关键词： 脑缺血再灌注   昼夜节律   时钟   内质网应激   凋亡  

摘要： 目的:缺血性脑卒中是致死高危、致残高危的中枢神经系统疾病。缺血性脑卒中的发病机制复杂,急性期的血管再通治疗常引起缺血脑组织的再灌注损伤。临床研究发现,不同时间点发生的缺血性脑卒中,其发病率、预后差别较大,这与昼夜节律密切相关。在生物体内,昼夜节律的分子生物学基础是昼夜节律基因(Circadian gene)。昼夜节律基因参与机体的生理病理过程,通过调节内质网应激、细胞自噬、细胞凋亡等作用,影响中枢神经系统疾病(如阿尔茨海默病、脑卒中、帕金森病)的发生、发展。研究表明,昼夜节律作用于缺血性脑卒中的发病过程,是通过昼夜节律基因参与调节的,但其具体过程有待于研究。本研究拟观察昼夜节律运动输出周期蛋白质产量(Circadian Locomotor Output Cycles Kaput,Clock)在大鼠脑缺血再灌注后的作用机制,探讨节律基因通过内质网应激途径,对缺血神经细胞功能的影响,从蛋白质组学及细胞凋亡方面阐述相关分子机制,旨在为脑缺血再灌注损伤的发病机制提供新的依据。方法:分别在四个不同的Zeitgeber(德语,时间的给予者,表示实验室环境时间)时间点(ZT0,ZT6,ZT12,ZT18;6:00,12:00,18:00,24:00)构建大鼠大脑中动脉栓塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion)模型,以模拟体内局灶性脑缺血再灌注(Focal Cerebral Ischemia/Reperfusion)损伤。免疫印迹观察不同时间点Clock蛋白的表达水平;TTC染色评估梗死灶体积;Longa评分评估神经功能缺损;TUNEL-DAPI染色评估神经元凋亡;二维凝胶电泳(2D-PAGE)联合质谱(MALDI TOF/TOF MS)观察不同时间点,差异蛋白质组的表达水平;生物信息学方法预测可能的下游信号通路;免疫印迹观察下游内质网应激及线粒体凋亡途径相关蛋白的表达情况。结果:脑缺血再灌注损伤后,缺血皮层Clock表达ZT0(6:00)低,ZT12(18:00)高(p<0.05)。和ZT0相比,ZT12时脑梗死体积减少(p<0.01)。和ZT0相比,ZT18时神经功能缺损评分降低(p<0.05)。与ZT6相比,ZT18的完整神经元个数增加(p<0.05)。与ZT0相比,ZT12(p<0.0001)和ZT18(p<0.001)时DNA片段减少。与ZT0相比,ZT12(p<0.05)和ZT18(p<0.05)时内质网应激蛋白ATF4减少。在ZT0和ZT18两组间,用2D-PAGE联合MALDI TOF/TOF MS发现共749个差异表达蛋白质(p<0.05),成功鉴定其中8个蛋白。与ZT0相比,ZT18时Ppp1cb、Ttr、Fahd2升高,Vdac1、LOC100911515、Atp6v0d1、Idh3g、Atp6v1b2降低。它们的信号通路涉及导管酸分泌、代谢途径、突触小泡循环和内质网应激途径。结论:脑缺血再灌注损伤的严重程度呈现时间依赖性表达,其可能机制是脑缺血再灌注发生后,昼夜节律基因Clock通过内质网应激途径,影响缺血神经细胞凋亡的严重程度。

关键词： 动脉粥样硬化   牙龈卟啉单胞菌   生物钟   BMAL1   NF-κB信号通路  

摘要： 背景:动脉粥样硬化性心血管疾病(ACVDs)是全世界死亡的主要原因。动脉粥样硬化是ACVDs的病理基础,现在多被认为是一种慢性炎症过程。除了与心血管系统本身相关的危险因素外,与牙周病相关的牙龈卟啉单胞菌(***)等致病菌也与动脉粥样硬化的发生密切相关,但其潜在机制仍不明确。生物钟异常也是动脉粥样硬化的危险因素,且细菌感染与生物钟之间存在相互作用,但牙周源性细菌与生物钟的相关性尚未见报道。目的:阐明***加速动脉粥样硬化的机制,探讨生物钟是否参与该过程,并探寻动脉粥样硬化性心血管疾病的治疗新策略。方法:收集临床粥样硬化动脉样本,PCR检测牙周致病菌,特别是***的存在。以Apo E-/-小鼠为动脉粥样硬化模型,同时,构建Bmal1-/-Apo E-/-小鼠及条件性内皮细胞Bmal1敲除小鼠(Bmal1fl/fl;Tek-Cre小鼠)。鼠尾静脉注射***,16周后油红O染色测量主动脉及主动脉根部动脉粥样硬化斑块面积,二氢乙锭检测动脉氧化应激水平,免疫组化、ELISA检测促炎细胞因子表达水平,q RT-PCR及Western blot检测钟基因表达情况,据此评估***和生物节律核心基因BMAL1对动脉粥样硬化斑块形成的影响及两者之间的相互关系。体外培养人主动脉内皮细胞,***感染,结合转录组测序、慢病毒转染、Ch IP、Co-IP、Luciferase等分子生物学实验技术进一步研究BMAL1在***促进的动脉粥样硬化过程中的作用,深入探讨***与BMAL1之间的相互影响,阐明其内在分子机制。结果:临床粥样硬化动脉样本中检测出多种牙周致病菌的DNA,***检出率最高。且***通过引起动脉氧化应激和炎症反应,加速动脉粥样硬化的发展,在此过程中还伴随有生物节律的紊乱,特别是钟基因BMAL1的表达下降。生物节律紊乱加重了***引起的动脉粥样硬化进展。机制实验结果显示***感染激活TLRs-NF-κB信号转导轴,促进p65磷酸化入核,随后募集DNMT-1增强BMAL1启动区域甲基化,抑制BMAL1转录。BMAL1的下调使得CLOCK释放并与p65结合,磷酸化p65上调NFKB2表达,进一步增强NF-κB信号传导,增强人主动脉内皮细胞的氧化应激和炎症反应。此外,小鼠模型显示甲硝唑和褪黑素的联合用药可明显减轻动脉粥样硬化斑块形成。结论:***通过NF-κB-BMAL1-NF-κB信号传导回路促进动脉粥样硬化。褪黑素和甲硝唑有望成为ACVDs的辅助治疗药物。

关键词： 右美托咪定   miR-142-3p   昼夜节律基因   海马神经元   增殖   凋亡  

摘要： 目的本研究旨在探讨右美托咪定通过miR-142-3p作用于昼夜节律基因（ARNTL）调节神经元增殖及凋亡的影响。方法将一半大鼠海马元代神经元细胞分为对照组（未进行任何处理）和实验组(50μmol·L;右美托咪定),对照组予以等体积的培养基液。其次,再将另一半细胞大鼠海马元代神经元细胞分为空白组（未进行任何处理）、过表达组（转染miR-142-3p模拟物）、抑制表达组(转染miR-142-3p抑制剂;通过实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印记法检测miR-142-3p及ARNTL表达;通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）检测细胞增殖;通过流式细胞术检测细胞凋亡。通过双荧光素酶报告基因实验验证ARNTL与miR-142-3p的靶向关系。结果给药48 h后,实验组和对照组的海马神经元细胞增殖率分别为（1.65±0.08）%和（1.03±0.06）%;细胞凋亡率分别为（3.94±0.15）%和（9.65±0.13）%;miR-142-3p相对表达量分别为1.66±0.14和1.05±0.12;ARNTL基因相对表达量分别为0.85±0.06和0.96±0.19,差异均有统计学意义（均P<0.05）。空白组、过表达组和抑制表达组的miR-142-3p基因相对表达量分别为1.06±0.11,5.24±0.32和0.52±0.06;ARNTL基因相对表达分别为1.02±0.09,0.63±0.12和3.46±0.14;细胞增殖率分别为（1.11±0.10）%,（1.72±0.09）%和（0.62±0.08）%;细胞凋亡率分别为（5.44±0.16）%,（3.56±0.15）%和（7.52±0.15）%,过表达组分别与空白组和抑制表达组比较,差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论右美托咪定通过miR-142-3p/ARNTL增强海马神经元细胞增殖、抑制神经元细胞凋亡。

关键词： 职业有害因素   剂量反应关系   肥胖   节律基因   交互作用  

摘要： 目的探讨职业有害因素(高温、噪声、粉尘、一氧化碳、倒班)和昼夜节律相关基因及其交互作用对钢铁工人肥胖的影响。方法基于课题组建立的京津冀地区职业人群健康效应队列研究的基线资料,采用现况研究的方法,以整群抽样的形式抽取7664名某钢铁企业生产部门在职员工为研究对象,通过问卷调查和体格检查收集相关信息,应用限制性立方样条模型(Restricted cubic spline,RCS)和多因素Logistic回归模型分析职业有害因素组以及其他因素与肥胖患病风险之间的剂量反应关系和交互作用。采用成组设计病例对照研究,根据研究对象的纳入排除标准,选择394名男性肥胖患者和581名男性对照作为研究对象。筛选出4个符合条件的昼夜节律相关基因位点,采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)—限制性片段长度多态性确定目标基因位点的基因型,使用多因素Logistic回归模型、广义多因子降维法(Generalized multifactor dimensionality reduction,GMDR)分析基因-基因、基因-环境之间的交互作用与肥胖患病风险之间的关联。结果1纳入研究对象7664人,其中男性7031人,女性633人,肥胖患病率为22.26%(1706/7664),其中男性肥胖患病率为23.13%(1626/7031),女性肥胖患病率为12.64%(80/633),男性明显高于女性(P<0.01)。研究对象平均体质指数(Body mass index,BMI)为25.2 kg/m2;2调整年龄、性别、家庭人均月收入、饮食评分、体力活动水平、吸烟、饮酒、文化程度、睡眠时间、加权倒班作业指数(Weighted shift index,WSI)、高温、噪声、粉尘、CO累积暴露量(Cumulative exposure measurement,CEM)后,以各职业有害因素CEM=0作为参照,发现WSI、高温、噪声、粉尘、CO CEM与肥胖之间存在非线性剂量反应(模型总体关联性检验P<0.05;非线性检验P<0.05);3多因素Logistic回归模型结果显示以年龄20～岁作为参照,年龄为30～岁和50～岁均可降低肥胖发病风险,OR(95%CI)分别为0.721(0.540～0.963)和0.552(0.400～0.762);CO CEM在52.24～mg/m3·年组较不暴露组CO组肥胖发病风险降低,(OR=0.673,95%CI:0.393～0.953);4年龄、吸烟、噪声CEM对WSI与肥胖之间的关系存在效应修饰作用(Pinteraction<0.05);年龄、性别、睡眠时间、CO CEM对高温CEM与肥胖之间的关系存在效应修饰作用(Pinteraction<0.05);年龄、吸烟、粉尘CEM对噪声CEM与肥胖之间的关系存在效应修饰作用(Pinteraction<0.05);饮食评分、文化程度对粉尘CEM与肥胖之间的关系存在效应修饰作用(Pinteraction<0.05);5 RORA基因rs8034880位点基因型GG相比AA+AG,肥胖患病风险上升43%(OR=1.43,95%CI:1.05～1.94);MTNR1A基因rs2119882位点基因型CC相比TT+TC,可降低肥胖的发病风险(OR=0.60,95%CI:0.40～0.89),基因型TC相比TT+CC,肥胖患病风险上升(OR=1.44,95%CI:1.10～1.87);6未发现CLOCK基因rs1801260位点和PRE2基因rs2304672位点基因多态性与肥胖相关(P>0.05);7 CLOCK基因rs1801260位点和MTNR1A基因rs2119882位点存在相乘交互作用(Pinteraction=0.020);8在调整相关混杂因素后,未发现各基因与职业有害因素组之间存在基于相乘模型的交互作用(Pinteraction>0.05)。结论1 WSI、高温、噪声、粉尘、CO累积暴露量与肥胖患病风险之间存在非线性剂量反应关系;2 RORA基因rs8034880位点与MTNR1A基因rs2119882位点多态性与肥胖有关;3 MTNR1A基因rs2119882位点和CLOCK基因rs1801260位点之间存在基于相乘模型的交互作用;图9幅;表30个;参100篇。

关键词： 乌龙茶多酚   提取   肠道菌群   昼夜紊乱  

摘要： 茶叶在世界范围内,都广受人们欢迎。乌龙茶是一种半发酵茶,虽然它含有多种化合物,但其有效成分主要归因于多酚部分。茶多酚是重要的生物活性物质,一直以来成为医药和食品研究领域的热点之一。鉴于此,本研究以乌龙茶为原料,分别对其多酚的提取工艺、对肠道微生态的调节功能和对肝脏时钟基因的调节作用进行了研究。主要结果如下:1、选择提取因素(液料比、提取温度和提取时间),进行单因素试验。基于单因素试验,选择提取参数的组合进行三因素三水平的中心组合设计实验。然后通过DesignExpert软件分析数据,获得乌龙茶多酚(oolong tea polyphenols,OTP)的最佳提取参数:液料比17 mL/g、提取温度91°C、提取时间42 min,茶多酚的产量最高达到140.24 mg/g。2、采用16S rDNA测序技术,分析了OTP对昼夜紊乱小鼠肠道菌群多样性和特定菌群丰度的影响。结果发现,OTP干预8周后,小鼠肠道菌群多样性和节律性OTU的数量得到改善;在门水平上,观察到拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度的升高和厚壁菌门(Firmicutes)丰度的降低,并且Firmicutes/Bacteroidetes(F/B)的比值也显示出显著降低;改善了由持续黑暗引起的拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)的周期性变化;在属水平上,提高了小鼠肠道菌群中普雷沃氏菌属(Prevotella)和拟杆菌属(Bacteroides)的相对丰度,降低了梭菌属(Clostridium)的相对丰度;显著改善了普雷沃氏菌属(Prevotella)、拟杆菌属(Bacteroides)和梭菌属(Clostridium)的周期性变化。3、采用转录组测序技术,评估了OTP对昼夜紊乱小鼠肝脏基因的影响。结果发现,OTP干预8周后,提高了小鼠肝脏中具有节律性的基因数量并改善了肝脏时钟基因(Bmal1、Clock、Cry1、Cry2、Per3和Sirt1)的表达水平;CD-OTP组与CD组差异基因GO富集分析显示,这些基因主要富集在转录调控与DNA模板化、转录与DNA模板化、细胞质、细胞膜、蛋白质结合和金属离子结合等通路;OTP干预后差异基因富集的KEGG通路主要包括粘着斑(9 DEGs)和PI3K-Akt信号传导途径(9 DEGs);差异基因显著富集的途径主要包括类固醇生物合成、萜类骨架生物合成和粘附连接等。

关键词： 酸枣仁汤   阿尔茨海默病   睡眠障碍   昼夜节律   节律基因   机制  

摘要： 目的:观察酸枣仁汤对6月龄APP/PS1双转基因痴呆小鼠昼夜节律及视交叉上核(SCN)节律基因表达的影响。方法:将小鼠随机分为空白组,模型组,多奈哌齐组,酸枣仁汤低、高剂量组。给予对应的药物后,用自发活动实验视频分析系统记录小鼠自主活动时间,采用Real time-PCR检测SCN中Per1、Cry1、Clock、Bmal1mRNA表达水平。结果:与空白组比较,APP/PS1组小鼠光照环境活动时间、总活动时间显著增加(P<0.01)。与空白组比较,模型组小鼠光照环境活动时间、黑暗环境活动时间和总活动时间显著增加(P<0.01);与模型组比较,多奈哌齐组、酸枣仁汤低剂量组和酸枣仁汤高剂量组小鼠光照环境活动时间、黑暗环境活动时间和总活动时间显著减少(P<0.05,P<0.01);与多奈哌齐组比较,酸枣仁汤高剂量组小鼠光照环境活动时间、黑暗环境活动时间和总活动时间显著减少(P<0.05)。与空白组比较,模型组小鼠SCN中Per1、Cry1、Clock、Bmal1 mRNA表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,多奈哌齐组和酸枣仁汤高剂量组小鼠SCN中Per1、Cry1、Clock、Bmal1 mRNA表达水平显著下降(P<0.01),酸枣仁汤低剂量组小鼠SCN中Per1、Clock mRNA表达水平显著下降(P<0.05)。与多奈哌齐组比较,酸枣仁汤低剂量组小鼠SCN中Per1、Cry1、Bmal1 mRNA表达水平显著升高(P<0.05,P<0.01)。结论:6月龄APP/PS1双转基因痴呆小鼠有昼夜节律失调表现,酸枣仁汤可以改善其昼夜节律,其机制可能与其调节小鼠SCN中节律基因Per1、Cry1、Bmal1、Clock mRNA的表达有关。

关键词： Circadian rhythm   Acrolein   MMP9   MAPK pathways   Gut microbiota  

摘要： Circadian rhythm is believed to play important roles in atherosclerosis. The gut microbiota is found to be closely related to atherogenesis, and shows compositional and functional circadian oscillation. However, it's still unclarified whether circadian clock and intestinal microbiota are involved in the progression of atherosclerosis induced by environmental pollutant acrolein. Herein, patients with atherosclerosis showed higher MMP9, a promising biomarker for atherosclerosis, and lower Bmal1 and Clock expression in the plasma. Interestingly, acrolein exposure contributed to the increased MMP9, decreased Clock and Bmal1, and activated MAPK pathways in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). We found that knockdown of Clock or Bmal1 lead to upregulation of MMP9 in HUVECs, and that Clock and Bmal1 expression was elevated while MAPK pathways were blocked. Atherosclerotic apolipoproteinE-deficient mice consumed a high-fat diet were used and treated with acrolein (3 mg/kg/day) in the drinking water for 12 weeks. Upregulation of MMP9, and downregulation of Clock and Bmal1 were also observed in plasma of the mice. Besides, acrolein feeding altered gut microbiota composition at a phylum level especially for an increased Firmicutes and a decreased Bacteroidetes. Additionally, gut microbiota showed correlation with atherosclerotic plaque, MMP9 and Bmal1 levels. Therefore, our findings indicated that acrolein increased the expression of MMP9 through MAPK regulating circadian clock, which was associated with gut microbiota regulation in atherosclerosis. Circadian rhythms and gut microbiota might be promising targets in the prevention of cardiovascular disease caused by environmental pollutants. (C) 2019 Elsevier Ltd. All rights reserved.

关键词： 心绞痛   血压   昼夜节律   冠状动脉疾病   颈动脉疾病   动脉粥样硬化  

摘要： 目的探讨心绞痛患者血压昼夜节律与冠状动脉及颈动脉粥样硬化的关系。方法以2012年1月至2016年12月在本院经冠脉造影确诊的心绞痛患者279例为研究对象,行24 h动态血压监测,根据夜间血压下降10%为标准,将患者分为杓型组(115例)和非杓型组(164例),比较两组间的临床特点、生化指标、冠状动脉狭窄程度(Gensini积分)、颈动脉内膜中层厚度(IMT)及斑块比例。结果⑴非杓型组和杓型组间年龄、性别构成、脑卒中、糖尿病、高血压、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、尿素氮比较差异无统计学意义(P> 0. 05),非杓型组血清肌酐浓度明显高于杓型组(P <0. 05)。两组夜间平均收缩压比较差异有统计学意义(P <0. 05),而全天平均收缩压及舒张压、白天平均收缩压及舒张压、夜间平均舒张压组间比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。⑵非杓型组Gensini评分、颈动脉IMT明显高于杓型组,差异有统计学意义(P <0. 05),颈动脉斑块比例组间差异无统计学意义(P> 0. 05)。⑶多因素logistic回归分析提示Gensini评分、IMT、血清肌酐浓度、夜间平均收缩压是血压昼夜节律的独立相关因素(P <0. 05)。结论冠状动脉狭窄程度、IMT、血清肌酐浓度、夜间平均收缩压与血压的昼夜节律相关。

关键词： 昼夜节律   时钟基因   癫痫   Kcna1缺失   Sirtuin  

摘要： 许多神经系统疾病都会影响昼夜节律。尽管已知癫痫常伴睡眠障碍,但与癫痫昼夜节律紊乱相关的数据却很少。文章检验了Kcna1缺失小鼠的昼夜休息活动以及睡眠-觉醒模式。该小鼠模型表现出反复自发癫痫发作,也是研究癫痫猝死的模型。此外,研究试图确定癫痫发作以及核心时钟基因和调节因子Sirtuin 1(Sirt1)的异常变化是否与昼夜节律紊乱有关。研究使用被动红外活动记录仪评估休息活动模式,使用脑电图(EEG)进行癫痫发作和睡眠分析,并且使用逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹法评估时钟基因和Sirt1在Kcna1缺失和野生型小鼠中的表达情况。癫痫Kcna1缺失动物模型存在昼夜休息活动模式紊乱,趋于表现出延长的昼夜节律。EEG分析证实了睡眠结构的破坏,清醒时间更多并且睡眠不足。尽管所有癫痫小鼠都表现出昼夜休息活动模式的紊乱,但该研究发现实际癫痫发作负担与睡眠紊乱程度之间没有相关性。发现前下丘脑中几个时钟基因(即Clock,Bmal1,Per1和Per2)和昼间Sirt1 mRNA的衰减振荡。几个核心时钟基因的振荡衰减与Kcna1缺失小鼠中观察到的异常昼夜休息活动以及睡眠-觉醒模式改变相关,可能是其基础原因,并可能导致癫痫晚期并发症,例如癫痫猝死。Sirt1可能是恢复生物钟基因节律和癫痫睡眠模式的潜在治疗靶点之一。