关键词： 类风湿关节炎   白三烯B4   调节性T细胞   Th17细胞分化   免疫应答   调节作用  

摘要： 目的：类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种病因不明的慢性炎症性自身免疫性疾病，基本病理改变主要是外周关节滑膜慢性炎症及软骨和骨质的破坏。大量研究表明，RA的发病与初始T辅助细胞（naive CD4+T cell，Th0）细胞亚群分化有密切联系，随着研究的深入，人们发现naiveCD4+T细胞另外两种亚型Th17和调节性T细胞（Treg）细胞在RA免疫应答失衡及炎症反应中发挥着重要作用。<br>　　 白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）是花生四烯酸经5-脂氧合酶（5-LO）代谢的炎症介质，具有很强的趋化作用和炎症调节作用。在RA患者的滑液中，LTB4的含量明显升高。LTB4受体阻断剂或敲除LTB4受体的小鼠，均可阻止关节炎症的发生。可见LTB4是RA发病过程中的重要炎性介质。LTB4是否可影响naiveCD4+Tcell向Treg和Th17方向分化，国内外文献尚未有报道。本研究通过观察LTB4对C57BL/6小鼠脾细胞naive CD4+T cell向Treg和Th17细胞分化的调节作用；并且在CIA小鼠体外实验观察LTB4对Treg与Th17细胞的影响；以期进一步揭示LTB4在类风湿关节炎发病过程中的免疫调节作用。<br>　　 1 LTB4对Treg/Th17细胞分化的调节<br>　　 方法：<br>　　 （1）磁珠分选C57BL/6小鼠脾脏CD4+CD62L+naive T细胞。收集分选后细胞，种于预先anti-CD3ε包被的24孔板，加入anti-CD28、TGF-β1及IL-6，体外诱导CD4+CD62L+naive T细胞向Th17方向分化；种于预先anti-CD3ε包被的24孔板，加入anti-CD28及TGF-β1，体外诱导CD4+CD62L+naive T细胞向Treg方向分化；并观察转录因子RORγt及Foxp3时间依赖性表达。<br>　　 （2）LTB4对naive CD4+T cell向Th17细胞定向分化的影响。分为四组：对照组（control组）；LTB4（0.01μM、0.1μM、1μM）组。孵育72小时，收集细胞上清，酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒检测IL-17。孵育48小时，荧光定量PCR技术检测RORγt的mRNA的表达。<br>　　 （3）LTB4对naive CD4+T cell向Treg细胞定向分化的影响。细胞孵育72小时流式细胞术观察CD4+CD25+Foxp3+细胞数量，分为五组：同型对照组；对照组（control组）；LTB4（0.01μM、0.1μM、1μM）组。孵育36小时荧光定量PCR技术检测Foxp3的mRNA的表达，分为四组：对照组（control组）；LTB4（0.01μM、0.1μM、1μM）组。<br>　　 结果：数据用均数±标准差（Mean±SD）表示，用SPSS11.5统计分析软件进行统计学分析。各组均数的比较行单因素方差分析（ANOVA），用最小显著差法（least significant difference，LSD）作两两比较，P<0.05为有显著性差异。<br>　　 （1）经磁珠分选后，经流式细胞仪鉴定CD4+CD62L+naive T细胞纯度在90％以上。在抗CD3/CD28存在的条件下，TGF-β1作用3d后可使（10.8667±0.9504）％细胞分化为Treg细胞；在抗CD3/CD28存在的条件下，TGF-β1和IL-6作用3d后IL-17含量（677.8875±87.7284）较对照组明显升高（P<0.01），表明诱导成功。转录因子Foxp3与RORγt mRNA的表达分别在36h及48h达到高峰。<br>　　 （2）LTB4对naive CD4+T cell向Th17细胞定向分化的影响。应用ELISA法在诱导72h时检测细胞上清IL-17含量，发现LTB4能剂量依赖性升高IL-17的含量，其中LTB4（0.1、1μM）组（865.4775±88.3310、952.9575±71.7512）较对照组（677.8875±87.7284）明显增加（P<0.01）。LTB4在naive T细胞向Th17细胞诱导分化48h时剂量依赖性促进了RORγtmRNA的表达，LTB4（0.01μM、0.1μM、1μM）三个剂量组（1.1933±0.0321、1.4260±0.0661、1.5180±0.0530）均较对照组（1.0000±0.0000）明显升高（P&

关键词： 天然调节性T细胞   体外扩增   抗CD3和抗CD28抗体   同系骨髓分化树突状细胞   扩增的调节性T细胞   移植物抗宿主病   宿主抗移植物病   直接途径   间接途径   混合淋巴细胞培养   过继性输注   共刺激分子   B7-1   B7-2   调节性T细胞   内环境稳定  

摘要： 第一部分天然调节性T细胞的分离及两种体外扩增方法的比较 【目的】平行对比分析使用抗体或骨髓分化的树突状细胞（bonemarrow deriveddendritic cell，BM-DC）体外扩增天然调节性T细胞（Treg）的的效率和扩增质量。 【方法】将Treg用生物素偶联的抗体anti-CD25标记后用一步阳性分选法从卵清蛋白（ovalbumin，OVA）特异性TCR转基因小鼠DO11．10外周淋巴组织分离，分别用功能性抗CD3和抗CD28抗体（anti-CD3／CD28）或加载OVA多肽的同系骨髓分化的树突状细胞（bone marraw derived dendritic cell，BM-DC）在高浓度外源性IL-2的辅助下刺激增殖1～4周。检测2种方案的细胞扩增倍数，扩增细胞的活性和纯度，特征性细胞表型以及免疫学特性。 【结果】两种方案均可以扩增出纯度＞90％CD4+Foxp3+Treg，虽然扩增的Treg均高表达CD25和Foxp3且保持了Treg的无反应性和特殊的细胞因子分泌谱（不分泌或低分泌IL-2和IFN-γ，高分泌IL-10），但DC方案的扩增效率更高，扩增的Treg具有更好的活性和纯度 【结论】同系骨髓分化的树突状细胞比抗CD3和抗CD28抗体对Treg具有更高的扩增效率和扩增质量 第二部分扩增调节性T细胞体内外抑制同种异体免疫反应能力的分析比较 【目的】平行比较2种方案扩增的Treg在体内和体外抑制同种异体抗原的直接提呈和间接提呈引发的免疫排斥反应的能力。 【方法】体外功能试验中，将扩增的Treg加入到模拟体内移植物抗宿主病（graftversus host disease，GVHD）和宿主抗移植物病（host versues graft disease，HVGD）直接和间接抗原提呈的3种混合淋巴细胞培养体系中：①BABL/c DC／OVA+B6 CD4+T，②B6 DC+BABL／c CD4+T+BABL／c DC／OVA和③Ba DC／OVA／B6 Ag+B6 CD4+T，检测其免疫抑制活性；在体内功能试验中，扩增Treg和B6 DC过继性输注到预先植入OVA渗透泵的BABL／c小鼠体内，5天后获取淋巴细胞用B6 DC进行继发性刺激检测Treg的免疫抑制活性。用流式仪检测细胞增殖和分泌IFN-γ的效应T细胞比例，用ELISA试剂盒检测上清中的细胞因子IL-2和IFN-γ含量。 【结果】与抗体扩增的Treg相比，虽然BM-DC扩增的Treg抑制同种异体反应性T细胞增殖的能力略弱，但却能更有效地阻断同种异体反应性T细胞向分泌IFN-γ的效应细胞分化。只有BM-DC扩增的Treg可以在体内存活并抑制宿主对同种异体抗原刺激的免疫反应。 【结论】BM-DC扩增的Treg能更适合于器官移植领域的治疗性应用 第三部分共刺激分子B7-1和B7-2对天然调节性T细胞发育和体内稳态影响 【目的】研究共刺激分子B7-1和B7-2对Freg在胸腺内发育和外周内环境稳定的相对作用，为改进阻断CD28／B7共刺激信号通路的移植耐受方案提供参考。 【方法】用流式细胞仪对比分析野生型及B7-1或（和）B7-2敲除B6小鼠胸腺和外周淋巴组织中CD4+CD25+Foxp3+T细胞的比例，并比较从野生型和B7分子敲除小鼠获得的骨髓分化的树突状细胞（BM-DC）在体外维持和扩增Treg的能力以及刺激同种异体免疫反应的能力。 【结果】虽然B7-1或B7-2的缺失都可引起胸腺内Treg比例下降30％，但是B7-2可维持外周85％的Treg，而B7-1仅能维持65％。另一方面缺乏B7-2而非B7-1提供的共刺激信号可以有效阻断DC刺激同种异体反应T细胞的能力。 【结论】虽然B7-2在维持调节性T细胞外周内环境稳定方面发挥更重要作用，但与完全切断CD28／B7共刺激通路相比，选择性阻断B7-2可以有效地抑制同种异体免疫排斥反应同时对调节性T细胞的影响较小。

关键词： 调节性树突状细胞   调节性B细胞   IFN-β   IL-10   CD40   免疫调节  

摘要： 树突状细胞（Dendritic cell, DC）是目前已知的体内功能最强大的专职抗原提呈细胞,能够整合一系列的外来病原体信号并将其传递给淋巴细胞,启动合适的免疫应答反应。未成熟DC在微生物感染或移植后识别、吞噬外源性抗原,可快速成熟。成熟DC的吞噬能力减弱,但细胞表面共刺激分子和粘附分子的表达上调,并分泌促炎症细胞因子,启动初始的T细胞介导的免疫应答反应。近年来,越来越多的研究表明DC是一种异质性的细胞群体,分布于不同的解剖部位,含有不同的细胞亚群,处于不同的成熟阶段,表达不同的表型和细胞因子,其功能也是多样性的。其中,具有负向免疫调控作用的DC亚群的发现及其功能特点与作用机制的研究是该领域近年来的重要进展之一,此类具有负向免疫调控作用的DC亚群被称为调节性DC （Regulatroy DC）。目前认为,调节性DC主要通过选择性的诱导Th2型的免疫应答或促使初始CD4+和CD8+ T细胞分化为分泌IL-10的调节性T细胞来负向调控免疫应答。 在前期的研究中,我们发现以往被认为终末分化细胞的成熟DC,与脾基质细胞共培养后能够进一步增殖并分化为一类能够通过分泌NO而抑制T细胞增殖的新型调节性树突状细胞,我们将之命名为“分化样树突状细胞”（Differentiated dendritic cell,diffDC）,从而提出了成熟DC并非均为终末分化细胞的观点,其在完成了抗原递呈任务之后,在次级淋巴器官微环境的作用下,仍能够进一步增殖分化,从而被赋予了新的生命与功能。我们进一步对于diffDC这一新型调节性DC亚群的性质与功能特点进行了研究,发现了ERK的高度磷酸化和p38的低活化与diffDC的独特细胞因子谱（高表达IL-10而低表达IL-12）的表达密切相关。在不同的生理或病理情况下,diffDC与周围很多免疫细胞存在相互作用,彼此精密调节,例如可以通过分泌IL-10活化NK细胞而导致自身的杀伤,并通过分泌IP-10选择性地趋化Th1细胞并抑制其增殖,从而维持机体的稳态。而B细胞是免疫系统中的一种主要细胞,能够通过产生抗体在体液免疫中发挥着中心作用,也可以作为抗原提呈细胞,通过产生细胞因子,提供抗原信息和共刺激信号以促进CD4+ T细胞向Th1还是Th2分化,来调节CD4+ T细胞对外来或自身抗原的免疫反应。在脾脏淋巴细胞中B细胞约占50%,在免疫反应的后期,脾脏中的具有独特调节功能的diffDC有可能会与B细胞相遇。那么diffDC能否作用于B细胞,调控B细胞的功能?如果具备此功能,其生物学意义及其相关的作用机制又是什么呢? 鉴于目前尚未见调节性DC参与B细胞功能调控的报道,我们在本研究中分为两部分内容,分别围绕调节性DC对B细胞的调控作用及其相关的机制进行了探讨。 一、调节性树突状细胞诱导高分泌IL-10的新型调节性B细胞的产生 在本部分实验中,我们研究了调节性DC（diffDC）对B细胞功能的调控作用。首先,我们将diffDC在体外与脾脏来源的B细胞共培养,观察共培养后,B细胞的增殖、抗体分泌和凋亡情况。结果表明,diffDC不能引起B细胞凋亡,对B细胞的增殖也没有明显影响。与imDC和maDC一样,diffDCs也能诱导B细胞分泌IgM和IgG,这与原来文献报道DCs可诱导B细胞合成IgM和IgG是一致的。我们又进一步检测了diffDC对B细胞分泌细胞因子谱的影响。结果发现,diffDCs不影响B细胞分泌IL-12、IFN-γ、IL-6、IP-10、PGE2和TGF-β等细胞因子,但是让我们感兴趣的是,diffDC和B细胞共培养后产生的IL-10水平显著高于imDC或maDC与B细胞共培养对照组。diffDC与B细胞按不同的比例共培养均能诱导高水平的IL-10分泌,其中diffDC和B共培养比例为1:5的情况下,所诱导产生的IL-10水平最高,1:10的共培养比例次之。由于1:10的diffDC与B细胞共培养比例更接近于体内DC和B细胞的比例,因此,我们在随后的实验体系中均选择了这一比例进行DC和B细胞的共培养。diffDC和B细胞共培养后24小时IL-10的分泌就出现显著升高,48小时达到高峰。胞内染色流式检测确证IL-10主要来源于B细胞。以上结果提示我们,diffDC有可能作用于B细胞,诱导B细胞向高分泌IL-10的调节性B细胞分化。 随后我们探讨了diffDC能否对B细胞的表型产生影响。我们用流式筛选了一系列的膜表面分子,最后发现diffDC诱导B细胞高表达CD19、CD16/CD32和CD62L。由于荧光标记的抗CD16/CD32单抗能识别活化型受体FcγRIII （CD16）, FcγRIIa （CD32a）和抑制型受体FcγRIIb （CD32b）,因此,我

关键词： 高迁移率族蛋白B1   Toll样受体   调节性T细胞  

摘要： 目的观察高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对调节性T细胞(Treg)Toll样受体4(TLR4)表达的影响,初步探讨其与Treg免疫活性的关系。方法用免疫磁珠法分离正常C3H/HeN(TLR4受体野生型)小鼠脾脏CD4+CD25+Treg。采用可溶性抗CD3抗体(1mg/L)和抗CD28抗体(1mg/L)辅助活化,观察不同浓度HMGB1(0、10、100、1000μg/L)刺激不同时间(24、48、72h)后TregTLR4表达的时间-效应关系和剂量-效应关系。结果以100μg/L浓度的HMGB1刺激,TregTLR4在24、48和72h表达水平均明显受抑(P均<0.01),但各时间点组间比较差异无统计学意义(P均>0.05);不同剂量HMGB1刺激48h可诱导TregTLR4表达水平下调,其中以100μg/L、1000μg/LHMGB1作用时TregTLR4表达降低尤为明显(P<0.05和P<0.01)。结论HMGB1能显著诱导Treg表达TLR4下调,进而参与调节Treg的免疫活性。

关键词： 凋亡细胞   免疫炎症反应   B细胞   小鼠免   调节性   抗原提呈细胞   MHCⅡ类分子   自身  

摘要： 细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的有序的死亡。凋亡的细胞可被体内的抗原提呈细胞所吞噬。树突状细胞（dendriticcell，DC）作为目前已知的机体内功能最强的抗原提呈细胞，在摄取抗原后开始成熟，在成熟过程的同时发生迁移，进入外周淋巴器官。成熟DC表达大量MHCⅡ类分子，共刺激分子和黏附分子的表达也显著增加，可有效激发T细胞应答。

关键词： Treg   B细胞   Th细胞   IgA   IgG   TGF-β1   CTLA4  

摘要： CD4+CD25+调节性T细胞（CD4+CD25+regulatory T cell，CD4+CD25+TReg，简写为TReg），占正常个体外周CD4+T淋巴细胞的5％-10％。1969年Nishizaka等在切除新生小鼠胸腺的实验中发现机体内存在一类抑制性T细胞（suppressor T cell）。这类细胞可以调节自身反应性T细胞。后来发现，这些细胞表面表达CD25（IL2受体的α链），因此常用CD4+CD25+T细胞表示，由于TReg具有免疫抑制活性，所以最初称为抑制性T细胞，现在则称为调节性T细胞。在Treg的免疫抑制方面，近年来已经有实验证实了Treg对效应性T细胞的抑制作用机制。但是Treg细胞介导效应性B细胞功能抑制，尤其是介导移植耐受的相关免疫学机制仍处在不断的探索和发现之中。因此本研究将对Treg细胞与B细胞的作用机制进行探索和分析。 第一部分CD4+CD25+Treg细胞体外分选和富集 目的：建立CD4+CD25+调节性T细胞（Regulatory T Cells，Treg）的磁珠（MACS）分选方法，并对分选结果进行纯度鉴定。 方法：首先分离大鼠脾脏淋巴细胞悬液。采用Meltiny MACS分选方法结合磁板分选系统进行分选。用以CD4+T cell Biotin-Antibody和Antibody-Biotin MicroBeads相结合的阳性选择法剔除CD8+T细胞；分选出CD4+T细胞，再以CD25 MicroBeads阳性选择法选出CD25+T淋巴细胞。以胎盘蓝检测分选细胞活性和以FACS流式细胞法检测分选的CD4+CD25+调节性T细胞纯度。最后以RT-PCR检测分选前后细胞中Foxp3表达水平。 结果：MACS磁珠双阳性分选法能够成功分选出CD4+CD25+调节性T细胞，分选平均纯度达到79．2%±2．8%，分选细胞活力为91．3％±3．4％。分选的CD4+CD25+调节性T细胞内有明确的Foxp3表达，脾脏淋巴细胞表达弱阳性，而CD4CD25-T细胞表达阴性。 结论：MACS磁珠双阳性分选法能够分选出高纯度的CD4+CD25+Treg细胞，该分选方法不影响分选靶细胞的细胞活力。能保证体外培养和细胞输注等一系列后序实验的进行。 第二部分Treg细胞诱导慢性排斥反应中对B淋巴细胞的作用 目的：研究Treg细胞对对同种MLR的抑制量效分析；通过设置Treg细胞与效应性B细胞共培养和分隔培养实验模型，并通过阻断相应细胞因子，以及设置Treg细胞与Th细胞的共培养实验模型，分析Treg细胞对效应性B细胞形成抑制作用的可能机制及各机制的主次要关系。 方法：在混合淋巴细胞反应体系中添加不同数量的Treg细胞，以MTT法检测各组OD值并计算抑制率。应用尼龙毛柱法分离B细胞，以胎盘蓝检测分选细胞活性和以FACS流式细胞法检测分选B细胞的纯度。然后将分离纯化的Wistar大鼠Treg细胞负载SD大鼠抗原，并以MTT法检测供体抗原负载情况。继而以Trans WellMillcell-PCF分隔培养槽分隔或共培养Treg细胞与B淋巴细胞组成的反应体系，在共培养体系中加入或不加入Anti-TGF-β1、Anti-CTLA4的阻断方法。培养5天，后用IMMAGE800（双光径免疫浊度分析仪）发检测不同组上清中的IgA和IgG分泌水平。将不同数量Treg细胞与Th细胞组成共培养实验模型，运用MTT法检测各组各组OD值并计算抑制率。 结果：5×10～4的Treg细胞即能对同种混合淋巴细胞反应形成明显抑制（抑制率76．1％，VS阳性对照组P<0．01），随着Treg细胞数量的增高，抑制效率也同时增加。当Treg细胞数量>10～5时，抑制效率基本维持恒定（Treg细胞数量>10～4的各组之间P>0．05）。经过SD大鼠肝脏抗原特异诱导后，分选的Wistar大鼠CD4+CD25+Treg细胞具备了对SD大鼠抗原特异性。Wistar大鼠脾脏单个核细胞经尼龙毛柱法分选B细胞分离纯度为80．4％±4．2％（71％-84％，n=4），细胞存活率92．5％±4．4％。分隔培养组上清中的IgG和IgA水平分别为（4．7±1．1）μg／ml、（10．5±1．7）μg/ml，与阳性对照组中IgG的含量（5．1±1．0）μg/ml以及IgA的（11．2±1．6）μg／ml相比没有显著差异（P>0．05），而与阳性对照组相比较，共培养组上清中的IgG和IgA水平明显降低（P<0．01）。分别达到了（2．2±0．8）μg／ml和（5．4±0．9）μg／ml。在共培养体系中加入Anti-TGF-β1后上清中的IgG和IgA的分泌水平分别达到（3．1±0．5）μg／ml和（6．9±0

关键词： 高迁移率族蛋白B1   调节性T细胞   免疫活性   Toll样受体   T淋巴细胞毒性相关抗原4   叉头翼状螺旋转录因子  

摘要： 目的:通过体外实验观察高迁移率族蛋白B1（high mobility group box-1protein,HMGB1）刺激对调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）免疫活性相关指标表达水平的影响,初步探讨HMGB1影响CD4+CD25+Treg免疫功能的可能受体机制;采用不同基因型动物进行体内实验,进一步明确HMGB1影响CD4+CD25+Treg免疫功能是否通过Toll样受体起作用。 方法:①采用免疫磁珠法分离获取正常C3H/HeN（Toll样受体4野生型）小鼠脾脏CD4+CD25+Treg,鉴定细胞纯度,调整细胞浓度1×10～6/孔后置于含10%小牛血清的1640培养液的96孔培养板。②将CD4+CD25+Treg随机分4组,依HMGB1（100ng/ml）刺激时间不同设为对照组、24 h组、48 h组、72 h组,观察HMGB1刺激与Toll样受体4（TLR4）表达的时间-效应关系;依HMGB1刺激剂量的不同设为0ng/ml组（对照组）、10ng/ml组、100ng/ml组、1000ng/ml组,作用48小时后用流式细胞仪分析CD4+CD25+Treg TLR4的表达情况（剂量-效应关系）,同时分别留取细胞培养上清,ELISA法测定IL-10的变化情况。③以功能纯化级抗-TLR4抗体（浓度2μg/10～6cell）预封闭C3H/HeN小鼠CD4+CD25+Treg,观察HMGB1刺激对CD4+CD25+Treg表达T淋巴细胞毒性相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA-4）及叉头翼状螺旋转录因子（forkhead/winged helix transcription factor,Foxp3）水平的影响。分组情况:时间-效应关系实验中,设正常对照组、24h组、48h组和72h组;剂量-效应关系实验中,设空白对照组、10ng/ml组、100ng/ml组和1000ng/ml组。收获细胞时留取细胞培养上清,ELISA法测定上清中IL-10浓度的变化情况。④将HMGB1以10μg/只、20μg/只的剂量分别腹腔注射C3H/HeN（TLR4野生型）小鼠和C3H/HeJ（TLR4突变型）小鼠体内,48h后提取两种小鼠脾脏CD4+CD25+Treg,继续体外培养12h,收获该细胞,流式细胞仪检测CTLA-4及Foxp3的表达情况,同时留取细胞培养上清,ELIsA法测定上清IL-10的变化情况。 结果:1.小鼠CD4+CD25+Treg纯度分析:多次分选细胞实验证实,正常小鼠脾脏单个核细胞经过MACS两次分选后,CD4+CD25+Treg纯度可达到91%以上。所获得的CD4+CD25+Treg经台盼蓝检测活性大于97%。***1刺激可诱导CD4+CD25+Treg TLR4表达水平明显下调（P＜0.05或P＜0.01）,其中,在剂量-效应关系的实验中（HMGB1刺激时间为48小时）,100ng/ml和1000ng/ml组TLR4分子表达水平的下调程度显著大于10ng/ml组（P＜0.05或P＜0.01）,而100ng/ml组与1000ng/ml组之间TLR4表达水平没有统计学差异（P＞0.05）;在时间-效应关系的实验中（HMGB1刺激浓度为100ng/ml）,观察到24h、48h和72h时间点TLR4分子的表达水平均呈现显著下降趋势,但各时间点的表达水平无明显差异（P＞0.05）。***1（100 ng/ml）刺激CD4+CD25+Treg,CTLA-4和Foxp3在24h、48h和72h表达水平较正常对照组均显著下降（P＜0.01）,以48h和72h组下降尤为明显;不同剂量HMGB1刺激CD4+CD25+Treg 48h其CTLA-4和Foxp3表达水平亦显著下调（P＜0.01）,其中以100 ng/ml和1000 ng/ml组降低幅度尤为明显。经封闭TLR4预处理后,给予HMGB1（100 ng/ml）刺激24h、48h和72h CD4+CD25+Treg表达CTLA-4和Foxp3的水平均较对正常照组显著增强（P＜0.05或P＜0.01）;而不同剂量HMGB1刺激CD4+CD25+Treg 48h,仅以100 ng/ml组能显著上调CTLA-4和Foxp3的表达水平（P＜0.01）。4.体内实验中,两种小鼠Treg细胞表达CTLA-4和Foxp3的基础水平没有明显差异（P＞0.05）;而腹腔注射HMGB1后,两种小鼠CD4+CD25+Treg CTLA-4和Foxp3的表达水平存在显著性差异,其中C3H/HeN小鼠CD4+CD25+Treg表达CTLA-4和Foxp3水平较对照组水平显降低,以20μg剂量刺激时降

关键词： 高迁移率族蛋白B1   脓毒症   病理生理   树突状细胞   T细胞功能   发病机制   免疫调控  

摘要： 目的：高迁移率族蛋白B1(HMGBl)是广泛存在于真核细胞内的高度保守的非组蛋白染色体蛋白，可由巨噬细胞或单核细胞等主动分泌，或由坏死细胞被动释放。从而作为一种炎症晚期介质参与脓毒症等病理过程，介导脓毒症和其他系统性炎症的致死性效应，研究其病理生理作用将有助于深化对脓毒症发病机制的认识，并为免疫反应的调控提供潜在的干预目标。本试验拟应用HMGBl体外刺激小鼠脾脏树突状细胞(DC)的一个亚群--CD11low CD45RBhigh DC，阐明HMGBl对CD11clow CD45RBhigh DC表面共刺激分子CD80、CD86及主要组织相容性复合物(MHC)-Ⅱ类分子表达的影响，进一步探讨对调节性T细胞分化的影响。为初步明确HMGBl免疫功能奠定基础，旨在为脓毒症、多器官功能障碍综合征的预防和治疗提供新思路。 方法：(1)无菌分离正常雌性BABL/c小鼠脾脏CD11clow CD45RBhigh DC，在含10％胎牛血清的1640培养液中调整细胞浓度1×105/孔后置于96孔培养板，分别用0.01μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml的HMGBl刺激获取的CD11clow CD45RBhigh DC，在刺激后12、24、36小时三个不同时间点，单克隆荧光抗体染色，用流式细胞仪观察HMGBl刺激与CD11clow CD45RBhigh DC表面共刺激分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ类分子表达的时间-效应关系及剂量-效应关系。(2)经0.01 μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/mlHMGB1刺激24小时的CD11clow CD45RBhigh DC按1∶150的比例与CD4+T细胞混合培养24小时后，单克隆荧光抗体染色，用流式细胞仪监测调节性T细胞(Tr)的特征性分化群CD25的表达情况。 结果： (1)流式细胞仪监测HMGB1对小鼠脾脏CD11clow CD45RBhigh DC表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ类分子表达的影响：用0.1μg/ml的MHGB1刺激12、24、36小时，与正常对照组相比，CD11clow CD45RBhigh DC表面共刺激分子CD80表达上调(P＜0.05或P＜0.01)；而CD86和MHC-Ⅱ表达下调(P＜0.05或P＜0.01)。0.01μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml 的HMGB1 刺激24 小时均可诱导CD11clowCD45RBhigh DC表面共刺激分子CD86和MHC-Ⅱ表达下调(P＜0.05或P＜0.01)。但CD80表达上调(P＜0.05或P＜0.01)。(2)与正常对照组相比，随HMGB1浓度的增加，CD25表达增强(P＜0.05或P＜0.01)。 结论：(1)HMGB1能诱导小鼠CD11clowCD45RBhigh DC表面共刺激分子CD86及MHC-Ⅱ分子表达减弱，同时CD80表达有所增强。影响CD11cbw CD45RBhigh DC成熟。(2)经HMGBl刺激的CD11clowCD45RBhigh DC可影响CD4+CD25+调节性T细胞的分化，总体趋势是随着HMGBl浓度的增加CD25表达增强(P＜0.05或P＜0.01)。

关键词： 高迁移率族蛋白B1   调节性T细胞   树突状细胞   T淋巴细胞   丙酮酸乙酯   烧伤   脓毒症  

摘要： 目的: 实验一:(1)采用严重烫伤延迟复苏动物模型,明确高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的变化及其与调节性T细胞(Treg)免疫功能的关系。(2)通过严重烫伤延迟复苏动物模型,阐明HMGB1对Treg分化成熟的受体作用机制。(3)探讨严重烫伤延迟复苏后HMGB1介导的Treg对树突状细胞(DC)免疫功能的影响及调节作用。(4)探讨严重烫伤延迟复苏后HMGB1介导的Treg对T淋巴细胞免疫功能的影响及调节途径。(5)观察丙酮酸乙酯(EP)对重度烫伤延迟复苏动物免疫功能及脏器损害的可能保护效应。 实验二:(1)对临床严重烧伤患者进行动态监测,明确严重烧伤后病人外周血HMGB1、Treg分化成熟以及T淋巴细胞免疫功能的变化规律,探讨HMGB1、Treg及T淋巴细胞免疫功能改变在患者烧伤后发生脓毒症及不良预后中所起的作用及临床意义。(2)探讨严重烧伤后HMGB1、Treg及T淋巴细胞免疫指标间的相互关系及可能的作用机制。 方法: 1.采用重度烫伤延迟复苏动物模型,即雄性清洁级Wistar大鼠,浸于沸水中造成30%体表面积Ⅲ度烫伤。伤后延迟6小时抗休克复苏,在伤后6小时从腹腔给予林格液(40 ml/kg)抗休克治疗,此外在烫伤后12、24、36、48小时分别给予4 ml/次林格液腹腔内注射。实验分组:136只大鼠随机分为5组,(1)正常对照组(n=8):麻醉后活杀;(2)假烫伤组(n=32);(3)烫伤组(n=32);(4)EP治疗组(n=32):EP加入林格液中随补液给药(EP为28 mM);(5)晚期糖基化终末产物受体(RAGE)抗体(1 mg/ml)治疗组(n=32):烫伤后6、24小时从阴茎背静脉给予RAGE抗体(1 mg/kg)治疗。以上后4组实验动物再分为4个亚组,分别于烫伤后1、3、5、7天处死动物,无菌留取血和脾脏标本。分离血清,-20℃贮存。脾脏一部分无菌、无酶液氮冻存,另一部分用于提取Treg、DC和T淋巴细胞。Treg、DC的分离纯化采用MiniMACS免疫磁性分离系统进行。利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性,分离T淋巴细胞。采用流式细胞术检测细胞免疫表型和细胞表面受体,MTT法检测脾T淋巴细胞增殖,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清、细胞孵育上清及组织匀浆液的细胞因子和T淋巴细胞活化的核因子(NF)-kB。采用荧光定量PCR检测目的基因表达水平。 2.对106例烧伤总面积大于或等于30%的患者进行动态观察,对所采集临床病历资料进行分析。实验分组:(1)按烧伤总面积将患者分为三组:Ⅰ组41例(烧伤总面积30%～49%),Ⅱ组34例(烧伤总面积50%～69%),Ⅲ组31例(烧伤总面积70%～99%);(2)根据烧伤脓毒症的诊断标准,将患者进一步分为脓毒症组(59例)与非脓毒症组(47例);(3)根据脓毒症患者的预后情况,将其分为死亡组(17例)与存活组(42例)。同时设正常对照组(25位健康献血员)。分别于烧伤后1、3、7、14、21天采集患者外周静脉血,分离外周血T淋巴细胞,采用MiniMACS免疫磁性分离系统对外周血Treg进行分离纯化,同时分离血清,-20℃贮存。采用流式细胞术检测细胞免疫表型,MTT法检测T淋巴细胞增殖活性,ELISA检测血清HMGB1及细胞孵育上清的细胞因子水平,采用荧光定量PCR检测目的基因表达水平。 结果: 实验一:(1)烫伤延迟复苏导致动物脾脏HMGB1基因、蛋白表达和血清HMGB1水平在伤后1～7天显著升高,脾组织中HMGB1含量第1天达峰值,血清HMGB1水平于第3天达峰值。EP干预后烫伤动物脾脏HMGB1基因、蛋白表达和血清HMGB1水平1～7天均明显降低。RAGE抗体干预对烫伤动物脾脏和血清HMGB1无明显影响。(2)严重烫伤后脾脏Treg表面分子CTLA-4的表达1～5天明显增强,表面标记物Foxp3的表达1～7天明显增高,与假烫伤动物比较差异显著,表明严重烫伤可促使Treg成熟。EP及RAGE抗体干预组动物脾脏Treg表面CTLA-4和Foxp3的表达明显降低,与烫伤组比较均有统计学差异,提示EP处理和RAGE抗体干预可抑制Treg成熟。(3)严重烫伤后1～7天动物脾脏Treg表面RAGE的表达明显增强。EP干预后脾脏Treg表面RAGE的表达于1～7天显著降低,但仍明显高于假烫伤组。RAGE抗体干预后Treg表面RAGE表达1～7天显著降低。(4)烫伤延迟复苏后动物脾脏IL-10 mRNA表达以及Treg孵育液中IL-10含量明显增高。EP或RAGE抗体干预后,烫伤动物脾脏IL-10 mRNA表达和Treg孵育液中IL-10含量在伤后1～7天明显降低。(5)严重烫伤后1～7天脾脏DC表面CD80的

关键词： 重症肌无力   T淋巴细胞   受体,白细胞介素4  

摘要： 目的研究重症肌无力(MG)患者外周血多群调节性 T 细胞的水平及其 B 细胞表达 B细胞激活因子受体(B cell-activating factor receptor,BAFF-R)的情况。方法应用四色流式细胞仪检测61例 MG 患者与23名健康对照外周血调节性 T 细胞(CD_4^+ CD_(25)^(high)Foxp3^+、CD_8^+CD_(28)^-、CD_8^+CD_(122)^+)以及 CD_(19)^+BAFF-R^+细胞的百分率。结果 MG 组与健康对照组外周血 CD_4^+CD_(25)^(high)Foxp3^+T 细胞的百分率分别为32.12%±16.12%与65.15%±14.72%,MG 组该群调节性 T 细胞的水平明显低于健康对照组(P<0.01);两组 CD_8^+CD_(28)^-及 CD_8^+CD_(122)^+T 细胞的水平差异无统计学意义。此外,MG 组外周血CD_(19)^+BAFF-R^+细胞的水平(10.57%±5.59%)显著高于健康对照组(5.38%±3.87%,P<0.01)。大剂量激素或大剂量激素加丙种球蛋白治疗后短期内可使 MG 组外周血 CD_4^+CD_(25)^(high)Foxp3^+调节性 T 细胞的百分率增加(P<0.05)。结论 MG 患者 Foxp3^+的 CD_4^+CD_(25)^(high)调节性 T 细胞的减少提示 MG 患者存在免疫和耐受的失衡,显示了 T 细胞的自身免疫性。在 B 细胞方面,MG 患者外周血 CD_(19)^+B 细胞上 BAFF-R 表达增高,提示其体内 B 细胞已处于易激活状态。