关键词： 原发性肝癌   调节性B细胞   免疫抑制  

摘要： 背景：调节性B细胞(Breg)是一群具有调节作用的B细胞,在自身免疫性疾病和炎症性疾病中具有重要的保护作用。Breg主要通过分泌IL-10发挥负调节功能,但这种负调节作用在肝癌等肿瘤性疾病中作用机制尚不清楚。因此,阐明肝癌进展中Breg的免疫学特征及其作用机制有利于深刻理解肝癌的发生机理。设计和方法：收集乙型病毒(HBV)相关性肝细胞癌患者61例(年龄28-74岁,巴塞罗那分期：早期20例、中期14例、进展期27例),乙型肝炎肝硬化11例,健康对照28例。采用流式细胞仪及免疫组化染色检测患者及健康对照外周血Breg表达的百分比,分析Breg与肿瘤进展的关系。其中34例早、中期患者进行了手术切除治疗,根据术前Breg表达中位值分为早、中期低表达组、早、中期高表达组,采用Kaplan-Meier法计算各组的无疾病进展时间(DFS)。27例进展期无法手术治疗患者根据其Breg表达中位值分为晚期低表达组和晚期高表达组,观察其总体生存时间(OS)。结果：肝细胞癌患者外周血Breg表达频率明显高于健康对照,并且随着疾病进展Breg频率逐渐升高。肝癌患者肝组织中Breg分布主要集中在癌与癌旁的交界部位。生存分析发现肝癌患者外周血以及肝脏浸润的Breg数量与患者肿瘤复发时间呈正相关,并且是患者生存和肿瘤复发的独立预测因素。结论Breg与肝癌的疾病进展密切相关,提示Breg表达水平可以做为判断肝癌患者生存期及肿瘤复发的重要免疫学指标。

关键词： 类风湿性关节炎   调节性B细胞   免疫反应   生物学功能  

摘要： 目的:　　调节性B细胞(regulatory B cells，Bregs)是近年来发现的一类B细胞亚群，能分泌各种细胞因子，它们有利于自身免疫疾病中免疫耐受的维护，并且能抑制过量的炎症反应。本研究主要测定不同疾病活动度类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)病人外周血循环的两种调节性B细胞亚型，以及血清中相关细胞因子水平，通过分析它们与RA疾病活动度的相关性，来探索调节性B细胞在RA疾病中发挥的作用，进一步理解它们的生物学功能，也为RA疾病寻找可行的药物治疗靶点。　　方法:　　1.浙江省台州医院伦理委员会支持该项研究，所有病人均签知情同意书。根据1987年美国风湿病学院标准收集到59例不同疾病活动度的RA患者，同时收集到25例健康个体参与该研究。每个RA患者疾病活动度均根据28个关节疾病活动度得分来评价。并且，记录每个病人的临床实验室标志物，包括血沉(ESR)，类风湿因子(RF)，所有病人均排除肝，肾疾病和其它炎症或者自身免疫疾病。同时记录健康个体有关实验室指标。根据疾病活动度将病人分为三组，低活动度组(low activity，LA)，(DAS＜3.2)，中活动组(moderateactivity，MA)(3.2＜DAS＜5.1)，高活动度组(high activity，HA)(DAS＞5.1)。　　2.所有参与者均采集5ml肝素抗凝静脉血。分离血清-80℃保存。全血细胞分类计数和ESR通过血常规分析仪(Alifax TEST I)检测，超敏C反应蛋白(hs-CRP)和RF用生化分析仪(IMMAGE800)测定。　　3.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测所有参与者血清白介素10(IL-10)，白介素21(IL-21)，颗粒酶B(Granzyme B，GzmB)浓度。比较RA患者与正常对照之间的差异，并分析与RA患者Bregs细胞，及疾病活动度DAS28之间的关系。　　4.利用流式细胞术检测所有参与者外周血中调节性B细胞CD19+CD5+CD1dhi和CD19+CD5+GzmB+细胞的比例，探讨分析二者与RA疾病活动度的关系。分析与分泌的相关细胞因子之间的关系。　　5.实验数据采用SPSS统计软件进行分析（17.0版），数据用均值(mean)与标准误(standard error，SE)来描述，统计比较采用Mann-Whitney U-tests，两组之间相关性分析利用Spearman相关法，P＜0.05为差异具有统计学意义。　　结果:　　1.为了评价RA患者外周血细胞因子微环境，我们测定了RA患者和正常对照组血清IL-10，IL-21，GzmB水平。与正常对照相比较，RA患者血清中IL-10和IL-21的浓度是降低的，（IL-10:4.632±0.380 pg/mL vs.3.563±0.205pg/mL, P=0.0094;IL-21:398.5±25.28 pg/mL vs.320.9±14.61 pg/mL,P=0.0076)，然而GzmB水平与对照组相比没有不同（P=0.4772）。　　***患者细胞数量降低并且与RA疾病活动度负相关。我们观察到与健康对照组(healthy control，HC)(4.208±0.468％)相比，CD19+CD5+CD1dhi细胞的百分比在HA组(2.742±0.432％)和MA组(3.306±0.418％)是升高的，　　(PHA=0.0038，PHA=0.0409)。然而，三组RA没有差异（P＞0.05）。我们分析了CD19+CD5+CD1dhi细胞数量和RA患者临床特征指标间的相关性，CD19+CD5+CD1dhi细胞数量与DAS28显著负相关（r=-0.396，P=0.005），另外，CD19+CD5+CD1dhi细胞与血清IL-10，ESR，CRP，RF水平无统计学相关性（P＞0.05）　　***患者外周血中CD19+CD5+GzmB+细胞数量升高。我们检测了RA患者组和对照组CD19+CD5+B细胞亚群GzmB的表达，与CD19+CD5+CD1dhi细胞相反，我们观察到CD19+CD5+GzmB+细胞百分比升高，（LA:2.467±0.418％，P=0.0328;MA:2.200±0.232％,P=0.0352;HA:2.114±0.212％,P=0.0446;HC:1.632±0.191％)。但是，三组RA患者组没有显著差异（P＞0.05）。另外，RA患者中血清IL-21和GzmB浓度呈强正相关（r=0.4316，P=0.0048）。然而，CD19+CD5+GzmB+细胞和DAS28得分或血清IL-21水平无统计学相关（P＞0.05）。　　结论:　　RA患者血清中IL-10，IL-21浓度较正常人，水平降低，并且，就我们的数据分析，二者之间存

关键词： 胸腺B细胞   调节性B细胞   调节性T细胞   T细胞分化   免疫稳态  

摘要： 背景:胸腺是机体重要的中枢免疫器官,是T细胞分化、发育、成熟的场所。胸腺细胞经过阳性选择、阴性选择逐渐分化为成熟的T细胞,并迁移到外周免疫器官发挥功能。胸腺为T细胞发育提供了一个复杂的微环境,该微环境由胸腺基质细胞、可溶性分子以及细胞外基质共同构成,有序调控T细胞的发育、成熟和迁移等。近年来有少数研究工作证明,人和鼠的胸腺中均存在着少量的B细胞,其比例占到整个胸腺中所有细胞的0.1-0.5%。正常胸腺中存在着不同发育阶段的B细胞,初步资料显示,胸腺中B细胞具有一定的生理功能,例如参与胸腺内T细胞的分化发育过程。胸腺B细胞可定位于胸腺皮质和髓质的连接处,该区域被认为是胸腺T细胞分化发育过程中阴性选择的发生场所,由此研究人员认为胸腺B细胞在T细胞的阴性选择过程中发挥关键作用,然而胸腺B细胞如何参与T细胞的阴性选择过程及影响T细胞分化、发育机制等仍不清楚。在病理状态下,在胸腺内可发生B细胞的浸润和淋巴滤泡的形成等异常表现,少量研究表明,胸腺B细胞的异常可能与自身免疫病的发生发展相关联,但是胸腺B细胞在自身免疫病中的功能和作用机制等仍不清楚。要解答这些问题都有待于进一步阐明胸腺中B细胞的表型、功能和起源等。因此,我们围绕胸腺B细胞的亚群鉴定及胸腺B细胞亚群在免疫调节和应答中的作用及机制进行了初步探讨。目的:探究生理及自身免疫病中胸腺B细胞亚群变化及其在机体免疫调节和应答中的作用及机制。方法:1.首先,为了验证胸腺中是否存在B细胞,应用流式细胞术对小鼠胸腺淋巴细胞进行胞膜染色,对B细胞所占比例和表型进行分析、鉴定;2.为了鉴定胸腺中调节性B细胞及效应性B细胞,我们分析了正常小鼠和自身免疫病系统性红斑狼疮模型小鼠胸腺中B细胞;为了分析胸腺中是否存在调节性B细胞,分离胸腺淋巴细胞,用LPS(10mg/ml)体外刺激后,收集细胞,通过流式细胞术进行胞内染色,分析IL-10的表达水平。在此基础上,通过胞膜染色对胸腺调节性B细胞表型作进一步分析;为了分析自身免疫病中胸腺效应B细胞,分离胸腺淋巴细胞,通过流式细胞术分析了分泌抗体的浆细胞。3.为了进一步检测胸腺调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)内IL-10表达水平,应用流式细胞仪分选调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)和非调节性B细胞(表型为CD19+CD5-CD1dlo)后,通过实时荧光定量PCR检测IL-10 m RNA相对表达量;4.为了研究胸腺调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)体外功能,首先经胞膜染色标记后,应用流式细胞仪分选调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)和非调节性B细胞(表型为CD19+CD5-CD1dlo),并通过磁珠分选CD4+T细胞;一方面用CFSE标记CD4+T细胞后分别与调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)和非调节性B细胞(表型为CD19+CD5-CD1dlo)体外共培养72h,流式检测CD4+T细胞增殖抑制情况;另一方面,直接将CD4+T细胞与调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)和非调节性B细胞(表型为CD19+CD5-CD1dlo)体外共培养72h,收集细胞,经流式胞内染色检测调节性T细胞水平;5.为了研究胸腺调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)体内生理功能,应用流式细胞仪分选调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)和非调节性B细胞(表型为CD19+CD5-CD1dlo)后,经尾静脉回输给CD19cre小鼠和狼疮小鼠,取脾、淋巴结、胸腺等免疫器官和组织,应用流式细胞术检测调节性T细胞,调节性B细胞,CD4-CD8+T细胞和CD8-CD4+T细胞等水平变化;经眼球取血,ELISA分析外周血清中自身抗体滴度;取肾脏,4%甲醛固定后苏木精-伊红染色分析肾脏病理改善状况。6.为了探讨狼疮小鼠胸腺B细胞对T细胞分化的影响,胞膜染色标记后流式分选胸腺B细胞,经尾静脉回输给野生型小鼠,一周后处死小鼠,流式检测ISP细胞,CD4-CD8+和CD8-CD4+T细胞等变化情况。7.为了研究m TOR缺失对胸腺B细胞和ISP细胞的影响,应用流式细胞术检测m TOR+/-小鼠胸腺B细胞、不成熟CD8+T细胞(ISP,表型为CD3lo/-CD4-CD8+)比例和数目的变化。结果:1.在小鼠胸腺中检测到一定比例的B细胞,B细胞占胸腺细胞0.1%;经Ficoll分离胸腺淋巴细胞后,B220+细胞比例提高到13.35%,CD19+细胞比例提高到4.7%,并对B细胞表型做了进一步分析。在胸腺细胞中存在IL-10+B细胞和Ig G+B细胞。2.在正常小鼠胸腺中存在一群表达IL-10的调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi);在IL-10-GFP报告基因小鼠中也发现存在

关键词： ABO血型不合   肝移植   急性肝衰竭   抗体介导的排斥反应   利妥昔单抗   免疫球蛋白   免疫耐受   调节性B细胞  

摘要： 目的 在供肝资源稀缺、无血型相合供肝的情况下,急诊ABO血型不合肝移植是挽救急性肝功能衰竭患者生命的有效手段。但传统的血型不合肝移植围手术期免疫抑制方案过于复杂,需要术前数周开始进行特殊的准备,不适用于急诊肝移植及危重症患者。因此,我们探索并尝试了一种简化的围手术期跨越血型屏障方案（以利妥昔单抗和免疫球蛋白为基础,不采用血浆置换、脾脏切除和肝脏灌注）,观察其是否可以有效预防血型不合肝移植术后发生血型抗体介导的排斥反应;并通过与同期开展的血型相合肝移植治疗急性肝衰竭病例在生存率、并发症等各方面进行比较,探讨其在急诊ABO血型不合肝移植治疗急性肝衰竭中应用的可行性、有效性和安全性。 同时,我们还尝试通过动物实验建立ABO血型不合肝移植受者人PBMC-NOD/SCID小鼠嵌合体模型,以供体血型红细胞抗原致敏,检测小鼠血型抗体水平,以此来验证并阐明ABO血型不合肝移植术后可以产生针对供体血型抗原的特异性免疫耐受。并通过比较健康人群、血型不合患者术后早期和术后晚期的CD19+CD24hiCD38hi调节性B细胞水平,初步探讨了调节性B细胞在血型抗原特异性免疫耐受中可能发挥的作用。 材料与方法 第一部分： 急诊ABO血型不合肝移植治疗急性肝衰竭---利妥昔单抗联合免疫球蛋白简化方案的应用 1.病人资料：分析2010年1月-2013年7月,我中心（浙江大学医学院附属第一医院肝移植中心）共为101例急性肝衰竭患者进行急诊肝移植治疗（尸体供肝）,血型相合组66例,血型不合组35例;2.围手术期免疫抑制方案：血型不合组患者手术当天使用1剂利妥昔单抗（375mg/m2）,免疫球蛋白手术当天开始使用并连续使用10天（0.4g/kg*10d）。两组术后基础免疫抑制方案包括巴利昔单抗、肾上腺糖皮质激素、他克莫司和吗替麦考酚酯;3.术后抗感染治疗方案;4.他克莫司血药浓度检测：酶联免疫吸附分析法;5.血型不合组患者围手术期抗供体血型抗体（IgM）效价检测：盐水稀释法;6.血型不合组患者围手术期CD20+B淋巴细胞检测：直接免疫荧光标记流式细胞术;7.统计学分析：所有统计分析均使用SPSS17.0统计软件包进行统计学处理。连续变量以平均数和标准差描述,非连续变量以数字和百分比描述,以Students’t检验或卡方检验比较组间差异。患者累积生存率与移植肝存活率使用Kaplan-Meier法统计,组间生存曲线比较使用log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。 第二部分： ABO血型不合肝移植诱导供体血型抗原特异性免疫耐受的实验研究 1.研究对象基本数据：2例接受ABO血型不合肝移植长期生存受者作为实验组,并根据其供受者血型设立相应阳性对照与阴性对照,共6例研究对象。分别编号为1A（血型不合受者AB→A）,阳性对照1B（血型相合受者A→A）,阴性对照1C（血型相合受者AB→AB）;2A（血型不合受者AB→）,阳性对照2B（血型相合受者O→O）,阴性对照2C（血型相合受者AB→AB）。另入组18例健康志愿者和6例血型不合肝移植术后早期受者作为CD19+CD24hiCD38hi调节性B细胞检测的对照组;2.主要试剂及其配方;3.主要仪器与设备;4.血型不合受者（1A、2A）外周血抗供体血型抗体（IgM）检测：盐水稀释法;5.人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）的分离：葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法,（1A、1B、1C、2A、2B、2C）;6. NOD/SCID小鼠饲养;7.构建人PBMC-NOD/SCID小鼠嵌合体模型及红细胞致敏：第一天,PBMCs腹腔注射小鼠;第五天,AB型红细胞免疫小鼠;第十四天,获取小鼠血清;8. PBMC-NOD/SCID嵌合小鼠血型抗体（IgM）检测：酶联免疫吸附分析法;9.健康志愿者、血型不合肝移植术后早期受者和术后长期存活受者（1A、2A）外周血CD19+CD24hiCD38hi调节性B细胞检测：直接免疫荧光标记流式细胞术;10.统计学分析：用SPSS17.0软件计算各组数据的平均数和标准差。用Students’t检验比较组间差异。p＜0.05为差异有统计学意义。 结果 第一部分 1.两组患者肝移植术前基本资料比较无统计学差异;2.两组患者肝移植术后他克莫司血药浓度比较无统计学差异;3.血型不合组供受者血型为AB→O最常见,占34%;4.血型不合组患者术前抗供体血型抗体（IgM）效价1：4-1：1024（平均1：192）,术后迅速下降,术后第1天和第7天分别为1：1-1：32（平均1：16）和1：4-1：128（平均1：28）,并在术后数月维持较低水平。CD20+B淋巴细胞计数在术后迅速

关键词： 胃癌(gastric cancer,GC)   Breg细胞   白介素10(IL-10)   Treg细胞   Th细胞   Tc细胞   叉头状转录因子(Foxp3)   转化生长因子(TGF-β)   免疫逃逸  

摘要： 目的免疫调节在胃癌发生发展及转移中发挥重要作用。近来,研究发现一群具有调节作用的B淋巴亚群——称为调节性B淋巴细胞（regulatory B cells,Breg）。Breg在自身免疫性疾病中的研究已经取得了初步研究结果,但是Breg在胃癌中的作用并不清楚。本研究以原发性胃癌（gastric cancer,GC）为研究对象,检测调节性B淋巴细胞（Breg）在胃癌中的百分比变化,探讨其在胃癌中的表面标志特性,研究Breg细胞在胃癌中可能的作用及相关机制,为调节性B淋巴细胞在胃癌及人类肿瘤甚至其在其他疾病中的研究提供研究基础。方法（1）用流式细胞仪分析的方法测定40例健康对照组（Healthy control,HC）和107例原发性胃癌患者（gastric cancer,GC）外周血中CD19+B淋巴的百分比的状况,研究胃癌患者外周血B淋巴百分比与其肿瘤TNM分期的关系。免疫组织化学染色的方法检测不同TNM分期胃癌患者肿瘤组织局部CD19+B淋巴细胞的分布情况。通过流式细胞术的方法检测和分析胃癌患者正常组织、癌旁组织及肿瘤组织中CD19+B淋巴细胞（CD45+CD19+）在淋巴细胞中的百分比。（2）ELISA方法检测胃癌患者血清中分泌的细胞因子IL-10的水平。流式细胞术分析胃癌患者外周血PBMC及癌旁组织及肿瘤组织B淋巴细胞中CD19+IL-10+B淋巴细胞的百分比。（3）采用多色流式细胞术检测表面标志CD5、CD1d、CD24、CD38、Ig M、CD25、CD10、CD21、CD20各指标在IL-10+B淋巴细胞和IL-10-B淋巴细胞表面平均荧光强度（MFI）表达的不同,确定Breg细胞合适的表面标志为CD19+CD24hi CD38hi。（4）流式细胞术分析胃癌患者外周血PBMC及肿瘤组织淋巴细胞中CD19+CD24hi CD38hi在CD19+B淋巴细胞的百分比变化,分析Breg细胞百分比与肿瘤TNM分期的可能关系。（5）通过流式细胞术分析胃癌患者体内中CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+Th淋巴细胞、CD3+CD8+Tc淋巴细胞、CD3-CD19+B淋巴细胞、CD3-（CD16+56）+NK淋巴细胞、CD3+（CD16+56）+NKT淋巴细胞的百分比,详细分析胃癌患者中各功能细胞亚群如CD4+IFN-γ+Th1细胞、CD4+IL-4+Th2细胞和CD4+Fox P3+Treg细胞的百分比变化。（6）进一步分析胃癌患者中CD19+CD24hi CD38hi Breg细胞与各细胞亚群的相关关系。（7）采用流式细胞分选技术、CFSE染色、细胞共培养、流式细胞检测等方法研究CD19+CD24hi CD38hi Breg细胞对CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+Th淋巴细胞、CD3+CD8+Tc淋巴细胞亚群增殖的影响,检测Breg细胞对Th淋巴细胞、Tc淋巴细胞分泌细胞因子的影响,检测Breg细胞对Treg细胞转化生成的影响。（8）通过功能抗体中和阻断实验评估IL-10及TGF-β在Treg细胞转化过程中是否起到作用。研究中统计分析采用Graph Pad Prism 5.0软件分析。结果（1）40例健康对照和107例胃癌患者外周血标本中B淋巴细胞的百分比无明显差异（14.03%±4.39%vs 15.06%±7.47%,P>0.05）。（2）胃癌患者不同TNM分期（Ⅰ期18例、Ⅱ期40例、Ⅲ期46例和Ⅳ期3例）,分析其外周血中B淋巴细胞百分比与TNM分期的关系,发现不同TNM分期其外周血中B淋巴细胞百分比不同,Ⅰ期>Ⅱ期>Ⅲ期,但Ⅳ期例外:TNM III期胃癌患者外周血CD19+B淋巴细胞的百分比显著低于TNM I期患者（P<0.001）,而且低于TNM II期患者（P<0.05）,而TNM IV患者外周血B淋巴细胞百分比增高,高于TNM III期患者,两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）流式细胞术及免疫组织化学染色都检测到大量B淋巴细胞在肿瘤组织局部的聚集。（4）ELISA检测发现胃癌患者外周血中细胞因子IL-10明显高于健康对照组（P<0.001）。流式细胞术的检测发现胃癌患者外周血中CD19+IL-10+B细胞百分比显著高于健康对照组（P<0.001）。采用流式细胞术的检测方法,检测胃癌患者外周血PBMC及癌旁组织、肿瘤组织B淋巴细胞中CD19+IL-10+B淋巴细胞的百分比,发现胃癌患者肿瘤组织中CD19+IL-10+B细胞百分比高于癌旁组织（P<0.05）,显著高于外周血PBMC（P<0.01）。（5）多色流式细胞术分析IL-10+B淋巴细胞表面的特征发现,IL-10+B淋巴细胞上CD5、CD38、CD24和CD25的荧光强度明显高于IL-10-B淋巴细胞（P<0.001）,IL-10+B淋巴细胞上CD1

关键词： 非节段型进展期白癜风   单个核细胞   B细胞   调节性B细胞  

摘要： 目的:检测非节段型进展期白癜风患者外周血及PBMC培养刺激后B细胞、调节性B细胞的数量,及其表面特异分子表型的表达,探讨调节性B细胞是否参与白癜风的发病机制。方法:非节段型进展期白癜风患者10例,正常人10例,采用流式细胞术,检测外周血CD19+B细胞、CD19+IL-10+B细胞、CD19+CD5highCD1dhighB细胞、CD19+CD24highCD38highB细胞的表达;提取外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)培养刺激后,检测CD19+B细胞、CD19+IL-10+B细胞、CD19+CD5highCD1dhighB细胞、CD19+CD24highCD38highB细胞的表达。结果:1.B细胞及调节性B细胞数量检测1.1外周血B细胞数量检测应用流式细胞术检测非节段型进展期白癜风患者外周血CD19+B细胞百分比为(3.68±2.85)%,正常对照组CD19+B细胞百分比为(4.46±3.95)%,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。1.2外周血调节性B细胞数量检测应用流式细胞术检测白癜风患者外周血CD19+IL-10+B细胞百分比为(0.30±0.16)%,正常对照组CD19+IL-10+B细胞百分比为(0.40±0.35)%,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。1.3 PBMC培养刺激后B细胞数量检测提取PBMC,经过培养刺激后,白癜风患者CD19+B细胞百分比为(4.00±0.96)%,正常对照组CD19+B细胞百分比为(4.48±3.09)%,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。1.4 PBMC培养刺激后调节性B细胞数量检测提取PBMC,经过培养刺激后,白癜风患者CD19+IL-10+B细胞百分比为(3.23±0.79)%,正常对照组CD19+IL-10+B细胞百分比为(1.16±0.88)%,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。2.B细胞表面特征性分子的检测2.1外周血CD19+CD5highCD1dhighB细胞的检测应用流式细胞术检测白癜风患者外周血CD19+CD5highCD1dhighB细胞百分比为(0.48±0.52)%,正常对照组CD19+CD5highCD1dhighB细胞百分比为(0.66±0.30)%,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.2外周血CD19+CD24highCD38highB细胞的检测流式细胞术检测白癜风患者外周血CD19+CD24highCD38highB细胞百分比为(1.02±0.44)%,正常对照组CD19+CD24highCD38highB细胞百分比(1.60±1.54)%,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.3 PBMC培养刺激后CD19+CD5highCD1dhighB细胞的检测提取PBMC,经过培养刺激后,结果显示白癜风患者CD19+CD5highCD1dhighB细胞百分比为(0.56±0.22)%,正常对照组CD19+CD5highCD1dhighB细胞百分比为(0.70±0.79)%,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.4 PBMC培养刺激后CD19+CD24highCD38highB细胞的检测提取PBMC,经过培养刺激后,白癜风患者CD19+CD24highCD38highB细胞百分比为(3.88±1.16)%,正常对照组CD19+CD24highCD38highB细胞百分比为(1.15±0.64)%,两组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。3.外周血B细胞数量与疾病严重程度的相关性为了进一步研究CD19+B细胞及CD19+IL-10+B细胞的数量与白癜风皮损面积是否相关,本研究检测了CD19+B细胞、CD19+IL-10+B细胞的数量与VASI评分的相关性。CD19+B细胞与白癜风患者VASI评分无相关性,r=-0.42,p=0.23。CD19+IL-10+B细胞与白癜风患者VASI评分无相关性,r=0.25,p=0.50。结论:1、非节段型进展期白癜风患者外周血中B细胞及调节性B细胞数量与对照1.3 PBMC培养刺激后B细胞数量检测组相比无明显差异,PBMC经体外培养刺激后,白癜风患者CD19+B细胞表达与对照组比较无明显差异,但CD19+IL-10+B细胞的表达明显升高,提示白癜风患者外周血中可能存在调节性B细胞的前体细胞增多。2、PBMC经体外培养刺激后,白癜风调节性B细胞主要表型为CD19+CD24highCD38high。

关键词： 免疫性血小板减少症   调节性B细胞   白细胞介素10  

摘要： 目的免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)是一种自身免疫介导的血小板过度破坏所致的出血性疾病。B淋巴细胞产生血小板相关抗体破坏血小板,导致血小板数量减少是ITP的主要发病机制[1]。调节性B细胞(regulatory B cells,Bregs)是一类具有负向免疫调控作用的B淋巴细胞亚群,主要通过分泌抑制性细胞因子白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)发挥免疫调节作用[2-4]。Bregs的数量异常和或功能变化可导致多种自身免疫性疾病的发生和恶化[5]。Bregs在ITP患者中的研究数据尚少,我们通过检测ITP患者不同疾病状态及正常对照者外周血Bregs及其功能分子IL-10的变化,并将其与ITP患者相关临床指标进行相关分析,探讨Bregs在ITP发病机制中的作用。方法选取2013年11月至2014年10月于天津医科大学总医院血液科住院的ITP患者67名,其中初诊ITP患者35例,完全缓解ITP患者32例,健康志愿者30名。第一部分采用流式细胞术检测ITP患者及健康对照者外周静脉血Bregs数量(CD19+CD24hiCD38hi/CD19+)第二部分采用流式细胞术检测ITP患者及健康对照者外周静脉血Bregs细胞内功能分子IL-10表达水平。第三部分采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent assay,ELISA)法检测ITP患者及健康对照者外周静脉血上清液中IL-10水平。第四部分ITP患者外周血Bregs水平与T淋巴细胞亚群(CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD4+/CD3+CD8+)、CD16+CD56+自然杀伤细胞(Natural Killer Cell,NK)、HLA-DR+Lin-CD123+浆细胞样树突细胞(plasmacytoid dendritic cells,pDC)、HLA-DR+Lin-CD11c+髓样树突细胞(myeloid dendritic cells,mDC)、血小板抗体(CD41a+IgG、CD41a+IgM)水平、血小板计数、血清免疫球蛋白G、血清免疫球蛋白M、血清免疫球蛋白A、血清免疫球蛋白E等临床指标进行相关性分析。结果①流式细胞术检测ITP患者及健康对照者外周血Bregs水平:ITP初诊组(3.09%±2.57%)显著低于完全缓解组(7.78%±6.59%,p=0.002)和健康对照组(5.42%±3.31%,p=0.003)。②流式细胞术检测ITP患者及健康对照者外周血Bregs中IL-10+细胞比例:初诊组比例(32.30%±12.71%)低于完全缓解组(71.73%±18.08%,P=0.000)和健康对照组(51.01%±17.08%,P=0.026),完全缓解组高于健康对照组(p=0.026)。③初诊组ITP患者Bregs数量分析:初诊组ITP患者经免疫治疗后分析其初诊时Bregs水平,完全缓解组初诊时Bregs水平(4.24%±2.68%)高于难治性ITP组初诊时Bregs水平(1.88%±1.16%,p=0.007);初诊组ITP患者中甲状腺功能正常组Bregs水平(4.80%±3.72%)高于甲状腺功能减低组(1.30%±0.88%,p=0.006)。④ELISA法检测ITP患者及健康对照者外周静脉血上清液IL-10水平:初诊组[(0.943±0.027)pg/ml]低于完全缓解组[(0.987±0.039)pg/ml,P=0.002]和对照组[(1.125±0.221)pg/ml,P=0.045]。⑤统计临床资料与ITP患者外周静脉血Bregs数量进行相关性分析:Bregs与ITP患者外周血T淋巴细胞亚群(CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD4+/CD3+CD8+)、NK细胞、pDC、血小板抗体(CD41a+IgG、CD41a+IgM)水平、血清IgG、血清IgM、血清IgA、血清Ig E均无明显的相关性,与mDC成正相关(r=0.644,P=0.003,n=19),与血小板计数成正相关(r=0.327,P=0.006,n=67)(图3)。结论初诊组ITP患者Bregs数量及其产生IL-10的能力均低于完全缓解组及健康对照组,但经治疗缓解后均得以显著提升。Bregs与外周血mDC及血小板计数成正相关,提示Bregs参与了ITP发病过程且与疾病严重程度相关,通过检测其表达水平有助于判断ITP病情并为进一步了解ITP的发病机制提供新思路,为其未来免疫靶向治疗提供新靶点。

关键词： 肿瘤细胞释放的自噬小体(TRAP)   调节性B细胞   IL-10   HMGB1   TLR2-MyD88-NF-κB信号通路  

摘要： 我们前期实验发现,肿瘤细胞释放的自噬小体(Tumor-released autophagosomes, TRAP)可被B细胞所摄取,诱导B细胞活化并促进B细胞分泌抗体和细胞因子,特别是分泌高水平的IL-10。而可分泌高水平的IL-10,是Bregs的重要特征。但是肿瘤细胞释放的自噬小体是否可诱导B细胞进一步分化为IL-10+B细胞或者Bregs,目前尚不清楚。目的：研究肿瘤细胞释放的自噬小体(TRAP)能否进一步诱导B细胞分化为IL-10+B细胞；探讨TRAP诱导产生的IL-10+B细胞是否有免疫抑制功能；探讨TRAP诱导IL-10+B细胞的物质基础及机制：研究肿瘤患者体内是否含有自噬小体以及是否可诱导几-10+B细胞的产生。方法：1.采用]TRAP体外刺激野生型小鼠脾细胞,同时用LPS刺激脾细胞作为对照,72h后收获细胞及细胞培养上清,流式细胞术检测IL-10+B细胞的比例变化；ELISA法检测细胞培养上清中IL-10的含量。磁珠分选小鼠B细胞,与不用浓度的TRAP 37℃共孵育72h；或与E.G7-OVA细胞来源的TRAP, E.G7-OVA细胞裂解液或LPS共孵育72h；或分别与肿瘤培养上清,等体积去除TRAP的肿瘤培养上清,以及等体积培养上清所获TRAP共孵育72h,收集培养上清,ELISA法测检测培养上清中IL-10的分泌水平。分选小鼠B细胞,在体外与TRAP共孵育72h,流式细胞术检测IL-10+B及IL-10-B细胞表面分子表达的差异(CD5、CD1d、CD21、CD23、CD43、CD86、MHC Ⅱ)。TRAP经尾静脉注射小鼠(同时用PBS注射组作为对照),第7天取脾脏细胞,通过计数并结合流式细胞术检测TRAP体内诱导产生IL-10+B细胞的比例及其表面CD5、CD1d的表达。2.分选出WT C57BL/6小鼠的CD4+T和CD8+T细胞并用CFSE标记,放入有抗CD3抗体预包被的孔板中并加入抗CD28抗体以刺激T细胞增殖。同时,在抗CD3抗体/CD28诱导的T细胞增殖体系中加入TRAP诱导的WTB细胞或IL-10-/-B细胞共培养或用Transwell小室隔开培养,流式细胞术检测T细胞增殖情况。分离OT-1小鼠脾细胞并用OVA257-264肽刺激其增殖,同时与E.G7-OVA(OVA+)或EL4(OVA)细胞来源的TRAP诱导的B细胞共孵育,96h后流式细胞术检测T细胞增殖情况。WT C57BL/6小鼠于第0天皮下接种E.G7-OVA肿瘤细胞,小鼠荷瘤成功后,于第4、7、10天DC/OVA疫苗皮下免疫荷瘤小鼠,并于第5、8天过继转移OVA+TRAP或OVA-TRAP诱导的B细胞、并以单独B细胞作为对照,定期测量实体瘤大小及观察荷瘤小鼠的存活情况；末次免疫后第七天,取各组小鼠的脾脏细胞并用OVA蛋白再刺激24h,流式细胞术检测脾脏细胞中IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞的比例；72小时后收获细胞培养上清,ELISA检测细胞培养上清中IFN-y的水平。3.分选WT、TLR2-/-、TLR4-/-和MyD88-、-小鼠B细胞,并用TRAP刺激不同时间(0h,1h),流式细胞术检测INF-κB通路中p65蛋白磷酸化情况；TRAP刺激上述B细胞72h后,收集细胞并检测IL-10+B细胞的比例。CFSE标记的WT C57BL/6小鼠CD4+T和CD8+T细胞分别与与TRAP诱导的WT、TLR2-/-、TLR4-/-和MyD88-/-小鼠B细胞共同放入有抗CD3抗体预包被的孔板培养,流式细胞术检测T细胞增殖情况。同时,在抗CD3抗体/CD28诱导的T细胞增殖体系中加入TRAP诱导的B细胞,共孵育72-96h后流式细胞术检测T细胞增殖情况。WT小鼠B细胞用不同浓度的NF-κB活化抑制剂预处理后,与TRAP共孵育72h,流式细胞术检测IL-10+B细胞的比例变化；ELISA法检测细胞培养上清中IL-10的含量。4.采用HMGB1抗体封闭TRAP中的HMGB1抗原表位,随后与磁珠分选的小鼠B细胞共孵育,流式细胞术检测B细胞IL-10的表达,探讨HMGB1对TRAP诱导B细胞分化为IL-10+B细胞的影响。建立稳定表达HMGB1-shRNA的细胞株,提取TRAP并与分选的B细胞共孵育。72h后收获细胞培养上清,ELISA法检测上清中IL-10的分泌量。分选的B细胞与未破碎的TRAP或等量超声破碎后的TRAP共孵育72h,ELISA法检测上清中IL-10的分泌量。5.收集14例肿瘤患者胸腹水,通过高速离心的方法获取提取物；并通过流式细胞术、Western blots、电镜等方法鉴定提取物是否含自噬小体以及其表面HMGB1的表达量。分离健康人外周血单个核细胞(PBMC),并与14例肿瘤患者胸腹水来源自噬小体共孵育

关键词： 夏氏疟原虫感染   调节性B细胞   表型特征   免疫应答  

摘要： 疟疾是由疟原虫通过媒介昆虫传播感染引起的严重威胁人类生命的感染性疾病，已成为全球最严重的三大公共卫生问题之一。目前尚未有应用于临床的有效疟疾疫苗。因此，抗疟疾疫苗的研制成为了当今的重点课题，而疟原虫感染宿主机体应答的免疫学、分子生物学等综合研究是其重要前提。　　疟疾与其他大多数感染性疾病一样，需要通过免疫效应机制对其控制和消除。在感染早期，以IFN-γ为主导的Th1型细胞免疫应答遏制原虫的爆发性增殖。随之，有Th2型细胞辅助B细胞产生特异性抗体，能够有效清除疟原虫，防止复发和再燃。适时适度的的Th1/Th2应答具有保护作用，而过度或不恰当的应答可能导致病理性损伤。　　调节性B(Bregs)是能够分泌Th2型细胞因子IL-10的B细胞，有研究发现伯氏疟原虫感染能够诱导小鼠脾脏产生Bregs，能够有效抑制病理性免疫应答导致的脑疟从而延长小鼠存活时间。但调节性B细胞在抗疟疾保护性免疫应答中的作用和地位并不清楚。研究显示，疟疾保护性免疫应答中Th1应答向Th2型应答的转换需要B细胞参与，在重症疟疾贫血患儿体内B细胞数量和表型存在异常。由此推测，疟原虫感染可诱导Bregs活化，在保护性和病理性应答的平衡中发挥重要而独特作用。　　目的：　　C57BL/6小鼠可以产生较强烈的Th1型应答，而BALB/c小鼠则偏向Th2型应答，因此我们建立了不同P.c chabadui AS感染鼠疟模型。本研究利用夏氏疟原虫感染的C57BL/6和BALB/c小鼠模型，通过检测Bregs在不同初次和再次感染中的应答模式、与Th1/Th2极化的关系，以及表型变化，揭示Bregs在疟疾免疫应答中的作用。　　方法：　　1、实验动物和疟原虫　　6～8周雌性C57BL/6与BALB/c小鼠，SPF级，由中国医学科学院实验动物研究所提供（许可证编号:SCXK京200420001）。致死型夏氏疟原虫(Plasmodium chabadudi chabadui AS，P.c chabadui AS)液氮冻存，由BALB/c小鼠周期复苏传代。　　2、实验动物感染　　疟疾感染:C57BL/6与BALB/c每只小鼠经腹腔感染1×106P.c chabadui AS寄生红细胞(pRBC)。***感染后第3天开始，尾静脉采血，制备薄血膜，Giemsa染色，动态监测疟原虫血症水平、生存率。　　3、流式细胞术　　FACS检测小鼠脾细胞中产生IL-10的CD11b、CD19及CD3的水平，并检测分泌IL-10的CD19细胞中CD1d、CD5、IgM、IgD、IgG、B220及CD138等的表达量。　　4、Realtime PCR检测细胞因子　　TRIzo1匀浆提取脾脏组织mRNA，反转录为eDNA后，保存于-20℃作为Realtime PCR的模板，将RPS17作为内参基因，检测IL-I0基因表达水平。　　5、统计学处理　　使用SPSS19.0统计软件对数据进行处理，标本采用独立样本t检验对数据做统计分析。P＜0.05代表差异具有统计学意义。　　结果：　　1、P.c chabadui AS感染小鼠原虫血症水平和生存率　　C57BL/6与BALB/c小鼠经腹腔感染1×106 P.c chabaudi AS寄生的红细胞(pRBC)后，于感染后第4天在外周血可见疟原虫感染的红细胞，随后红细胞感染率迅速上升。在感染后第8天红细胞感染率达到峰值(36％)。随后C57BL/6小鼠的感染率开始迅速下降，并在感染后第13天被基本清除，而BALB/c小鼠的感染率下降缓慢，在感染后第9天开始出现死亡，感染后第11左右基本全部死亡。　　2、P.c chabadui AS感染小鼠脾细胞IL-10的分泌水平及来源　　C57BL/6小鼠脾组织中IL-10 mRNA水平及分泌IL-10细胞的数量在感染后第8天达到峰值，BALB/c小鼠在感染后第5天达到峰值。分泌IL-10细胞的数量约占小鼠脾细胞总数的5％，并随小鼠的原虫血症的升高而升高。　　C57BL/6和BALB/c小鼠脾淋巴细胞中分泌IL-I0的细胞主要为CD3+T细胞和CD19+B细胞。C57BL/6小鼠在感染后第8天CD19+IL-10+B细胞数量达到峰值，占脾淋巴细胞总数的1.9％，在分泌IL-10细胞中的比重为40％。CD3+IL-10+T细胞数量的峰值出现在感染后第5天，占脾淋巴胞总数3％。BALB/c小鼠CD19+IL-10+B细胞和CD3+IL-10+细胞的峰值出现在感染后第5天，分别占脾淋巴细胞总数的3.4％和2.6％，其中CD19+B细胞占分泌IL-10细胞的50％，且在感染初期CD19+IL-10+B细胞数量多于CD3+IL-10+细胞数量。　　3、在P.c chabadui AS感染模型中B10细胞亚群的变化　　B10细胞表型为CD19+