关键词：
脂氧素A4
调节性B细胞
白介素10
调节性T细胞
摘要：
目的：脂氧素(LXA4)在炎症的调控中发挥着重要作用。LXA4同样具有抗肿瘤作用。我们实验室先前的研究发现,LXA4能通过重塑肿瘤微环境和抗肿瘤血管生成来抑制肝癌肿瘤细胞的生长,但是其免疫学机制仍不是十分清楚。调节性B细胞,是一种能分泌IL-10的B细胞,已被证明在炎症、自身免疫性疾病和肿瘤的调控中发挥重要作用。最新的研究表明人和小鼠的B细胞上都有LXA4受体的表达。本研究旨在通过研究LXA4对调节性B细胞的作用来阐明其抑制肿瘤生长的免疫学机制。
方法：(1)将不同的肿瘤细胞系通过皮下接种至小鼠,随机分为两组,其中一组腹腔注射LXA4类似物BML-111(1mg/kg)进行治疗,观察并记录肿瘤生长情况。此外,用CFSE标记小鼠肝癌H22细胞,培养24h后,检测LXA4对细胞生长的影响。(2)为寻找LXA4抑制肿瘤的机制,将肝癌H22细胞接种至SCID小鼠,并分为四组：对照组、LXA4治疗组、CD3+T细胞过继转移组、CD3+T细胞过继转移+LXA4治疗组,观察并记录肿瘤生长的情况。(3)为探讨LXA4对调节性B细胞的作用,体外条件下,分离小鼠脾脏B细胞,培养液中加入或不加LXA4,并在PMA、离子霉素、LPS和莫能菌素四种因子的刺激下,5h后通过流式细胞术检测LXA4对调节性B细胞生成的影响。体内条件下,将LXA4治疗的肿瘤小鼠的脾脏取出,比较治疗组和对照组调节性B细胞的数量。为探讨LXA4对B细胞其他功能的作用,通过CFSE标记、流式细胞术和HE染色的方法检测LXA4对B细胞增殖、浆细胞分化以及生发中心结构的影响。(4)将裸鼠皮下接种H22细胞,分为两组,其中一组每两天用LXA4治疗一次,观察并绘制肿瘤生长曲线,并通过流式细胞术和ELISA法检测小鼠脾脏调节性B细胞的数量及外周血、脾脏组织内炎症因子***-α和IL-1β的蛋白表达情况。(5)将纯化的CD4+T细胞标记CFSE,检测LXA4对其增殖的影响；将纯化的CD8+T细胞用PMA和离子霉素刺激,检测LXA4对其分泌IFN-γ能力的影响。(6)将H22细胞皮下接种至Balb/c小鼠,分为两组,其中一组每两天用LXA4治疗一次,第15天取脾脏、接种肿瘤侧引流淋巴结并分离肿瘤组织内浸润的淋巴细胞,通过流式细胞术检测调节性T细胞的数量和CD8+T细胞的杀伤能力。并通过免疫组织化学的方法检测肿瘤组织内浸润的T细胞的数量。(7)通过磁珠分选的方法将CD4+CD25-T细胞纯化出来后,在刺激性抗体CD3和CD28以及细胞因子TGF-β和IL-2的作用下,72h后检测LXA4对诱导生成的调节性T细胞数量的影响。另外,将纯化出来的CD4+T细胞与B细胞按照1：1的比例在CD3和LPS的作用下共培养,72h后检测LXA4能否通过B细胞影响诱导的调节性T细胞的生成。(8)为寻找LXA4影响调节性B细胞的分子机制,将LXA4治疗小鼠的脾脏细胞或纯化的B细胞提取蛋白质,并通过Western Blot的方法检测转录因子ERK和STAT3的磷酸化水平。此外,体外诱导调节性B细胞并加入ERK或STAT3的磷酸化抑制剂,5h后检测调节性B细胞生成的情况。
结果：(1)LXA4类似物BML-111对多种不同的肿瘤细胞系都有抑制其在体内生长的作用。此外,LXA4对肿瘤的生长没有直接的影响。(2)与对照组相比,LXA4能够促进SCID小鼠的肿瘤生长；将CD3+T细胞过继回输至SCID小鼠体内后,增强了抗肿瘤的效应,但是LXA4同样也不影响肿瘤的生长。(3)LXA4在体外和体内都能明显抑制调节性B细胞的生成,但是LXA4不影响B细胞的增殖、生发中心的结构以及浆细胞的分化。(4)在裸鼠中,LXA4能明显抑制调节性B细胞的生成,同时降低了炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β的蛋白表达,但是肿瘤在裸鼠中的生长并没有受到影响。(5)LXA4不影响CD4+T细胞的增殖以及CD8+T细胞分泌IFN-γ的能力。(6)LXA4抑制了引流淋巴结和肿瘤组织内的调节性T细胞的数量,并增强了CD8+T细胞的杀伤能力,但是对脾脏中的这两种细胞没有影响；免疫组化的结果显示LXA4增强了CD3+T细胞浸润肿瘤的能力。(7)LXA4不能通过直接作用影响调节性T细胞的生成,但是可以通过B细胞来抑制这种细胞的数量。(8)LXA4能有效地抑制B细胞而不是脾脏细胞中转录因子ERK和STAT3的磷酸化水平。加入ERK或STAT3的磷酸化抑制剂后能有效地抑制调节性B细胞的生成,说明这两种转录因子的磷酸化与调节性B细胞的生成密切相关。
结论：LXA4能有效地抑制多种肿瘤细胞的生长；LXA4对肿瘤细胞没有直接作用,而是通过对调节性B细胞的抑制从而增强了抗肿瘤效应；LXA4通过抑制调节性B细胞的生成从而减少了引流淋巴结和肿瘤组织
欢迎来到三峡大学图书馆！
