关键词： 食管癌   调节性B细胞   B10   IL-10  

摘要： 目的:检测食管癌患者和健康对照者外周血中调节性B细胞CD5+CD19+IL-10(B10)表达量的差异,探讨B10在食管癌发生、发展中的作用。方法:收集60例食管癌患者和60例健康体检者外周血,用流式细胞仪检测调节性B细胞的表达情况。结果:食管癌患者外周血中B10的数量明显高于健康对照者(P<0.05),且Ⅲ～Ⅳ期[(3.3±0.6)%]高于Ⅰ～Ⅱ期[(2.1±0.3)%],均高于健康对照者[(1.4±0.4)%]。结论:食管癌临床分期越晚B10升高越明显,提示B10细胞与食管癌的发生发展可能存在着一定的关系。

关键词： 免疫疾病   调节性B细胞   负向调控   免疫机制  

摘要： 目的探究免疫疾病中调节性B细胞的调控机制。方法选取78例免疫疾病患者作为观察组,选取78例正常人作为对照组,比较两组研究对象外周血中B10细胞、B10前体细胞的数量以及两组研究对象外周血中B10细胞的功能。结果观察组研究对象外周血中B10细胞数量少于对照组,B10前体细胞的数量多于对照组(P<0.05),且观察组研究对象外周血中B10细胞的功能强于对照组(P<0.05)。结论调节性B细胞对人体具有负向免疫调节作用,其功能失调将可能导致人类多种自身免疫病的发生。

关键词： 免疫性血小板减少症   调节性B细胞   CD5   白细胞介素10   大剂量地塞米松   治疗   免疫调节  

摘要： 背景免疫性血小板减少症（ITP）由自身免疫机制介导,是血液系统常见的出血性疾病。多数患者体内可以检测到抗血小板膜糖蛋白（GP）的自身抗体,导致血小板破坏加速和/或巨核细胞生成血小板功能障碍。B细胞由于其分泌抗体的特性,长期以来在ITP中一直被认为是重要的致病性因素。但近年来的研究表明,B细胞中存在着部分亚群可以负向调节免疫反应,称为调节性B细胞（Bregs）,主要通过分泌IL-10发挥免疫调节效应。CD5是Bregs的重要表面标志之一,CD5+B细胞可以产生大量IL-10,因此CD5+B细胞在ITP免疫失衡机制及疾病发生发展中的作用不容忽视。大剂量地塞米松（HD-DXM）作为ITP治疗的一线方案之一,广泛作用于多种免疫细胞,如纠正Th1/Th2失衡、抑制树突状细胞成熟、减少促炎性细胞因子合成等,但其如何影响Bregs尤其是CD5+B细胞的免疫调节功能尚未阐明。目的 首先通过研究ITP患者外周血CD5+B细胞产生及分泌IL-10能力、对效应性T细胞的增殖、凋亡及Th1/Th2平衡的调控作用等,阐明ITP患者CD5+B细胞的免疫调节功能缺陷;然后比较HD-DXM治疗前后ITP患者CD5+B细胞上述功能的变化,揭示HD-DXM改善CD5+B细胞免疫调节功能的作用,从而帮助我们认识CD5+B细胞在ITP发病机制中的作用,并进一步从B细胞免疫调节功能角度加深对HD-DXM作用机制的理解;最后在TLRs信号传导通路中初步鉴定出可能导致ITP患者CD5+B细胞免疫调节功能障碍的分子缺陷。方法 （一）采集符合纳入标准的初发ITP患者接受HD-DXM治疗前后及健康志愿者静脉血各2mL, Ficoll密度梯度离心法分离外周血单形核细胞（PBMCs）;PE-CD5/FITC-CD19流式抗体标记,流式细胞术检测CD5+CD19+B细胞的数量;在佛波酯（PMA）、离子霉素及布雷菲尔德菌素A（BFA）刺激条件下体外培养24小时后收获细胞,表面标记PE-CD5/FITC-CD19,固定、破膜后标记APC-IL-10,流式细胞术检测各细胞亚群胞内IL-10平均荧光强度及IL-10+细胞比例：留取部分标本以荧光实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）方法检测IL-10 mRNA表达;酶联免疫吸附法（ELISA）检测血浆和培养上清液IL-10浓度。（二）采集符合纳入标准的初发ITP患者接受HD-DXM治疗前后及健康志愿者静脉血各20mL,分离PBMCs,免疫磁珠方法分别纯化出CD5+CD19+B细胞、CD5-CD 19+B细胞和CD4+T细胞,CFSE标记CD4+T细胞,接种于预包被CD3 mAb和CD28 mAb的96孔培养板,以不同梯度比例与CD5+CD19+B细胞或CD5-D19+B细胞共培养3-6天后,流式细胞术检测CD4+T细胞增殖状态;细胞标记PI/Annexin-V以检测其凋亡状态;细胞培养上清液以ELISA方法检测IL-4及IFN-y的浓度;RT-PCR法检测T-bet和GATA-3 mRNA的表达。（三）采集初发ITP患者及健康志愿者静脉血各20mL,分离PBMCs,免疫磁珠方法分别纯化出CD5+CD19+B细胞,运用PCR Array的方法,分析ITP患者CD5+B细胞中TLRs及其下游信号传导通路异常表达的分子。结果（一）ITP患者外周血CD5+B细胞占淋巴细胞的比例及绝对值计数均显著高于正常人,而且胞内IL-10染色表明ITP患者CD5+B细胞表达更高的IL-10平均荧光强度;RT-PCR结果提示ITP患者IL-10mRNA表达亦高于正常对照。但在体外培养上清液中,ITP患者的IL-10浓度明显低于正常对照。在经过HD-DXM有效治疗的患者,外周血CD5+B细胞数量恢复正常,其胞内IL-10表达进一步加强,IL-10 mRNA仍维持在较高水平,而培养上清液中IL-10的浓度则与正常相当。（二）当CD5+B细胞与CD4+T细胞共培养时,正常对照来源的CD5+B细胞可以抑制CD4+T细胞的增殖,并呈现剂量依赖效应。同时,CD5+B可促进CD4+T细胞的凋亡。与此相反,CD5-B细胞并不能抑制CD4+T细胞增殖,反而在体外培养72小时后,CD4+T细胞的增殖轻度增加,但这种差异尚不具有统计学意义。CD5-B细胞对CD4+T细胞的凋亡无明显影响。在ITP患者中,CD5+B细胞的免疫调节功能明显受损。CD5+B细胞与CD4+细胞的比例增加至3：1时方才显现出对CD4+T细胞增殖的抑制作用。1TP患者CD5+B细胞促进CD4+T细胞凋亡的能力亦存在缺陷。接受HD-DXM治疗后,CD5+B细胞抑制CD4+T细胞增殖的能力增强,促进凋亡的能力也可恢复至与正常相当。在健康对照中,在B：T细胞的比例仅为1：5时,CD5+B细胞即可明显抑制CD4+T分泌IFN

关键词： 调节性B细胞(Breg)   白介素-10(IL-10)   自身免疫   疱病   自身抗体  

摘要： 自身免疫性疱病（autoimmune bullous diseases, AIBDs）是一组临床表现为红斑、糜烂、水疱、大疱的自身免疫性疾病，病情多顽固且易反复发作[1,2]。目前认为该类疾病的发病主要是由致病性抗体与抗原结合并激活一系列的免疫炎症反应导致表皮间或者真皮基底膜带的不同粘附分子被破坏而致病。大疱性类天疱疮（bullouspemphigoid，BP）和寻常型天疱疮（pemphigus vulgaris，PV）是最为常见的靶抗原明确的自身免疫性疱病[3-5]。PV中自身反应性B细胞和CD4+T细胞识别的主要靶抗原为桥粒芯糖蛋白1（Dsg1）和桥粒芯糖蛋白3（Dsg3），BP中主要靶抗原为大疱性类天疱疮抗原1和抗原2，即BPAG1（BP230）和BPAG2（BP180），目前认为BP180是BP主要的致病性抗原，其胞外端的第16位非胶原编码区（NC16A）区域是主要的致病性靶表位区[6-9]。 近年来的研究证实致病性自身抗体的产生是自身免疫性疱病的关键致病因素[10]。但是自身抗体是如何产生的，以及免疫调节细胞如调节性B细胞（regulatory Bcells, Breg）、调节性T细胞（regulatory T cells, Treg）以及体液免疫中辅助B细胞产生抗体的滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cells，Tfh）在自身免疫性疱病发病中的作用目前均不清楚。 B细胞是否像T细胞一样存在多种不同调节功能的细胞亚群是目前免疫学研究的热点，并于近年取得了很多重要的研究发现。目前已经明确并得到公认在小鼠体内存在一群主要通过分泌白介素10（IL-10）而发挥负向免疫调节作用的为数较少的Breg亚群，其表面标记为CD19+CD5+CD1dhi，并且在多种疾病包括I型糖尿病、接触性超敏反应、胶原诱导的关节炎等动物模型中证实了其对免疫炎症反应的抑制作用[11-13]。2011年美国杜克大学的一个研究小组证实了类似小鼠调节性B细胞的人调节性B细胞亚群的存在，其主要的表面标记为CD19+CD24hiCD27+,并发现该细胞亚群与多种自身免疫性疾病有着密切的联系[14]。Breg细胞与自身免疫性疱病的关系如何？Breg细胞对致病性自身抗体的产生有什么样的影响？本课题通过检测寻常型天疱疮和大疱性类天疱疮患者外周血中Breg细胞水平，研究Breg细胞与AIBDs发病的相关性，通过观察Breg细胞对大疱性类天疱疮抗体产生的影响，初步探讨Breg细胞参与AIBDs发病过程中抗体产生的机制，从而深化对AIBDs发病机理的认识，为其治疗提供新的思路。 目的：明确Breg细胞与PV和BP两种疾病的相关性，确定BP患者外周血Breg细胞的负向免疫调节功能，观察Breg细胞对大疱性类天疱疮致病性自身抗体产生的影响，探讨其在AIBDs发病中的重要作用。 方法： 1)收集PV和BP患者及健康对照者外周血，分离提取获得相应的血清、PBMC以及RNA； 2)利用流式细胞术观察患者PBMC中Breg细胞水平的变化； 3)利用Realtime-PCR和Elisa方法分析患者及健康对照者的外周血中IL-10的表达水平； 4)利用磁珠分选及流式细胞术分选健康人以及BP患者外周血的Breg细胞(CD19+CD24hiCD27+)和效应T细胞（CD4+CD25-）；通过构建细胞共孵育模型，研究Breg细胞对效应T细胞的负向免疫调节功能； 5)原核表达BP自身抗原BP180-NC16A，以该抗原刺激BP患者PBMC，通过检测培养上清中致病性抗体水平的变化，比较Breg细胞是否影响致病性抗体的产生。 结果：自身免疫性疱病PV、BP患者外周血中Breg细胞水平明显高于健康对照组。患者外周血中IL-10在蛋白水平及RNA水平与健康对照组相比没有显著差异。健康人外周血中Breg细胞能够明显抑制CD4+T细胞IFN-γ、TNF-α以及IL-4的产生和CD4+T细胞的增殖，而来自BP患者的Breg细胞对CD4+T细胞IFN-γ、TNF-α、IL-4的产生以及CD4+T细胞增殖的抑制作用存在缺陷。来自BP患者的B细胞对BP180-NC16A抗原具有抗原特异性反应，其分泌的致病性抗体水平明显升高；而清除Breg细胞亚群(CD19+CD24hiCD27+)后进行BP180-NC16A抗原刺激培养，发现在无Breg细胞情况下抗体产生水平未受明显影响。 结论：BP和PV患者外周血中Breg细胞数量增多，提示Breg细胞可能与自身免疫性疱病的发病有相关性。BP患者Breg细胞负向免疫调节功能存在缺陷，而且Breg细胞不能有效抑制辅助性T细胞和产生抗BP180NC16A抗体的B细胞的活性

关键词： TGF-B   CD4+CD25。T细胞   诱导性T调节细胞(Treg细胞)  

摘要： 目的：研究TGF．B1是否能在人母。胎界面诱导生成T调节性（Treg）细胞。方法：早孕妇女外周血和蜕膜CD4＋CD25。T细胞中加入不同浓度的TGF-131（0ng／ml、2ng／ml、5ng／ml、10ng／m1）分别于培养后第2日、第4日和第6日用流式细胞仪检测培养Foxp3的表达情况，随后将诱导生成的CD4＋Fox03＋T细胞与CD8＋T细胞混合培养，观察后者凋亡因子cD95配体（CD95L）的表达情况。结果：体外培养中，TGF．B1可诱导早孕妇女的外周血和蜕膜CD4’CD25-T细胞生成诱导性Treg细胞，随着培养时间增加而增强诱导效应，且在***浓度为5ng／ml时诱导功能最强；诱导生成的CD4＋Foxp3＋T细胞具有促进效应细胞CD8’T细胞凋亡的功能。结论：体外培养中，TGF-131能将人外周血和蜕膜诱导生成Treg细胞，且具有免疫抑制功能，有良好的免疫治疗前景。

关键词： 调节性B细胞   食管癌   B10   Br3   Breg   IL-10   TGF-β   FoxP3  

摘要： 研究背景：食管癌是一种常见的恶性肿瘤，占全球癌症发病率的第八位。我国食管癌的发病率高于世界水平，在癌症中占第六位，发病率为20.85/10万。目前，食管癌的治疗仍以手术、放疗和化疗为主，很少注意到患者自身免疫的情况。近些年有很多关于肿瘤微环境的研究，T细胞中调节性T细胞（regulatoryTcells,Tregs）亚群是引起肿瘤患者体内免疫抑制的重要因素。随着Tregs研究的进展，近年来又发现一类具有负向调节功能的B细胞亚群—调节性B细胞（regulatoryBcell,Bregs）。已证实Bregs与自身免疫病关系密切，也有学者开始关注Bregs与肿瘤的关系，但到目前为止尚未见Bregs和食管癌相关性的报道。 目的：检测食管癌患者手术前、手术后1天和手术后7天以及健康对照者外周血Bregs动态变化，探讨Bregs在食管癌发生、发展中的作用。方法：选取食管癌患者30例和健康对照者30例，用流式细胞仪检测食管癌患者手术前、手术后1天和手术后7天以及健康对照者外周血Bregs亚群B10（CD5+CD19+IL-10）、Br3（CD5+CD19+TGF-β）和Breg（CD5+CD19+FoxP3）的表达量，比较食管癌与健康对照者及食管癌术后变化规律。 结果：食管癌患者B10的表达量（2.52±0.41%）高于健康对照者(1.56±0.28%)，P＜0.05；术后1天B10表达量（3.59±0.29%）高于术前（2.52±0.41%），术后7天B10的表达量（8.36%±0.51%）高于术后1天（3.59±0.29%），P＜0.05。食管癌患者Br3的表达量（6.13±0.57%）与健康对照者（5.91±0.23%）无明显差异，P＞0.05；术后1天Br3的表达量（4.54±0.41%）低于术前（6.13±0.57%），P＜0.05；术后7天Br3的表达量（5.62±0.42%）高于术后1天（4.54±0.41%），P＜0.05。食管癌患者Breg的表达量（8.35±1.04%）高于健康对照者（2.91±0.23%），P＜0.05；术后1天Breg的表达量（4.84±0.16%）较术前（8.35±1.04%）低，P＜0.05；术后7天Breg的表达量（4.02%±0.66%）同样低于术前（8.35±1.04%），P＜0.05；术后1天与术后7天无明显变化，P＞0.05。 结论：食管癌患者外周血中的B10高于健康对照者，食管癌患者术后B10升高，提示B10很可能参与了食管癌患者肿瘤免疫的抑制效应。Br3在食管癌患者与健康对照者无明显差异，但是术后1天Br3降低，术后7天高于术后1天，可能和TGF-β的双向调节有关。食管癌患者外周血中Breg较健康对照者高，术后降低，表明减少瘤负后机体免疫抑制减轻，机体免疫功能有所恢复。Bregs在食管癌的发生发展起重要作用。

关键词： 狼疮性肾炎   热毒炽盛证   调节性T淋巴细胞(Treg)   B淋巴细胞   白介素6   白介素10  

摘要： 目的：研究外周血中调节性T细胞（Treg）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、B淋巴细胞活化指标（CD19+CD69+）及其凋亡率（AV）的水平变化对狼疮性肾炎（LN）患者的影响及与热毒炽盛证的关系。 方法：1、选择活动期和缓解期LN患者60例,用流式细胞仪三色荧光标记法检测外周血Treg、CD19+CD69+、AV水平,用CBA流式蛋白分析系统检测外周血中IL-6、IL-10的水平。2、根据中医辩证标准,将入选的LN患者分为热毒炽盛证组和肝肾阴虚证组,分别统计上述指标的检测结果,进行统计分析。 结果：1、①活动期LN患者Treg水平较缓解期、对照组降低（P＜0.01）;缓解期Treg与对照组比较差异无统计学意义;②活动期和缓解期LN患者CD19+CD69+、AV水平较对照组显著升高（P＜0.01）;③活动期LN患者CD19+CD69+、AV、IL-10、IL-6水平较缓解期显著升高（P＜0.01）。2、①LN患者活动指数（SLEDAI）与ds-DNA、AV、IL-10、IL-6之间呈正相关,与Treg呈负相关（P＜0.01）,与CD19+CD69+水平无相关性;②Treg与CD19+CD69+、AV无相关性,与IL-10、IL-6呈负相关（P＜0.05）;③IL-6与ds-DNA、CD19+CD69+、AV、IL-10呈正相关;④IL-10与ds-DNA、AV呈正相关,与CD19+CD69+无相关性;⑤AV与CD19+CD69+呈正相关（P＜0.01）。3、①热毒炽盛组LN患者CD19+CD69+、AV水平较对照组显著升高（P＜0.01）;Treg水平较对照组低,有显著性差异（P＜0.01）;②肝肾阴虚组CD19+CD69+、AV水平较对照组显著升高（P＜0.01）;Treg水平较对照组低,但无显著性差异;③热毒炽盛组LN患者CD19+CD69+、AV、IL-6、IL-10水平较肝肾阴虚组显著升高CP＜0.01);Treg水平较肝肾阴虚组低,有显著性差异（P＜0.01）。 结论：1、LN患者外周血中Treg、B淋巴细胞活化及凋亡率、IL-6、IL-10水平的变化,可作为狼疮性肾炎活动性的指标。2、热毒炽盛证组外周血中Treg、B淋巴细胞活化及凋亡率、IL-6、IL-10水平与肝肾阴虚证组有差异,说明LN患者热毒变化与外周血中Treg、B淋巴细胞活化及凋亡率、IL-6、IL-10水平变化相关;Treg水平降低,B淋巴细胞活化及凋亡率、IL-6、IL-10水平增高可能是出现热毒炽盛证的内在因素之一。

关键词： Graves病   CD4+CD25+调节性T细胞   调节性B细胞   CD19+CD24hiCD27+B细胞   IL-10  

摘要： 第一部分调节性B细胞在Graves病发病中的作用及机制研究 (一)Graves病患者外周血调节性B细胞的表型鉴定及数量分析 [目的]通过体外实验确定Graves病患者外周血调节性B细胞归属的亚群,比较Graves病患者和健康志愿者外周血调节性B细胞亚群数量的差异； [方法]本课题组自2011年2月至2011年11月在内分泌科门诊及病房入选Graves病初发患者15例、病情控制患者19例、健康志愿者36例。收集受试者外周血,分离外周血单个核细胞,加入CpG+PIB培养5小时,流式细胞仪检测并比较Graves病患者和健康志愿者外周血CD19-IL-10调节性B细胞的百分含量；流式细胞分选仪分选CD19+B淋巴细胞,Real-Time PCR检测并比较Graves病患者和健康志愿者外周血CD19+B淋巴细胞的IL-10mRNA表达水平的差异；比较IL-10+及IL-10-外周血单个核细胞各种分化抗原标志(CD19、CD24、CD38、IgM、IgD、CD5、CD10、 CD27、CD1d)银光强度的差异,确定Graves病患者外周血调节性B细胞归属的亚群,并用流式细胞仪检测并比较Graves病患者和健康志愿者外周血调节性B细胞亚群百分含量的差异； [结果]Graves病初发患者外周血CD19-IL-10+调节性B细胞百分含量及IL-10mRNA表达水平比病情控制患者和健康人明显减少(P<0.05)；Graves病患者外周血CD19+CD24+CD27-B细胞亚群属于调节性B细胞,Graves病初发患者外周血CD19-CD24biCD27+B细胞百分含量比病情控制患者和健康人明显减少(P<0.05)。 [结论]Graves病患者外周血CD19-IL-10调节性B细胞和ICD19-CD2biCD27-B细胞亚群的百分含量较病情控制患者和健康人明显减少,这表明调节性B细胞在Graves病的发病中可能起到了一定作用。 (二)Graves病患者外周血调节性B细胞的功能分析及机制研究 [目的]比较Graves病患者和健康志愿者外周血CD19+CD24hiCD27+B细胞对CD4+T细胞免疫抑制功能的差异,并探讨其发挥免疫抑制作用的途径； [方法]本课题组自2011年7月至2011年12月在内分泌科门诊及病房入选初发患者6例、病情控制患者6例、健康自愿者6例。收集受试者外周血,分离纯化的外周血CD19+CD24hiCD27+B细胞及CD4+T细胞共培养,培养液中加入***40L和抗-CD3共培养5天,最后6小时加入PIB, BrdU ELISA方法检测Graves病患者和健康志愿者外周血CD4+T细胞增殖水平,流式细胞仪检测并比较Graves病患者和健康志愿者外周血CD4+IFN-γ-和CD4+TNF-α‘百分含量的差异；在共培养体系中加入IL-10抗体,探讨IL-10在CD19+CD24hiCD27'B细胞发挥免疫抑制功能中所起的作用；流式细胞仪检测共培养体系中CD4+CD25hiCD127loFoxp3+调节性T细胞含量,探讨调节性T细胞在CD19+CD24hiCD27+B细胞发挥免疫抑制功能中所起的作用； [结果]与健康志愿者比较,Graves病初发和病情控制患者CD19+CD24hiCD27+B细胞分泌IL-10明显减少(P<0.05),Graves病初发和病情控制患者外周血CD19+CD24hiCD27+B细胞亚群对CD4*T细胞增生和分泌IFN-γ、TNF-α的抑制作用明显减弱(P<0.05)。外周血中CD19+CD24hiCD27+B细胞通过IL-10抑制CD4+T细胞分泌IFN-γ,但不通过IL-10抑制CD4+T细胞增生和CD4+T细胞分泌TNF-α;和健康志愿者比较,Graves病初发和病情控制患者外周血CD19+CD24hiCD27+B细胞亚群诱导产生CD4+CD25hiCD127loFoxD3+调节性T细胞的数量减少导致其免疫抑制功能下降。 [结论]Graves病初发和病情控制患者外周血CD19+CD24hiCD27+B细胞免疫抑制功能较健康人明显减少,这表明调节性B细胞在Graves病的发生、发展过程中可能起到了一定作用。病情控制的患者CD19+CD24hiCD27+B细胞亚群的免疫抑制功能仍明显低于正常人,这说明目前临床常用的药物能使Graves病患者本身的免疫缺陷部分改善,但不能得以完全恢复。 第二部分调节性T细胞在Graves病发病中的作用 [目的]通过对不同阶段Graves病患者外周血中淋巴细胞亚群数量以及CD4+CD25+调节性T细胞功能的测定,研究调节性T细胞在Graves病发病中的作用。 [方法]采集初发、病情控制的Grav

关键词： 自身免疫性疾病   调节性B细胞   IL-10  

摘要： 调节性B细胞的免疫应答是通过对炎性反应和免疫应答的调节作用,这种B细胞被称之为调节性B细胞。调节性B细胞的调节作用是通过分泌TGF-B和IL-10等调节性细胞因子来影响免疫细胞的功能。所以,知道调节性B细胞的活化机制、在自身免疫性疾病中的作用和生物学功能具有非常重要的意义。

关键词： 系统性红斑狼疮   滤泡辅助性T细胞   调节性B细胞   白细胞介素21   白细胞介素10   JAK-STAT3   骨髓间充质干细胞  

摘要： 研究背景 系统性红斑狼疮(SLE)是一种累及全身多器官、多系统的慢性自身免疫性疾病,多发于育龄期妇女,我国的发病率远高于国外。SLE发病机制复杂,目前未完全阐明,但明确的是免疫系统的失调和紊乱参与了SLE的发病及后续的多系统累及。因此,深入揭示SLE发病的免疫学机制,对寻找新的治疗靶点和治疗方法,进一步提高SLE的临床治疗水平具有重要的意义。 滤泡辅助T细胞(Tfh)是一群近年来发现的Th细胞,主要分泌IL-21,传统认为其功能以辅助效应性B细胞分化、成熟及分泌抗体为主,在自身免疫性疾病的发生发展中具有重要的作用,研究表明狼疮中Tfh细胞比例增加,但Tfh细胞的增加与狼疮病情活动的关系目前无相关报道。调节性B细胞(Breg)是一群具有免疫调节功能的B细胞,在胶原诱导性关节炎(CIA)、炎症性肠病(IBD)和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)等动物模型中具有重要的免疫抑制作用。但Breg细胞在SLE中作用,目前研究结果不尽相同。狼疮体内Breg细胞的比例如何,与病情活动度有无相关性,且Tfh细胞是否对Breg细胞具有辅助作用,其可能的辅助机制如何,目前国内外尚无明确报道。 此外,间充质干细胞(MSC)近年来作为狼疮治疗的新方法,在动物实验和临床中取得了初步的疗效,其作用机制主要通过分泌抑制性的细胞因子或细胞接触抑制发挥免疫调节作用,但MSC是否能通过调节Tfh和Breg细胞来发挥免疫调节作用目前无明确结论,有待进一步的研究。 研究目的 第一部分：明确SLE患者外周血中Tfh和Breg细胞比例的变化,分析Tfh和Breg细胞间的相关性,及与SLE病情活动的相关性； 第二部分：探讨MRL/lpr狼疮鼠中Tfh和Breg细胞比例变化和狼疮病情活动的相关性； 第三部分：明确Tfh细胞及其分泌的IL-21对Breg细胞分化的调控作用和机制； 第四部分：明确MSC输注对MRL/lpr狼疮鼠的治疗作用,及对Tfh和Breg细胞的调节作用。 研究内容与方法 第一部分 荧光显微镜下检测SLE患者外周血中是否存在Tfh和Breg细胞；免疫组化检测SLE皮损组织中IL-10阳性B细胞的浸润情况；流式细胞仪检测30例SLE患者和15例正常对照外周血中Tfh和Breg细胞的比例,并分析两者的相关性；实时定量RT-PCR (real-time RT-PCR)检测Tfh和Breg细胞相关细胞因子和转录因子mRNA的表达；酶联免疫吸附实验(ELISA)检测SLE患者血清中IL-21、IL-10、ds-DNA和ANA的浓度；结合临床SLEDAI评分分析SLE中Tfh和Breg两群细胞间的相关性及与SLE病情活动的关系。 第二部分 流式细胞仪检测MRL/Ipr狼疮鼠脾细胞中Tfh和Breg细胞的比例；real-time RT-PCR检测Tfh和Breg细胞相关细胞因子及转录因子mRNA的表达；ELISA检测外周血清中ds-DNA、ANA、IL-21、IL-10的浓度；免疫组化检测脾脏生发中心(GC)的变化,及IL-21和IL-10在脾脏中的表达；分析Tfh和Breg两群细胞间的相关性及与狼疮病情活动的关系。 第三部分 从小鼠脾细胞中分选Tfh细胞,体外培养后收集上清备用;分选小鼠脾脏Naive B细胞,体外培养时加入上一步收集的Tfh细胞培养上清,继续培养2-3天后流式细胞仪检测Breg细胞的比例,ELISA检测上清中IL-10的浓度；IL-21体外直接作用于小鼠Naive B细胞,研究IL-21对Breg细胞分化和IL-10分泌的影响；同时研究IL-21对Breg细胞分化过程中STAT3活化的影响,并通过阻断JAK和p-STAT3的活化,明确JAK-STAT3信号通路在IL-21介导的Breg细胞分化过程中的作用；并进一步研究IL-21诱导的Breg细胞的免疫抑制作用。 第四部分 体外全骨髓贴壁法分离B6鼠来源的MSC,经体外培养及纯化细胞至第四代(P4),流式细胞仪检测其表面的8种标志。MSC与脾细胞共培养后流式细胞仪检测MSC对Tfh和Breg细胞分化的影响,MSC与体外分选的CD4+T细胞及CD19+B细胞共培养,检测MSC的对T、B淋巴细胞中细胞因子和转录因子的调控。分离纯化的MSC经尾静脉注射入MRL/Ipr狼疮鼠体内,继续饲养8周后检测狼疮鼠的病情变化,流式细胞仪检测MSC输注治疗后MRL/Ipr狼疮鼠脾细胞中Tfh和Breg细胞比例的变化。 研究结果 第一部分 1、SLE患者外周血中存在循环的Tfh和Breg细胞,两群细胞比例增多并呈正相关,SLE皮损中IL-10阳性的B细胞增加： 2、SLE患者外周血中Tfh分泌的IL-2