关键词： 调节性T细胞   T细胞发育   NF-κB   介导   免疫调节功能   免疫耐受   细胞功能   调控作用  

摘要： NF-κB在一种具有维持外周免疫耐受,抑制自身反应性T细胞功能的调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）的发育过程中起重要调控作用。自然生成的CD4＋CD25＋Treg通过稳定表达叉头翼状转录因子3（forkhead transcription factor 3,Foxp3）来实现细胞的稳定性和免疫调节功能。

关键词： HMGB1蛋白   T淋巴细胞   调节性   叉头转录因子类   烧伤  

摘要： 目的探讨严重烫伤延迟复苏后脾脏高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达对调节性T细胞(Treg)表型及其介导T淋巴细胞功能性极化的影响。方法 104只Wistar大鼠随机分为正常对照组(8只)、假烫组(32只)、烫伤组(32只)、丙酮酸乙酯(EP)治疗组(32只)。后2组大鼠制作30%TBSA三度烫伤模型,伤后6h腹腔注射林格液或EP液延迟复苏抗休克。分别于伤后1、3、5、7d处死各组大鼠,免疫磁珠法分离大鼠脾脏CD4+CD25+Treg,检测脾组织HMGB1含量及T淋巴细胞上清液中白细胞介素4(IL-4)、干扰素γ(IFN-γ)水平,并采用流式细胞术检测Treg表面标记物叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)表达水平。结果与假烫组比较,烫伤组大鼠脾组织HMGB1水平在伤后1～7d显著升高(P<0.01),其中第1天时达峰值(46.73±8.27ng/mg),EP干预后HMGB1水平在1～7d显著低于烫伤组(P<0.01)。与假烫组比较,烫伤组大鼠伤后1d脾脏Treg表面Foxp3表达逐渐增强,于第3天达峰值(72.46%±11.02%),EP治疗组伤后1～7dFoxp3表达显著低于烫伤组(P<0.01或P<0.05)。与假烫组比较,烫伤组脾T淋巴细胞IL-4分泌量明显增高(P<0.01或P<0.05),IFN-γ分泌量明显降低(P<0.01),EP治疗组伤后1～5dIL-4分泌量明显低于烫伤组(P<0.05),伤后1～7dIFN-γ分泌量则明显高于烫伤组(P<0.05)。结论严重烧伤后HMGB1可促进Treg成熟,从而介导T细胞功能亚群从促炎反应优势向抗炎优势转化,诱导机体细胞免疫功能抑制。

关键词： 胃癌   肿瘤免疫   调节性B细胞   抗肿瘤效应  

摘要： 研究背景：传统的胃癌治疗方法仅注重了手术和放化疗对肿瘤的清除，却忽视了对患者免疫功能状态的评估和调整。已知胃癌患者存在抗肿瘤免疫功能不足，研究免疫抑制机制对修复与重建患者免疫功能具有重要意义。调节性T细胞（Tregs）是胃癌患者免疫抑制的重要因素。近年来发现机体还存在另一重要的免疫抑制细胞——调节性B细胞(Bregs)，然而尚没有Bregs与肿瘤免疫相关的直接研究。\n 目的：本研究首次观察胃癌患者外周血Bregs的表达情况，并探讨Bregs对T细胞抗肿瘤效应的影响。\n 方法：1）选取胃癌患者30例，健康对照组25例，以流式细胞术检测外周血中CD19+IL-10+Bregs比例；2）通过CD19磁珠分离纯化B细胞并体外培养，以基础条件CD40mAb+IL-2+IL-4为对照组，分别加LPS、CPG、CPG+Poly(i:c)（C+P组）及BAFF为不同处理组，72h后流式细胞术检测Bregs比例，ELISA法检测上清中IL-10及TGF-β含量；3）选取不同处理组中Bregs比例最高与最低的两组B细胞，用BGC-823全细胞裂解物抗原冲击后与富集的T细胞(去除B细胞及贴壁细胞的PBMC)共培养72h;设无B细胞共培养组为对照组：4）流式细胞术检测共培养后细胞的表型(CD3、CD8、Tregs)；通过ELISA检测共培养细胞上清中IFN-Υ含量；LDH释放法检测共培养后细胞对BGC-823肿瘤细胞的杀伤能力。\n 结果：1）胃癌患者外周血中Bregs比例显著高于对照组，Ⅲ-Ⅳ期患者Bregs比例高于Ⅰ-Ⅱ期(P<0.05)，Ⅰ-Ⅱ期与健康对照组无明显差别(P>0.05)；2)B细胞不同条件体外扩增后Bregs比例不同，从高到低分别为：CPG组>基础条件组>C+P组>BAFF组>LPS组，与基础条件组比较，除CPG组外均有统计学差异(P<0.05)；3)B细胞培养72h后上清中各组TGF-β含量差异不明显，而IL-10的含量CPG组明显高于基础条件组(P<0.05)，其余各组间差异不明显；4）高比例Bregs组共培养上清中IFN-Υ显著低于低比例Bregs组(P<0.01)和对照组(P<0.05)；各组CD8+T细胞及Tregs比例无明显差异；5）高比例Bregs组杀伤能力显著低于低比例Bregs组(P<0.01)和对照组(P<0.05)。\n 结论：1）胃癌患者外周血Bregs与健康人相比明显升高，晚期患者显著高于早期患者，说明Bregs很可能参与了胃癌患者肿瘤免疫的抑制效应；2）体外培养条件下单CD40信号激活会产生高水平的Bregs，而辅以合适的其它信号可以降低Bregs比例，这对于B细胞相关免疫治疗有重要意义；3）B细胞群体中Bregs比例升高会明显抑制T细胞抗肿瘤免疫效应，提示去除Bregs很可能会增强抗肿瘤免疫。

关键词： 慢性肾功能不全   流式细胞仪   B淋巴细胞   调节性T细胞   益肾降浊冲剂  

摘要： 目的探讨益肾降浊冲剂对慢性肾功能不全(chronic renal insufficiency,CRI)患者B淋巴细胞、调节性T细胞(Treg)的影响。方法 53例CRI患者,根据治疗方案,采用随机数字表法分为治疗组(益肾降浊冲剂)和对照组,以流式细胞仪检测治疗前后慢性肾衰竭患者外周血Treg、B淋巴细胞百分率(CD19+)、活化率(CD19+CD69+)、凋亡率(AV)水平;用CBA流式蛋白分析系统检测外周血细胞因子IL-6、IL-10的水平;用散射速率比浊法测定血清高敏C反应蛋白(hs-CRP);用终点法测定同型半胱氨酸(Hcy);采用贝克曼库尔特血细胞分析仪查血红蛋白含量(HGB);由反相高效液相色谱测定方法测定尿肌酐(UCr);钙(Ca)、磷(P)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、血浆白蛋白(Alb)由BECKMAN-C800全自动生化分析仪测定;根据血Ca、P浓度计算钙磷乘积(Ca×P);根据SCr、UCr和24h尿量计算内生肌酐清除率(CCr)。结果两组治疗后CD19+、CCr水平上升(P<0.01),AV、SCr水平下降(P<0.01),其中治疗组较对照组变化更明显(P<0.05);两组治疗后CD19+CD69+、Treg、IL-6、IL-10、CRP、BUN、P水平及Ca×P无明显变化(P>0.05)。两组治疗后Ca、HGB、Alb均上升(P<0.05),Hcy均下降(P<0.05),但两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。相关性分析:CD19+与AV、Hcy呈负相关;AV与ALB呈负相关;SCr与CCr呈负相关,与CRP、BUN呈正相关;CCr与CRP、BUN呈负相关;Hcy与ALB呈负相关;CRP与BUN呈正相关。结论益肾降浊冲剂具有改善肾功能、延缓肾衰竭进展的作用。益肾降浊冲剂通过降低CD19+AV,提高其百分率而对CKD3、4期患者B淋巴细胞具有调节作用。

关键词： 雷公藤甲素   调节性T细胞   FOXP3   肿瘤  

摘要： 背景：调节性T(regulatory T, Treg)细胞是一群具有抑制其他免疫细胞功能的负调控细胞,可通过多种方式抑制抗肿瘤免疫反应。近年来,如何有效清除和控制Treg细胞已成为肿瘤免疫的研究热点。雷公藤甲素是雷公藤中抑制淋巴细胞增殖作用最强的单体,对多种淋巴细胞都有明显的抑制增殖的作用,但其对调节性T细胞的作用还未见报道。 目的：研究雷公藤甲素对B16-F10荷瘤鼠调节性T细胞的影响以及分子机制,为改善肿瘤免疫治疗效果提供新思路。 方法：(1)体外实验：MTT法检测雷公藤甲素在体外对B16-F10的杀伤作用：培养B16-F10细胞,以每孔2×10-1个细胞种板,分别用雷公藤甲素处理24h、48h、72h,加入MTT孵育4小时,于570nm检测OD值。 (2)体内试验：50只C57小鼠随机分为正常组、模型组、环磷酰胺治疗组、雷公藤甲素高剂量组和雷公藤甲素低剂量组,除正常组外,其余各组建立B16-F10荷瘤小鼠模型,造模第2d各组开始给药,正常组和模型组用生理盐水灌胃,雷公藤甲素组灌胃给药,连续14d。环磷酰胺治疗组腹腔注射1周,流式细胞仪检测脾脏CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞比例、实时定量聚合酶链反应检测FOXP3、IL-10 mRNA表达、酶联免疫吸附试验测定外周血IL-10、TGF-β含量。 结果： 体外实验：随着雷公藤甲素药物浓度的增加,B16-F10细胞生长明显被抑制,其作用特点表现为明显的浓度和时间依赖性。 体内试验：用药两周后,雷公藤甲素高剂量组抑瘤率为33.88%,低剂量组抑瘤率为21.08%,环磷酰胺抑瘤率为34.76%；模型组脾脏Treg水平明显升高,雷公藤甲素和CTX治疗组Treg水平较模型组降低,RT-PCR结果显示雷公藤甲素干预后,FOXP3. IL-lOmRNA水平与模型组相比显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。雷公藤甲素有效降低外周血中IL-10. TGF-β含量。 结论：雷公藤甲素能够抑制荷瘤鼠肿瘤生长,其作用机制可能是雷公藤甲素通过降低荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞调节性T细胞比例,以及抑制包括IL-10 TGF-β在内的免疫负调控细胞因子的分泌,实现其免疫调节作用。

关键词： 结肠癌   B7-H1   PD-1   调节性T细胞   IL-10  

摘要： 目的:分析B7-H1和PD-1分子在结肠癌组织中的表达水平,并分析结肠癌微环境中异常增高的TReg与B7-H1的关系。 方法:利用Western Blot和流式细胞技术研究结肠癌患者手术切除的癌组织及癌旁正常组织中B7-H1及PD-1的表达情况;使用流式细胞仪检测结肠癌组织及癌旁正常组织中浸润TReg量的差异;使用Western Blot技术检测结肠癌组织中提取的TReg与CD4+CD25- T细胞所表达IL-10的水平差异;免疫磁珠分选健康人外周血中分选的CD4+CD25+和CD4+CD25-细胞进行体外培养并用anti-CD3和anti-CD28刺激,ELISA检测培养体系中IL-10的表达量;免疫磁珠分选人结肠癌中浸润的TReg细胞,与从健康人外周血分选的单核细胞共培养,流式检测单核细胞表达B7-H1的水平;经TReg诱导高表达B7-H1的单核细胞和从结肠癌组织中分选的巨噬细胞与健康人外周血分选的Na（i|¨）ve T细胞共培养,CFSE法测定T细胞的增殖情况,以测定经TReg诱导高表达B7-H1的单核细胞对T细胞的免疫抑制能力。 结果:1. Western Blot结果显示结肠癌患者癌组织及癌旁正常组织均表达B7-H1分子,且癌组织比癌旁正常组织中B7-H1表达水平高; 2.流式细胞仪检测显示B7-H1主要表达于巨噬细胞,且癌组织比癌旁正常组织浸润的巨噬细胞表达的B7-H1的水平高,比例分别为38±4%和5±2%;平均荧光强度（MFI）分别为1900±20和250±100; 3.流式细胞仪检测显示PD-1主要表达于CD8+ T细胞,癌组织比癌旁正常组织浸润的CD8+ T细胞PD-1的表达水平高,比例分别为51±6%和6±2%; 4.将从结肠癌组织中分选的巨噬细胞分别与健康人外周血分选的经CFSE染色的Na（i|¨）ve T细胞共培养,流式检测发现经诱导高表达B7-H1的单核细胞或结肠癌来源的巨噬细胞组T细胞增殖功能(CFSEdim:30±5%)较对照组(Na（i|¨）ve T细胞单独培养组CFSEdim:63±7%、癌旁正常组织与Na（i|¨）ve T细胞共培养组CFSEdim:55±8%)明显受抑制,阻断B7-H1通路后受抑状态可以得到恢复(加入B7-H1阻断性抗体组CFSEdim:51±10%、加入PD-1阻断性抗体组CFSEdim:54±11%); 5.流式细胞仪检测显示结肠癌组织中浸润的TReg较癌旁正常组织增多,Foxp3+ TReg占CD3+CD4+细胞中的比例分别为18±5%和5±3%; 6. Western Blot检测从结肠癌组织中分选的CD4+CD25+细胞比CD4+CD25-细胞表达的IL-10高;将健康人外周血液中分选的CD4+CD25+和CD4+CD25-细胞分别进行体外培养并用CD3、CD28刺激48小时后,ELISA检测发现CD4+CD25+细胞组表达IL-10的浓度明显高于CD4+CD25-细胞组,浓度分别为180±27pg/ml、52±9pg/ml; 7.分选肿瘤组织中TReg与健康人外周血单核细胞共培养,流式检测发现TReg与单核细胞共培养组B7-H1表达量（比例:28±3%;MFI:1200±80）明显高于对照组（比例:5±1%;MFI:150±20）和加入IL-10拮抗性抗体组（比例:6±2%;MFI:350±50）; 8.将经TReg诱导高表达B7-H1的单核细胞与健康人外周血分选的经CFSE染色的Na（i|¨）ve T细胞共培养,流式检测发现经诱导高表达B7-H1的单核细胞组T细胞增殖功能(CFSEdim:32±8%)较对照组(Na（i|¨）ve T细胞单独培养组CFSEdim:60±7%、外周血未经诱导的单核细胞与Na（i|¨）ve T共培养组CFSEdim:64±11%)明显受抑制,阻断B7-H1通路后受抑状态可以得到恢复(加入B7-H1阻断性抗体组CFSEdim:52±8%、加入PD-1阻断性抗体组CFSEdim:55±5%)经TReg诱导高表达B7-H1是可以通过B7-H1/PD-1途径抑制T细胞增殖的。 结论:1.结肠癌微环境中巨噬细胞高表达B7-H1;结肠癌组织浸润性CD8+T细胞高表达PD-1; 2.结肠癌微环境中TReg异常增高,且高表达IL-10,结肠癌微环境中TReg可以通过高表达IL-10促进巨噬细胞表达B7-H1; 3.结肠癌微环境中B7-H1/PD-1通路可以抑制T细胞的增殖能力,促进结肠癌的肿瘤免疫逃逸; 4.阻断B7-H1/PD-1通路可恢复结肠癌微环境中T细胞的增殖能力,干预B7-H1/PD-1通路可能是将来辅助性免疫治疗结肠癌的方法之一。

关键词： FOXP3   调节性T细胞   IL-10   弥漫性大B细胞淋巴瘤   预后  

摘要： 目的检测FOXP3+调节性T细胞(FOXP3+Treg)及IL-10在弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)组织中的表达状况,探讨其与各临床病理因素及预后的关系。方法收集2002年1月～2009年12月间经安徽医科大学第一附属医院病理科确诊并符合入选条件的DLBCL69例及反应性增生的淋巴结和扁桃体26例进行研究,采用免疫组织化学方法,以FOXP3及IL-10为标志物进行染色,对阳性细胞分别进行绝对值计数,同时对69例DLBCL病人进行随访。两两比较运用t检验,多组间差异比较运用方差分析,多因素分析采用COX回归模型。通过Kaplan-Meier即生存率曲线法运用ROC/Y得到的最佳临界值以及临床病理特征制作生存曲线。结果DLBCL中FOXP3+Treg细胞主要弥漫分布于肿瘤间质,表达变异较正常组织大,绝对阳性细胞数目为(55.7±40.5)个/mm2,变异系数为0.73;反应性增生的淋巴结和扁桃体中FOXP3+Treg细胞表达较稳定,绝对阳性细胞数目为(35.3±11.4)个/mm2,变异系数为0.32,其差异具有统计学意义(P<0.01)。DLBCL中IL-10阳性细胞散在分布于肿瘤间质,表达变异性较大,绝对阳性细胞数目为(79.0±39.8)个/mm2,变异系数为0.50;反应性增生的淋巴结和扁桃体中IL-10的表达较稳定,阳性细胞数目为(51.3±13.1)个/mm2,变异系数为0.43,其差异具有统计学意义(P<0.01)。DLBCL中FOXP3+ T reg细胞数目在不同性别(P=0.170)、年龄段(P=0.120)、临床分期(P=0.377)、病理分型(P= 0.339)、取材部位(P=0.996)、是否结外侵犯(P=0.996)、不同治疗方案(P=0.804)间差异无统计学意义(P>0.05);在LDH是否增高间差异具有统计学意义(P=0.019)。DLBCL中IL-10+细胞数目在不同性别(P=0.692)、年龄段(P=0.402)、临床分期(P=0.144)、病理分型(P=0.565)、取材部位(P=0.357)、是否结外侵犯(P=0.357)、LDH是否增高(P=0.577)、不同治疗方案(P=0.963)间差异无统计学意义(P>0.05)。DLBCL中FOXP3+Treg及IL-10的表达在不同的近期疗效间差异不具有统计学意义(P>0.05)。肿瘤组织间质中FOXP3+细胞数量的绝对值与非GC型DLBCL的预后,IL-10+细胞数量的绝对值与GC型DLBCL的预后具有相关性(P<0.05)。肿瘤组织间质中FOXP3+细胞数量的绝对值与GC型DLBCL的预后,IL-10+细胞数量的绝对值与非GC型DLBCL的预后不具有相关性(P>0.05)。多因素生存分析发现临床分期、FOXP3及病理亚型是DLBCL独立预后因素(P<0.05),而IL-10不是独立的预后因素。结论FOXP3+Treg与IL-10在DLBCL间质中呈散在分布,表达变异较大,与正常组织间差异具有统计学意义。FOXP3+Treg与IL-10可作为DLBCL预后因素之一。

关键词： 高迁移率族蛋白B1   调节性T细胞   慢性乙肝重型肝炎   慢加急性肝衰竭   丙酮酸乙酯  

摘要： 慢性乙型重型肝炎的临床病死率高,迄今尚无十分理想的治疗方法。研究证实肠源性内毒素血症在重型肝炎的发生发展中起重要作用。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)作为晚期炎症介质,参与了内毒素血症的发生与发展过程;调节性T (Treg)细胞可维持机体对HBV感染的免疫耐受,而通过控制炎症反应减少重型肝炎的发生。在败血症、烧伤、急性胰腺炎、脑卒中及出血性休克等多种严重疾病的动物模型实验中已证实：丙酮酸乙酯(EP)能改善肝、肾及肠道粘膜的损伤,并能抑制多种促炎症介质的表达。基于上述研究背景,本研究首先通过体外实验探讨了HMGB1及Treg细胞在慢性乙型重型肝炎发病机制中的作用,以及HMGB1对Treg细胞免疫活性的影响,接着通过体内实验探讨了EP作为HMGB1的拮抗剂,对慢加急性肝衰竭(ACLF)大鼠模型的保护作用,并观察了多种炎症因子的表达水平变化。 (1)体外实验：选取15例慢性乙型重型肝炎患者,20例普通慢性乙型肝炎(CHB)患者,10例健康人作为研究对象。应用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs)。分别应用ELISA法、实时荧光定量RT-PCR法及Western-blot法检测各组患者的血清、PBMCs及肝组织中HMGB1的表达水平。应用流式细胞术检测各组患者PBMCs中CD4+CD25+CD127low Treg细胞占CD4+细胞的比率。然后,从CHB患者PBMCs中分离CD4+CD25+CD127low Treg细胞,并采用不同剂量或不同处理时间给予HMGB1进行刺激。通过单向混合淋巴细胞反应(MLR),观察被HMGB1处理后的Treg细胞抑制淋巴细胞增殖的能力变化,同时应用实时荧光定量RT-PCR法及Western-blot法检测被HMGB1处理后的Treg细胞中叉头状转录因子P3 (Foxp3)的表达水平变化。结果发现：慢性乙型重型肝炎患者血清HMGB1水平明显高于CHB患者(82.6±20.1μg/L vs. 34.2±13.7μg/L, t=8.48, P<0.01);CHB患者血清HMGB1水平与健康人之间比较无显著性差异(34.2±13.7μg/L vs.27.8±6.5μg/L, t=1.73, P>0.05)。RT-PCR及Western blot检测结果进一步证实：慢性乙型重型肝炎患者PBMCs中HMGB1 mRNA水平(5.21±0.42 vs.1.78±0.18,t=29.43,P<0.01)及肝组织中HMGB1蛋白的表达水平(4.86±1.07vs.1.43±0.35,t=13.46,P<0.01)均明显高于CHB患者。CHB患者PBMCs中Treg细胞占CD4+细胞的比率明显高于健康对照(9.52%±3.89%vs.3.21%±1.21%,t=4.97,P<0.01);而慢性乙型重型肝炎患者Treg细胞占CD4+细胞的比率明显低于CHB患者(4.55%±1.34%vs.9.52%±3.89%,t=4.73,P<0.01)。经HMGB1采用不同剂量或不同处理时间体外刺激的Treg细胞抑制淋巴细胞增殖的能力明显减弱,Treg细胞中Foxp3的表达水平亦明显降低,并且均呈现剂量、时间依赖性。实验结果证实HMGB1表达的增高及Treg细胞比率的降低在慢性乙型重型肝炎的发病机制中起重要作用,而且HMGB1能抑制Treg细胞的免疫活性。这提示有效抑制HMGB1的表达可通过抑制内毒素血症的发生及增强Treg细胞的免疫活性,在慢性乙型重型肝炎的治疗中发挥作用。 (2)体内实验：应用人血白蛋白、D-氨基半乳糖及脂多糖构建慢加急性肝衰竭(ACLF)大鼠模型。实验动物随机分成3组：对照组、模型组及EP治疗组。EP治疗组大鼠分别在诱导ACLF模型后3h、6h、12h及24 h时间点,给予EP (40 mg/kg)治疗。在诱导ACLF模型后48h时间点处死大鼠,并留取标本用于以下指标检测。ELISA法检测血清HMGB1、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、白介素(IL)-10及IL-18水平;生化法检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。HE染色观察肝组织病理学变化;透射电子显微镜观察肝细胞超微结构变化;实时荧光定量RT-PCR法及Western-blot法分别检测肝组织中HMGB1 mRNA及蛋白水平的变化。绘制生存曲线,观察EP治疗对ACLF大鼠生存时间的影响。结果显示：与对照组比较,模型组大鼠血清HMGB1、ALT. TNF-α、IFN-γ、IL-10及IL-18均显著升高;并且模型组大鼠肝组织在诱导ACLF后48 h时间点呈现严重的病理学损伤,表现为大量炎性细胞浸润、肝索紊乱、大量肝细胞肿胀、核变大、染色变浅、核仁溶解。然而,EP治疗组大鼠不论在诱导ACLF后3h、6h、12h或24h时间点给予EP

关键词： 天疱疮   调节性B细胞   致病性抗体   免疫介导机制  

摘要： 目的：天疱疮是一严重的自身免疫性大疱性皮肤、粘膜疾病。以往认为仅自身抗体发挥了致病作用，但近年来研究表明多种效应细胞及效应分子共同参与了疾病的发生、发展。其中B 细胞在自身免疫性疾病中除了正向致病作用外，其负向调节功能被越来越多的揭示。为了更好地探讨调节性B 细胞（Breg）在天疱疮发病中可能的调节机制，本研究对天疱疮患者外周血Breg 的比例及其细胞因子的产生进行检测，并对Breg在Th 细胞活化中的调节作用进行研究，揭示了天疱疮的免疫介导机制。<br>　　 方法：临床上收集天疱疮患者55 例，根据不同临床表型、严重程度进行分类。采用ELISA 法检测患者血清中特异性抗Dsg1、Dsg3 抗体滴度、亚型，分析其与疾病活动的相关性。以CD19+CD24hiCD38hi 作为Breg 标记，流式检测48 例患者(PV+PF)及20 例正常人外周血中Breg 占CD19+B 细胞的比例，观察不同严重程度患者Breg 比例的变化趋势、并与抗体、抗体亚型进行相关性分析；采用实时定量荧光PCR 方法检测6 例急性期天疱疮患者（均为PV）和4例正常人外周血Breg 的细胞因子IL-6、IL-10、TGF-β表达水平；并通过FACS 分选出11 例急性期天疱疮患者（8 例PV、3 例PF）和7 例正常人的Breg、CD4+T 细胞，分别行CD4+T 和Breg 的培养，观察Breg对CD4+T 细胞功能的影响。<br>　　 结果：对55 名天疱疮患者进行临床研究后发现，其临床表型与自身抗体种类密切相关；特异性抗体滴度和疾病的严重度不甚平行，但抗体亚型却和疾病活动相关，急性期患者(PV+PF)以IgG4 亚型抗体为主，IgG4/IgG1 比值>1, PNP 患者则表现为特殊的抗体亚型，以IgG1 亚型抗体为主，IgG4/IgG1 出现倒置。天疱疮患者（PV+PF）外周血中Breg 占CD19+B 细胞的比例高于正常对照，以急性期最为明显，且急性期中重度患者该比例明显高于轻度患者；Breg 比例与抗Dsg1 抗体亚型IgG4 以及IgG4/IgG1 的比值均呈正相关；分选后的Breg 细胞因子IL-10 的表达显著升高，但IL-6、TGF-β水平无显著变化；正常人中外周血分选出的Breg 能有效抑制Th1 型细胞活化，而患者的Breg 则无明显的抑制作用。<br>　　 结论：本研究从B 细胞的双向免疫调节作用入手，一方面反应性B细胞产生致病性抗体，抗体亚型与疾病活动密切相关，发挥正向免疫调节作用；另一方面，Breg 产生抑制性细胞因子如IL-10，发挥负向免疫调节作用，在天疱疮患者中其功能失调，具体的作用机制尚有待进一步研究。<br>　　

关键词： CD4+T细胞   调节性T细胞   FOXP3   前列腺素E2   白三烯B4  

摘要： 目的:初始CD4+T细胞接受抗原刺激后,首先分化为Th0细胞,在不同的细胞因子作用下,可分化为Th1、Th2、Th17及Treg（regulatory T cells, Treg）细胞,发挥不同的生物学作用。Treg细胞具有免疫抑制作用,主要功能是维持免疫耐受和免疫稳态,并与类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）密切相关。Treg细胞是由CD4+T细胞在TGF-β的作用下分化而来,而叉状/翼状螺旋转录因子（forkhead/wingedhelix transcription factor, FOXP3）是检测CD4+T细胞向Treg细胞分化程度的特异性转录因子。 前列腺素E2（Prostaglandin E2, PGE2）和白三烯B4（leukotriene B4, LTB4）均为花生四烯酸的代谢产物,是RA病程中的重要炎症介质。目前,临床上多用非甾体类抗炎药治疗RA,其作用机制正是通过抑制环氧化酶进而抑制PGE2的生成。有研究表明,应用LTB4受体阻断剂可以治疗RA。本室以往研究证实,PGE2通过前列腺素受体EP2和EP4抑制Th0细胞向Treg细胞分化,参与机体的免疫调节。LTB4可抑制Th0分化为Treg细胞,且抑制胶原诱导的关节炎（collagen induced arthritis,CIA）小鼠Th0细胞分化为Treg细胞,参与机体免疫调节。那么,PGE2和LTB4是否可以调节人CD4+T细胞向Treg细胞的分化,目前尚无文献报道,因此本课题以人外周血CD4+T细胞为研究对象,观察PGE2和LTB4对Treg细胞分化的影响,进而确定PGE2和LTB4是否通过调节Treg细胞的分化,参与人体的免疫调节,以期进一步揭示二者在RA中的免疫调节作用。 方法: 1 PGE2对Treg细胞分化的调节 （1）免疫磁珠法分选人外周血CD4+T细胞,流式细胞术检测分选细胞的纯度;收集分选后的细胞,接种于anti-CD3预先包被的24孔板,加入anti-CD28和TGF-β1,诱导CD4+T细胞向Treg细胞分化,于不同时间收集细胞,观察FOXP3 mRNA的时间依从性表达;收集分选后的细胞,接种于anti-CD3预先包板的24孔板,加入anti-CD28、TGF-β1和IL-2,7d后收集细胞,流式细胞术检测CD4+CD25+FOXP3+细胞数量。 （2）不同浓度PGE2对Treg细胞分化的影响。PGE2对Treg细胞FOXP3 mRNA表达的影响:分为四组,对照组和PGE2（0.1μM、1μM、10μM）组,孵育36h,收集细胞,观察FOXP3 mRNA的表达情况;不同时间10μM PGE2对Treg细胞分化的影响:分为对照组和PGE2 10μM组,于不同时间收集细胞,观察FOXP3 mRNA的表达情况;PGE2对CD4+CD25+ FOXP3+细胞数量的影响:分为四组,对照组和PGE2 （0.1μM、1μM、10μM）组,培养7d,收集细胞,流式细胞术观察CD4+CD25+FOXP3+细胞的数量。 2 LTB4对Treg细胞分化的调节 LTB4对Treg细胞FOXP3 mRNA表达的影响:分为四组,对照组和LTB4 （0.01μM、0.1μM、1μM）组,孵育36h,收集细胞,观察FOXP3 mRNA的表达情况;LTB4对CD4+CD25+FOXP3+细胞数量的影响:分为四组,对照组和LTB4 （0.01μM、0.1μM、1μM）组,培养7d,流式细胞术检测CD4+ CD25+FOXP3+细胞的数量。 应用SPSS13.0软件进行统计学分析,数据用均数±标准差（x±s）表示,各组均数的比较行单因素方差分析（one-way ANOVA）,用最小显著差法（least significant difference, LSD）作两两比较,P<0.05为有显著性差异。 结果: 1 PGE2对Treg细胞分化的调节 （1）经磁珠分选后,流式细胞仪检测CD4+T细胞的纯度达97%以上;在anti-CD3和anti-CD28,TGF-β1作用下Treg细胞关键转录因子FOXP3 mRNA在36h达表达高峰;在anti-CD3和anti-CD28存在的条件下,TGF-β1和IL-2作用7d后,可使（72.9533±17.2270）%的细胞同时表达CD4、CD25和FOXP3,证明体外成功诱导CD4+T细胞分化为Treg细胞。 （2）不同浓度的PGE2在CD4+T细胞诱导分化为Treg细胞36h时均对FOXP3 mRNA的表达有抑制作用,且呈剂量依赖性,PGE2（0.1μM、1μM、10μM）组（0.8544±0.0745、0.6