调控。(2)出生前DEHP暴露对大鼠SCN核区昼夜节律相关基因表达水平的影响可能与暴露水平有关。(3)出生前DEHP暴露对大鼠昼夜节律的干扰作用呈现性别差异。

关键词： 昼夜节律   肾脏   肝俞   生物钟  

摘要： 目的:观察针刺肝俞对无昼夜节律C57BL/6J小鼠肾内Clock与Bmal1基因节律表达和蛋白量表达的影响。方法:本实验采用360°全方位视频记录仪对C57BL/6J小鼠站立次数、自发活动情况进行检测和记录。将72只小鼠随机分为4组,空白组、模型组、肝俞组、非经非穴组,每组18只。在Light:08:00-20:00Dark:20:00-08:00的明暗交替的灯光下进行7天驯化。试验进行第8天,采用短时间睡眠剥夺法即2小时黑暗、2小时光照光暗交替造模5天,获得无昼夜节律模型。确认模型成功后,于试验第13天到17天,每天对肝俞组、非经非穴组在15:00进行捆绑和电针干预治疗,肝俞组频率2-15Hz,电流0.2mA,每次20分钟,每天电针1次,模型组(样本脱落2只,及时平时补入)和空白组不针刺只捆绑,实验进行的第18天早2点开始取材,间隔4小时一次,共取6次,每次每组取3只小鼠肾脏。用PCR和Western Blot法检测小鼠肾脏内Clock和Bmal1基因mRNA的表达水平和蛋白表达含量,并用余弦定理证明其基因表达的节律性。结果:1.采用2小时睡眠剥夺法对C57BL/6J小鼠造模,造模成功后,情绪激动、躁狂,活动度提高、站立次数增加,进食量减少、活动起始时间紊乱、毛发色泽改变、排便情况改变。模型组、肝俞组、非经非穴组与空白组比较,自发活动次数与站立次数明显增多(P<0.05)。2.干预后,模型组与肝俞组行为比较,自发活动次数与站立次数明显增多(P<0.05);肝俞组与非经非穴组行为比较,自发活动次数与站立次数减少,有统计学意义(P<0.05);非经非穴组与模型组行为比较,无统计学意义(P>0.05)。3.干预后,肝俞组中小鼠肾内Clock与Bmal1的mRNA拟合余弦曲线提示昼夜节律恢复节律性,具有统计学意义(P<0.3);模型组与非经非穴组小鼠肾内Clock与Bmal1的mRNA拟合余弦曲线提示昼夜节律无节律性,无统计学意义(P>0.3)。4.干预后,肝俞组与模型组、非经非穴组与空白组比较,小鼠肾内Clock基因的蛋白表达量增多,条带变宽,(P<0.05)具有统计学意义。模型组与肝俞组比较,表达量增加,条带变宽,(P<0.05)具有统计学意义。肝俞组与非经非组比较蛋白表达量降低,条带略细,(P<0.05)具有统计学意义。模型组与非经非穴组比(P>0.05),无统计学意义。5.干预后,肝俞组与模型组、非经非穴组与空白组比较,小鼠肾内Bmal1蛋白表达量减少,条带变窄,(P<0.05)具有统计学意义。模型组与肝俞组比较,表达量增加,条带变宽,(P<0.05)具有统计学意义。肝俞组与非经非组比较蛋白表达量降低,条带略细,(P<0.05)具有统计学意义。模型组与非经非穴组比(P>0.05),无统计学意义。结论:1.采用2小时睡眠剥夺法对C57BL/6J小鼠造模,可获得无昼夜节律小鼠模型。2.电针肝俞后可降低无昼夜节律C57BL/6J小鼠的站立次数和活动次数。3.电针肝俞对无昼夜节小鼠肾脏内Clock、Bmal1蛋白具有下调作用,可能是外周肝、肾时钟系统基因参与调控的作用,从而使无昼夜节律小鼠昼夜节律恢复。

关键词： Bmal1   RAW264.7   动脉粥样硬化   基因转染  

摘要： 目的:构建过表达昼夜节律基因Bmal1腺病毒载体,体外转染巨噬细胞。采用氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)刺激巨噬细胞,观察并评价对巨噬细胞泡沫化程度、迁移、炎症、凋亡的变化。方法:(1)选取小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象。分为Control组(空白对照组)、ox-LDL组(50μg/mL ox-LDL干预组)、Ad-GFP+ox-LDL组(空载腺病毒转染3天+50μg/mL ox-LDL干预组)和Ad-Bmal1+ox-LDL组(Bmal1腺病毒转染3天+50μg/mL ox-LDL干预组)。(2)荧光显微镜观察RAW264.7中腺病毒转染效率。(3)油红O染色检测不同昼夜节律时间点(0 h、6 h、12 h、24 h)RAW264.7细胞泡沫化程度。(4)Transwell小室法及划痕实验检测RAW264.7细胞的迁移。(5)流式细胞仪检测RAW264.7细胞的凋亡。(6)q RT-PCR检测Bmal1、IL6、IL10、Bax、Mcl1 m RNA的表达。(7)Western-Blot检测Caspase3、Caspase9蛋白表达水平。结果:(1)荧光显微镜下可见Ad-GFP+ox-LDL组和Ad-Bmal1+ox-LDL组表达明显的绿色荧光蛋白,表明重组腺病毒在体外转染效率高;Ad-Bmal1转染72 h后,Bmal1m RNA表达明显升高,表明Ad-Bmal1可以有效诱导Bmal1过表达。(2)油红O染色示:ox-LDL刺激6 h、12 h、24 h后,细胞内均可见明显的脂滴,且呈时间依赖性,脂滴面积在24 h时达到最大值。12 h、24 h组分别与0 h、6 h组相比细胞内脂滴面积增加(P<0.05)。(3)Transwell小室法及划痕实验检测示:50μg/mL ox-LDL可刺激正常的细胞发生明显迁移;但Ad-GFP、Ad-Bmal1对迁移无明显抑制作用。(4)流式细胞术检测示:与Control组相比,ox-LDL组细胞的凋亡比例增加(P<0.05);与Ad-GFP+ox-LDL组相比,Ad-Bmal1+ox-LDL组细胞的凋亡比例减少(P<0.05)。(5)在ox-LDL刺激12 h,与Ad-GFP+ox-LDL组相比,Ad-Bmal1+ox-LDL组细胞IL6 m RNA的表达水平下降,IL10 m RNA的表达水平上升(P<0.05)。(6)在ox-LDL刺激24 h,与Ad-GFP+ox-LDL组相比,Ad-Bmal1+ox-LDL组细胞Bax m RNA的表达水平下降,Mcl1 m RNA的表达水平上升(P<0.05)。(7)在ox-LDL刺激6、12 h,与Ad-GFP+ox-LDL组相比,Ad-Bmal1+ox-LDL组细胞pre-caspase3、pre-caspase9的蛋白表达水平下降(P<0.05)。(8)在ox-LDL刺激6、12、24 h,与Ad-GFP+ox-LDL组相比,Ad-Bmal1+ox-LDL组细胞cleaved-caspase3的蛋白表达水平下降(P<0.05)。结论:过表达昼夜节律基因Bmal1可以抑制ox-LDL刺激下巨噬细胞的炎症反应及凋亡效应,为探索昼夜节律在动脉粥样硬化中作用提供实验依据。

关键词： 动脉粥样硬化   生物钟基因   Clock/Bmal1   昼夜节律   糖脂代谢   炎症反应   内皮细胞功能  

摘要： 越来越多的证据表明,生物钟基因在人体组织代谢、肥胖、血管功能、炎症免疫反应等方面都发挥着重要作用,而Clock/Bmal1基因在昼夜节律的调节过程中起着至关重要的作用。在动脉粥样硬化(AS)的发生发展过程中糖脂代谢异常、炎症免疫反应以及血管内皮功能障碍均发挥着重要作用,Clock/Bmal1基因可以通过调节机体的糖脂代谢、炎症反应以及内皮细胞功能来影响AS的形成,这可为寻找AS相关性疾病新的预防和治疗靶点提供理论基础。

关键词： 内分泌干扰物   邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯   昼夜节律   基因  

摘要： 目的探讨出生前邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)暴露对成年后子代大鼠的昼夜节律相关基因表达的影响。方法将32只健康SD妊娠大鼠分为对照(玉米油)组和2、10、50 mg/kg DEHP染毒组,每组8只。在母鼠妊娠第14日至19日进行灌胃染毒,每日1次。子代大鼠于10周龄时,采用实时荧光定量PCR法检测下丘脑SCN核区Clock、Arntl、Dbp、Period1和Period2 5个昼夜节律相关基因的表达水平。结果与对照组相比,10、50 mg/kg DEHP染毒组成年雄性子代大鼠下丘脑SCN核团Dbp基因的表达水平下调,差异均有统计学意义(P<0.05);而各剂量组DEHP染毒组成年雄性大鼠下丘脑SCN核团的Clock、Arntl、Per1、Per2基因的表达水平均无明显改变。与对照组比较,50mg/kg DEHP染毒组成年雌性子代大鼠下丘脑SCN核团的Clock、Per1基因的表达水平均升高,差异有统计学意义(P<0.01);而各剂量DEHP染毒组成年雌性子代大鼠下丘脑SCN核团的Arntl、Dbp、Per2基因的表达水平均无明显改变。结论出生前DEHP暴露可能通过改变大鼠下丘脑SCN核区昼夜节律相关基因的表达影响成年后大鼠的昼夜节律调控功能,且这种影响具有性别差异。

关键词： 缺血性心脏病   时钟基因   昼夜节律  

摘要： 缺血性心脏病是一种常见的临床疾病。心肌组织缺血缺氧导致心肌细胞坏死,进而产生心脏泵血功能以及循环障碍,严重影响人类健康及生活质量。研究表明,急性心肌梗死的发生率在一日中呈周期性节律振荡,并在早晨至上午这一时段达到高峰。时钟基因与昼夜节律参与缺血性心脏病病程的机制已成为近年来研究的重点。大量研究表明,时钟基因与昼夜节律的紊乱通过调节代谢、自噬与氧化应激水平,介导血管损伤,影响心肌缺血/再灌注损伤,在缺血性心脏病的发生发展中发挥着重要作用。