关键词： 心肌炎   柯萨奇病毒感染   B10细胞   调节性B细胞  

摘要： 目的：观察柯萨奇病毒B3 (Coxsackie virus B3, CVB3)诱导的小鼠急性病毒性心肌炎(Acute viral myocarditis, AVMC)发病过程中不同时点脾脏B10细胞亚群比例的变化,初步探讨B10细胞是否参与AVMC的炎症过程。方法：利用CVB3感染无特定病原级(Specific pathogen free, SPF)雄性Balb/c小鼠建立AVMC模型。AVMC组(n=20)小鼠腹腔注射CVB3病毒液,对照组(n=10)小鼠腹腔注射等量磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline, PBS);依据注射CVB3或PBS后的时间,AVMC组和对照组小鼠均随机分为1周和2周两个时点亚组。各亚组在到达相应观察时点后处死存活小鼠,无菌留取心脏及脾脏组织标本。取心脏组织作石蜡切片,行苏木素伊红(Hematoxylin-Eosin, HE)染色,观察心肌组织病理改变并计算心肌病理积分；实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real time-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)检测心肌组织中CVB3 mRNA的表达水平；流式细胞术检测小鼠脾脏CD19+IL-10+细胞(即B10细胞)亚群和CD19+CDldhiCD5+细胞亚群占CD19+细胞的比例。结果：AVMC组各亚组小鼠心肌炎症水平明显高于对照组相应亚组,AVMC组中1周亚组小鼠心肌组织病理积分低于2周亚组,差异均有统计学意义(P均<0.05)；与对照组相比,AVMC组各亚组小鼠心肌组织CVB3mRNA表达水平均明显升高,且AVMC组中1周亚组小鼠心肌CVB3 mRNA表达水平高于2周亚组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。AVMC组小鼠脾脏B10细胞亚群比例和CD19+CDldhiCD5+细胞亚群比例均高于对照组,且AVMC组1周亚组小鼠脾脏B10细胞亚群比例和CD19+CDldhiCD5+细胞亚群比例均高于2周亚组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。AVMC小鼠发病过程中,脾脏B10细胞亚群比例与CD19+CDldhiCD5+细胞亚群比例及心肌组织中CVB3mRNA表达三者相平行,而与心肌组织炎症水平相反。结论：B10细胞在急性病毒性心肌炎小鼠脾脏中所占比例增高,其参与了急性病毒性心肌炎的炎症过程。

关键词： IL-28B   腺病毒   宫颈癌   U14细胞   Tregs  

摘要： 目的：构建小鼠(Babl/C和c57bl/6j )U14宫颈癌皮下移植瘤模型,研究腺病毒介导的IL-28B (Ad-mIL-28B)对U14宫颈癌皮下移植瘤小鼠脾脏中调节性T细胞(Tregs)的影响及其抗肿瘤的作用。方法：体外培养人胚肾293(HEK293)细胞；使用HEK293细胞扩增腺病毒(Ad-mIL-28B和Ad-EGFP)；采用微量全细胞病变法(CPE)进行病毒(Ad-mIL-28B 和 Ad-EGFP)滴度的测定；体外培养小鼠U14宫颈癌细胞,建立Babl/C 和 c57bl/6j小鼠U14宫颈癌腹水模型和皮下移植瘤模型；观察并测定Ad-mIL-28B处理后小鼠(Babl/C口c57bl/6j) U14宫颈癌皮下移植瘤瘤体的生长、瘤重,并计算抑瘤率、脾脏、肺脏和肝脏指数；流式细胞术检测Ad-mIL-28B处理后,U14宫颈癌皮下移植瘤小鼠(Babl/C口c57b1/6j)脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Tregs的变化；HE染色法检测小鼠(Babl/C 和 c57bl/6j) U14宫颈癌皮下移植瘤瘤体、肺脏及肝脏组织的病理变化。结果：1.采用CPE法测定病毒滴度后,病毒(Ad-mIL-28B 和 Ad-EGFP)滴度均为：108PFU/100μL。2成功建立了小鼠(Babl/C 和 c57b1/6j) U14宫颈癌腹水模型和皮下移植瘤模型。***-mIL-28B组、Ad-EGFP组及PBS组小鼠脾脏中的CD4+CD25+Foxp3+Tregs在淋巴细胞中所占的比例分别为4.76%±0.97%、5.38%±1.55%和6.92%±1.18%,与PBS组相比,Ad-mIL-28B组脾脏中的CD4+CD25+Foxp3+Tregs在淋巴细胞中所占的比例减少(p=0.034).4. Ad-mIL-28B组、Ad-EGFP组和PBS组Babl/C小鼠移植瘤的体积分别为107.6mm3±30.8mm3、 181.8mm3±14.2mm3 和 240.2mm3±21.3mm3,与PBS组相比,Ad-mIL-28B组能够明显的减小移植瘤的体积(p=0.008)。***-mIL-28B组、Ad-EGFP组和PBS组c57bl/6j小鼠移植瘤的体积分别为9.9mm3±2.7mm3、44.4mm3±7.6mm3和48.2mm3±8.1mm3,与 PBS组相比,Ad-mIL-28B组能够明显的减小移植瘤的体积(p=0.001)。***-mIL-28B组、Ad-EGFP组及PBS组小鼠移植瘤瘤重分别为78.4g±23.3g、200.1g±90.3g口303.2g±123.2g,与PBS组相比,Ad-mIL-28B组小鼠移植瘤瘤重明显减轻(p=0.049)。***-mIL-28B组、Ad-EGFP组和PBS组Babl/C小鼠的抑瘤率分别为：66.45%±8.88%、24.76%±6.68%和0%,与PBS组相比,Ad-mIL-28B能明显的抑制移植瘤的生长(p=0.000)。***-mIL-28B组脾脏和肺脏指数的变化与对照组相比,有统计学意义(p<0.05),而肝脏指数的变化无明显的统计学意义。***染色结果表明,Ad-mIL-28B组肿瘤组织中的异型性的肿瘤细胞的数量与对照组相比明显减少,肺脏和肝脏组织未见明显的瘤细胞转移。结论： Ad-mIL-28B能够降低U14宫颈癌皮下移植瘤小鼠(Babl/C和c57b1/6j)脾脏中的CD4+CD25+Foxp3+Tregs,并且能抑制小鼠(Babl/C和c57bl/6j)U14宫颈癌皮下移植瘤的生长,Ad-mIL-28B可能是通过降低CD4+CD25+Foxp3+Tregs的表达从而抑制小鼠(Babl/C和c57bl/6j)U14宫颈癌皮下移植瘤的生长。

关键词： 关节炎   类风湿   调节性B细胞   CD19+CD24hiCD38hi   CD19+CD24hiCD27+  

摘要： 目的:检测类风湿关节炎(RA)患者外周血CD19+CD24hiCD38hi、CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞(Bregs)占CD19+B细胞的百分率,探讨外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs频率与RA临床指标的相关性,明确治疗前后CD19+CD24hiCD38hiBregs的变化情况。方法:以CD19+CD24hiCD38hi作为Bregs标记,流式细胞仪三色荧光抗体标记法检测95例RA患者和40例健康对照者(HC)外周血CD24hiCD38hi细胞占CD19+B淋巴细胞的百分率,观察不同严重程度患者的CD19+CD24hiCD38hiBregs比例变化趋势,并研究其与RA患者疾病活动度指标(DAS28评分)、血沉(ESR)、超敏C反应蛋白(hc CRP)、类风湿因子(RF)、晨僵时间、视觉模拟评分(VAS评分)、关节肿胀数、关节压痛数以及其他相关性指标如年龄、病程、关节功能分级、日常生活能力(HAQ)评分等之间的相关性。随访其中25例RA患者,对比治疗6个月后较基线时外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs的变化情况。另选57例RA患者和21例健康对照者,以CD19+CD24hiCD27+作为Bregs标记,通过流式细胞仪三色荧光抗体标记法检测外周血CD24hiCD27+细胞占CD19+B淋巴细胞的比例,结合临床资料进行相关性分析。结果:RA组CD24hiCD38hi细胞占CD19+B淋巴细胞的比例(6.48±4.98)%低于HC组(7.23±3.40)%,但两组间差异未达到统计学意义(p>0.05)。其中DAS28<3.2组(n=19)、3.2≤DAS28≤5.1组(n=45)、DAS28>5.1组(n=31)CD24hiCD38hi细胞占CD19+B细胞的比例分别为(6.09±4.35)%、(6.15±5.28)%、(7.16±4.94)%,CD19+CD24hiCD38hiBregs的平均数量随疾病活动度的增高而增加。相关性分析发现RA患者CD19+CD24hiCD38hiBregs比例与晨僵时间呈正相关(r=0.227,p=0.027),与年龄、抗CCP抗体滴度水平均呈负相关(r=-0.234,p=0.022;r=-0.218,p=0.036)。外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs的变化与治疗情况明显相关。病情无改善者(持续中重度活动,n=12)Bregs细胞数量增加,病情缓解者(由中重度活动到轻度活动或完全临床缓解,n=8)Bregs细胞数量下降,病情稳定者(持续处于轻度活动或病情完全缓解,n=5)Bregs细胞数量下降。RA组CD24hiCD27+细胞占CD19+B淋巴细胞的比例(12.36±7.08)%高于HC组(7.67±3.54)%,两组差异无统计学意义(p>0.05)。RA组中DAS28<3.2组(n=25)和DAS28≥3.2组(n=32)间外周血CD24hiCD27+B细胞占CD19+B淋巴细胞的百分比分别为(9.07±6.27)%和(7.67±3.54)%,两组间差异无统计学意义(p>0.05)。相关性分析发现RA患者CD19+CD24hiCD27+Bregs比例与年龄、病程、ESR、hs CRP、RF、抗CCP抗体、DAS28评分等均无相关性。结论:RA组外周血CD24hiCD38hiB细胞、CD24hiCD27+B细胞占CD19+B淋巴细胞的百分率与对照组间比例的差异情况未达到统计学差异,在RA患者中CD19+CD24hiCD38hiBregs随着病情活动性升高其数量反应性增加,随着治疗好转其数量随之降低,提示CD19+CD24hiCD38hiBregs在RA的发病及炎症活动中可能起一定作用。

关键词： 妊娠   调节性B细胞   白介素10   免疫调控  

摘要： 背景调节性B细胞是近年来发现的一种新的B细胞亚群,主要通过产生白介素(interleukin,IL)-10和转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)负性调控炎症免疫相关疾病的病理过程。妊娠免疫耐受的建立是一个极其复杂而又协调的过程。国内外学者对妊娠免疫耐受的机理做了深入的探索,绝大多数认为机体主要通过调节着床局部免疫功能,诱导产生免疫耐受,接受胎儿的植人并维持妊娠。本实验在前期发现妊娠期外周血血浆IL-10增高的基础上,进一步通过采用酶联免疫法(ELISA)、实时荧光定量PCR和流式细胞术等技术检测产生IL-10的调节性B细胞在不同妊娠周期的变化。探索妊娠耐受建立的分子机制,为流产、胎儿宫内发育迟缓、妊娠高血压综合症等诸多妊娠疾病发病机理的研究和筛选有效的治疗药物提供理论依据。同时也可为减轻同种异体器官的移植排斥反应并诱导免疫耐受开辟一条新路。目的检测产生IL-10的调节性B细胞在不同妊娠周期和健康未孕者体内的变化,探讨该B细胞亚群可能在妊娠免疫耐受的调控作用。方法1.研究对象：按照全国统编人卫版教材《妇产科学》第8版标准,选择驻马店市中心医院妇产科不同妊娠期妇女作为研究对象,根据妊娠周期不同分为妊娠早、中、晚三组。采用同时期体检科健康未孕妇女作为对照。2.样本收集和处理：收集不同妊娠期妇女和健康未孕妇女空腹血样10ml,以肝素锂抗凝,分离血浆冻存,并采用Ficol分离法分离外周血单个核细胞,备用。3.血浆IL-10水平的检测：采用人IL-10 ELISA检测试剂盒,检测血浆IL-10含量。4. IL-10 mRNA的检测：提取不同妊娠期妇女和健康未孕妇女外周血单个核细胞总RNA,经逆转录后,采用实时荧光定量PCR检测IL-10mRNA的表达情况。5.调节性B细胞及其亚群检测：分离同妊娠期妇女和健康未孕妇女外周血单个核细胞,采用多色荧光抗体结合流式细胞术检测并分析样本中产生IL-10的调节性B细胞及其亚群的分布情况,并结合其他检测指标分析其意义。6.统计学方法：计量数据以均数加减标准差(x±s)表示,两组间差异比较采用t检验,各组数据阳性率比较采用卡方检验。检验水准a=0.05,P<0.05为差异有统计学意。结果1.标本分组情况：妊娠早期妇女(<13周)20例,妊娠中期妇女(14周-27周末)20例,妊娠晚期妇女(>28周)20例,健康未孕妇女20例,共计80例样本。2.酶联免疫法ELISA检测结果：妊娠期妇女血浆IL-10含量明显高于未受孕女,妊娠早、中期IL-10含量分别为(326.85±33.91) pg/ml和(213.76±66.10) pg/ml,明显高于未受孕妇女(99.10±23.22) pg/ml,经t检验显示有显著统计学差异。3.荧光定量PCR检测结果：妊娠早期IL-10相对表达最高达(3712.00±123.00)倍数,随着妊娠周期的延长,IL-10mRNA的表达下降。4.流式细胞术结果：妊娠早、中期CD19+IL-10+B细胞百分比分别为(14.30±2.12)%和(7.53±1.11)%,明显高于非妊娠妇女百分比,经过卡方检验结果有统计学差异,且发现该群细胞高表达CD24和CD38,而非CDld和CD5。结论***-10mRNA及其蛋白在妊娠期均高表达,特别是在妊娠早、中期,说明妊娠期机体高表达IL-10从而负性调节妊娠期免疫、参与妊娠免疫耐受的建立。2. CD19+CD24+CD38+IL-10+B细胞可能参与妊娠期免疫耐受的调控。

关键词： 类风湿关节炎   调节性T细胞   调节性B细胞   临床观察  

摘要： 本文主要从以下几个部分进行论述：　　第一部分 类风湿关节炎患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Tregs的变化　　目的：　　调节性T细胞（RegulatoryT cell，Tregs）参与免疫性疾病的发病机制目前尚不十分清楚，但其在自身免疫耐受和维持内环境稳态中起着重要作用，当失去平衡时会影响疾病的发生、活动性。Tregs在类风湿关节炎(RheumatoidArthritis，RA)发病、病情进展方面作用如何，临床研究报告不多。本研究通过应用流式细胞仪技术检测RA患者外周血CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占CD4+T淋巴细胞百分比变化，并与正常对照组、患者病情活动情况进行比较分析，探讨Tregs与RA发生、发展的关系。　　方法：　　选择RA患者69例，健康对照者(Health control，HC)26例。患者排除其他自身免疫性疾病、肿瘤、感染及相关药物应用史。采集并提取外周血单个核细胞，应用流式细胞仪技术进行相关检测。分析CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占外周血CD4+T淋巴细胞比例和CD4+CD25+FoxP3+ Tregs与疾病活动度（依据DAS28评分）及临床疾病活动相关指标的关系;同时，将RA患者根据病程分为3组，即病程不超过1年组，病程1-5年组，病程超过5年组，结合DAS28评分，将其分为DAS28＞3.2、DAS28＞5.1组进行分析。　　结果：　　1、RA患者组CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占外周血CD4+T淋巴细胞比例总体分析较HC组明显增多;但在病程不超过1年，DAS28＞3.2组，其CD4+CD25+FoxP3+ Tregs比例呈现减少改变，但与正常对照组无统计学差异;2、CD4+CD25+FoxP3+ Tregs比例变化与RA患者红细胞沉降率(Erythrocytesedimentation rate，ESR)和C反应蛋白(C reactive protein，CRP)呈正相关，但与类风湿因子(Rheumatoid factor，RF)和抗CCP抗体间无明显相关性;3、CD4+CD25+FoxP3+ Tregs比例变化与RA患者疾病活动度呈正相关;4、在病程不超过1年组和病程1-5年组，CD4+CD25+FoxP3+ Tregs比例变化在DAS28＞5.1组和DAS28＞3.2组间具有显著差异，且病程越短差异性越显著;但在病程超过5年组无明显差异。　　结论：　　CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占外周血CD4+T淋巴细胞比例在RA组总体表现增多，并且与ESR、CRP、DAS28呈正相关性，说明CD4+CD25+FoxP3+ Tregs的变化与RA疾病活动相关。通过对不同病程、疾病活动程度不同（即通过DAS28进行判断）的患者进行该项分析研究表明，病程越短，CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占外周血CD4+T淋巴细胞比例变化越大，对疾病的影响越大。而CD4+CD25+FoxP3+ Tregs比例的增加除了有机体反应性增高因素外，其可能通过多种途径参与RA发生、发展、加重过程。因此，在临床诊治过程中，早期选择能够有效调节或影响CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占CD4+T淋巴细胞比例及功能的药物，对控制RA病情变化及进展具有重要意义。　　第二部分 三种临床常用治疗药物在体外培养中对CD4+CD25+FoxP3+Tregs变化的影响　　目的：　　Tregs通过抑制多种免疫细胞的增殖和功能参与维持免疫稳态。近年，也有文献报告其参与机体炎症反应过程。调整Tregs在外周血中占CD4+T淋巴细胞比例可能成为临床上免疫相关疾病治疗的一种新策略。在RA相关研究中，关于临床药物在RA患者中针对CD4+CD25+FoxP3+ Tregs调控作用的比较分析报告尚少。本研究选取甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)、糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)、抗TNF-α靶向药等目前RA治疗中常用药物，利用细胞培养技术，通过流式细胞仪分析给药前及细胞培养结束时CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占CD4+T淋巴细胞百分变化，探讨其在RA临床治疗中对CD4+CD25+FoxP3+ Tregs的作用及影响。　　方法：　　选择RA患者90例，随机分为5组，分别设为无药组、MTX组、GC组、抗TNF-α靶向药组、联合应用3种药物组，选择健康对照者10例，同时选择临床应用MTX患者10例。患者排除其他自身免疫性疾病、肿瘤、感染及相关药物应用史。无菌条件下采集并提取外周血单个核细胞，利用细胞培养技术，通过流式细胞仪在给药前及细胞培养结束时进行相关检测。分析不同治疗药物和方法对CD4+CD25+FoxP3+ Tregs变化的作用及影响，探讨在临床治疗中可能的意

关键词： 慢性HBV感染   调节性B细胞   细胞因子   IL-10   IP-10  

摘要： 目的:观察不同免疫状态下慢性HBV(hepatitis B virus,乙型肝炎病毒)感染者外周血调节性B细胞(regulatory B cells,Breg细胞)比例及血清中细胞因子IL-10、IP-10水平的变化特点。方法:采集63例处于不同免疫状态的慢性HBV感染者(免疫耐受期15例,免疫活化期23例,非活动性HBV携带期25例)及16例健康个体的外周血,采用流式细胞术检测其外周血Breg细胞(CD24hi CD38hi B细胞)占外周血B细胞总数的比例。同时对患者的血清标本使用luminex技术检测IL-10、IP-10细胞因子水平。结果:免疫活化组外周血Breg细胞比例高于免疫耐受组和健康对照组(7.11(5.82,8.18)%vs 4.40(3.48,5.50)%,P=0.010;7.11(5.82,8.18)%vs 5.32(3.11,6.05)%,P<0.001),免疫耐受组成熟B细胞(CD24int CD38int B细胞)比例低于健康对照组(47.19(35.33,52.91)%vs 57.00(48.23,61.14)%,P=0.02)。免疫活化组血清IL-10、IP-10水平高于免疫耐受组、非活动HBV携带组及健康对照组(18.14(5.85,25.16)pg/ml vs 0.01(0.00,0.46)pg/ml,18.14(5.85,25.16)pg/ml vs0.00(0.00,0.10)pg/ml,18.14(5.85,25.16)pg/ml vs 0(0.00,0.00)pg/ml,P均<0.001;1720.0(1040.0,4042.0)pg/ml vs 661.4(508.0,940.6)pg/ml,1720.0(1040.0,4042.0)pg/ml vs 554.7(390.1,740.7)pg/ml,1720.0(1040.0,4042.0)pg/ml vs 653.2(398.6,715.8)pg/ml,P均<0.001)。慢性HBV感染者Breg细胞比例与血清IL-10水平、ALT水平存在正相关关系(r=0.282,P=0.025;r=0.305,P=0.026)。免疫活化期的慢性HBV感染者血清IL-10水平与ALT水平正相关(r=0.715,P<0.001),血清IP-10水平与ALT水平正相关(r=0.653,P<0.001)。结论:慢性HBV感染者在不同的免疫状态时期外周血Breg细胞比例及血清中细胞因子水平表现不同。免疫活化期的慢性HBV感染者Breg细胞比例升高,且其外周血IL-10、IP-10也显著升高。慢性HBV感染者外周血Breg细胞比例与血清IL-10、ALT水平正相关,免疫活化期感染者血清IL-10、IP-10水平与ALT水平正相关。

关键词： 动脉粥样硬化   调节性T细胞   Th17细胞   HMGB-1蛋白   炎症反应   致病机理  

摘要： 目的：将动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)患者和健康人作为研究对象，检测两种健康状况的外周血中促炎性细胞因子和抑炎性细胞因子含量的变化，以及研究对象中调节性T细胞和Th17细胞含量的变化，研究在动脉粥样硬化发生发展过程中高迁移率族蛋白-1（high mobility group box1 protein,HMGB-1）和Th17/Treg的平衡与AS形成的相互关系，探讨AS的致病因素，寻找可能存在的治疗靶点，并为防治动脉粥样硬化以及动脉粥样硬化所致的并发症提供实验基础和理论依据。　　方法：实验设立对照组和AS组，检测健康人和动脉粥样硬化患者外周血中高迁移率族蛋白-1(HMGB-1)和调节性T细胞（T regulatory cell,Treg）以及Th17细胞之间的含量变化，(1)采用 Ficoll密度梯度离心法分别将动脉粥样硬化患者和健康人外周血分离得到人外周血单个核细胞（PBMCs）。(2)将分离出的单个核细胞采用磁珠分选法分选出调节性T细胞（Tregs）。(3)用流式细胞术检测磁珠分选所得CD4+T细胞和调节性 T细胞的纯度。(4)将不同浓度的 HMGB-1和 Treg细胞共培养，研究HMGB-1对Treg细胞的体外诱导分化，检测封闭TLR4受体和不封闭TLR4受体时培养上清液中细胞因子TGF-β1、IL-10含量的变化。(5)用酶联免疫吸附试验法分别检测动脉粥样硬化患者和健康人血清中的细胞因子TGF-β1、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-23和HMGB-1的含量。（6）用SPSS18.0软件进行统计学分析。所得数据以x±s表示，两组之间的均数比较用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。　　结果：　　(1)AS患者外周血中的HMGB-1的含量比健康人外周血中的含量明显增高。　　(2)AS组外周血中的TGF-β1和IL-10含量比对照组明显降低。　　(3)AS组外周血中IL-6、IL-17A、IL-23的含量较对照组明显增高。　　(4)随着HMGB-1的浓度逐渐增加，封闭TLR4受体的CD4+T细胞分泌IL-10的功能增强，随着HMGB-1刺激的浓度逐渐增加，未封闭TLR4受体的CD4+T细胞分泌IL-10的功能反而减弱。　　(5)随着HMGB-1的浓度逐渐增加，封闭TLR4受体的CD4+T细胞分泌抑炎性细胞因子TGF-β1的功能增强，而未封闭TLR4受体的CD4+T细胞分泌TGF-β1的功能减弱。　　结论：动脉粥样硬化患者外周血中促炎性细胞因子和抑炎性细胞因子与健康人的水平存在较大的差异，本研究通过体外不同浓度的HMGB-1与CD4+T细胞共培养时，未封闭和封闭TLR4受体的CD4+T细胞分泌TGF-β1、IL-10的功能是不同的，随着的HMGB1刺激浓度增加，未封闭TLR4受体的CD4+T细胞的分泌功能减弱，而封闭TLR4受体的CD4+T细胞分泌功能增强。AS患者外周血中HMGB-1、TGF-β1、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-23的含量与健康人之间差异较大，促炎性细胞因子水平明显升高，抑炎性细胞因子 IL-10、TGF-β1水平降低，使炎症反应增强，促进了动脉粥样硬化的发展。

关键词： 细粒棘球蚴感染   Breg   IL-10   TGF-β1  

摘要： 目的:研究调节性B细胞及相关分子表达水平在细粒棘球蚴持续性感染小鼠过程中的表型改变、变化特点的相关性,探讨其在细粒棘球蚴感染中的免疫作用及与细粒棘球蚴感染发生发展的关系。方法:将96只雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,实验组通过腹腔门静脉接种原头蚴悬液制备细粒棘球蚴感染小鼠模型,对照组腹腔注射等量生理盐水。分别在接种2天、8天、30天、90天、180天和270天收集标本。通过流式细胞术检测小鼠脾脏中调节性B细胞CD1dhiCD5+CD19hi细胞和CD1dhiCD5+CD19hiIL-10+细胞比例;通过ELISA法检测小鼠血清IL-10和TGF-β1的水平;HE染色观察小鼠肝脏的病理学改变;用免疫组织化学法检测IL-10和TGF-β1在肝脏的表达及分布;通过实时荧光定量RT-PCR检测小鼠脾脏淋巴细胞IL-10和TGF-β1 mRNA的表达水平。结果:1)流式细胞术检测结果显示与对照组相比,小鼠脾脏CD1dhiCD5+CD19hi细胞和CD1dhiCD5+CD19hiIL-10+细胞比例在感染后90天、180天和270天显著性升高（P<0.05）。2)实时荧光定量RT-PCR结果显示与对照组相比,在感染早期IL-10和TGF-β1 mRNA均低水平表达,感染后90天IL-10 mRNA的表达显著增加（P<0.05）,TGF-β1 mRNA在感染后30天表达显著升高（P<0.05）,随后均保持较高的水平（P<0.05）。3)HE染色观察结果显示,肝细胞中出现水肿,出现胆管增生,肝脏结构破坏,分不清小叶结构,肝细胞空泡样变性,感染晚期可见淋巴细胞浸润。4)免疫组织化学法结果显示肝脏在细粒棘球蚴感染过程中,IL-10和TGF-β1在肝脏的主要表达部位由早期的肝窦区少量肝细胞胞浆转移至纤维囊壁和病灶处的生发层周围。感染早期,IL-10和TGF-β1均不表达或低水平表达;感染中晚期,随着小鼠体内及肝脏细粒棘球蚴的不断增大增多,IL-10和TGF-β1的表达均显著升高（P<0.05）。5)ELISA检测结果显示与对照组相比,感染早期小鼠血清IL-10和TGF-β1水平显无明显改变;感染中、晚期小鼠血清IL-10和TGF-β1水平均显著升高（P<0.05）。结论:CD1dhiCD5+CD19hi调节性B细胞可能是导致细粒棘球蚴感染免疫抑制的原因之一。在细粒棘球蚴感染的早期,小鼠脾脏CD1dhiCD5+CD19hi调节性B细胞和CD1dhiCD5+CD19hiIL-10+调节性B细胞增加不明显,感染晚期,两种细胞均显著增高,提示调节性B细胞参与了细粒棘球蚴感染的发生发展。细粒棘球蚴感染中,IL-10和TGF-β1表达随体内细粒棘球蚴组织的不断增多增大持续升高,推测Breg发挥抑制作用可能通过调节细胞因子的表达并诱导分泌抑制性细胞因子IL-10和TGF-β1发挥抑制作用。

关键词： 调节性B细胞   SLE   CD40   SLEDAI  

摘要： 研究背景：系统性红斑狼疮(SLE,Systemic Lupus Erythematosus)是一种全身多系统受累的自身免疫性结缔组织疾病,好发于育龄期女性,表现为多个靶器官受损,其中肾脏的损害最常见,甚至发展成为终末期肾脏病,患者需依靠肾脏替代治疗维持生命,因此狼疮肾炎的发生机制一直受到人们的关注。目前已有研究认识到B细胞亚群功能的改变及失衡与SLE的发病密切相关。调节性B细胞与多种自身免疫性疾病相关,它不仅和自身抗体的分泌相关还可以通过分泌IL-10和TGF-(3等细胞因子发挥免疫调控作用,尤其在介导调节性T细胞的免疫调控中具有重要作用,但调节性B细胞在自身免疫性疾病中如何发挥其调控机制,目前尚存争议,本课题将对调节性B细胞在SLE患者中的分布变化及其重要的信号通路的调控进行研究。方法：第一部分：入组的36例系统性红斑狼疮患者均为2012.08-2013.08就诊的初发或复发(停用激素等免疫抑制剂6月以上)的SLE患者(SLEDAI评分大于5分),其中30名患者存在肾脏病变(占83.3%),采集血标本一部分用于常规生化检测,部分用于留存血清,剩下的部分用于流式细胞计数检测比较各项生化指标,病理学指标异常；比较SLEDAI评分及BILAG评分是否统一；比较两种评分系统与24小时尿蛋白定量的相关性。第二部分：使用流式细胞计数方法检测患者及健康对照者外周血中1)CD19+CD24hiCD38hi和CD19+CD24hiCD38low细胞亚群的分布；2)CD40?CD40L在T、B细胞上的分布；3)采用ELISA法检测患者及健康对照者sCD40L在血清中的浓度。第三部分：分离正常人外周血淋巴细胞,在体外培养72小时,分别于IL-21、CD40L、狼疮患者血清、抗CD40L、IL-21RFcy共培养,采用流式细胞的方法检测不同分组细胞中CD19+CD24hiCD38hi细胞亚群的变化结果：第一部分：(1)入组患者的SLEDAI评分和BILAG评分较为统一；(2)BILAG-2004评分与24小时尿蛋白定量的相关性较好；优于SLEDAI-2000评分。第二部分：(1)调节性B细胞-CD19+CD24hiCD38hi细胞亚群在SLE组中的比例较健康对照组上调(P<0.05)；(2)CD19+CD24hiCD38low细胞亚群在SLE组中的比例较健康对照组下降；(3)CD38表达和sCD40L血清浓度呈正相关(P<0.05)。第三部分：(1)健康者调节性B细胞与SLE患者血清、IL-21共培养后出现增殖(P<0.05)；(2)CD40L单抗可以阻断SLE患者血清诱导的健康者调节性B细胞的增殖(P<0.05)结论：(1)对SLE患者的疾病活动度进行评估需要可靠灵敏的评估系统,通过对入组的SLE患者采用SLEDAI评分及BILAG评分发现,这两种评分系统较为统一,在临床结合运用可以较好评估病情；另外我们发现：BILAG-2004评分与24小时尿蛋白定量的相关性较好,优于SLEDAI-2000评分。(2)在活动性SLE患者的血清中,调节性B细胞的比例显著高于健康对照者,并且sCD40L呈正相关,CD40L单抗能够逆转调节性B细胞在SLE中的增殖,说明调节性B细胞与SLE之间存在密切联系,而此种联系可能被IL-21/IL-21R和CD40/CD40L信号通路所调控。

关键词： 湿疹血小板减少伴免疫缺陷综合征   自身免疫   调节性B细胞   重症联合免疫缺陷病   不典型   临床特点   免疫表型  

摘要： 第一部分WAS蛋白缺陷对调节性B细胞的影响目的：探究WAS蛋白(Wiskott-Aldrich syndrome protein, WASp)缺陷对调节性B细胞(B10)的影响,以及调节性B细胞在Wiskott-Aldrich综合征并发自身免疫中的潜在作用。方法：利用流式细胞术,检测WASp KO小鼠外周不同组织B10细胞的比例变化,同时检测WAS患儿外周血中B10细胞及B10+B10pro细胞的比例变化。利用年老WASp KO小鼠发生自身免疫性结肠炎这一宝贵的非诱导性自身免疫模型,检测B10细胞和调节性T细胞及Thl细胞比例变化,探讨B10细胞与Treg/Th1平衡的关系。结果：WAS患儿外周血B10细胞比例为0.75±0.29(n=9),显著低于对照组2.01±0.60 (n=14) (P=0.0002); B10+B10pro细胞比例为1.09±0.58(n=6),显著低于对照组2.65±0.58(n=9)(P=0.0004)。WASp KO小鼠的外周血、腹腔、脾脏、淋巴结中B10细胞比例分别为1.20±0.65(n=7)、10.72±5.05(n=6)、0.71±0.17(n=7)、0.74±0.16(n=6),对比WT小鼠相应比例2.06±0.43(n=7)、22.51±6.69(n=7)、1.52±0.80(n=7)、1.89±0.47(n=5),均显著下降(P<0.05)。年老WASp KO小鼠的外周血、腹腔、脾脏、淋巴结中B10细胞比例分别为1.35±0.64(n=6)、8.30±3.90(n=6)、0.90±0.16(n=6)、0.57±0.25(n=3),对比年老WT小鼠相应比例1.82±0.69(n=8)、15.81±6.87(n=9)、1.49±0.35(n=7)、1.41±0.40(n=7),除外周血无差别外(P=-0.2284),均有显著下降(P<0.05)。年老WASp KO小鼠腹腔和肠系膜淋巴结中Treg细胞比例分别为1.07±0.65(n=9)、3.17±0.62(n=6),Thl细胞比例分别为33.17±14.35(n=6)、9.57±1.54(n=6),对比年老WT小鼠相应比例1.83±0.51(n=7)、5.42±0.85(n=7)、14.38±6.42(n=7)、8.47±1.00(n=6),除肠系膜淋巴结中Thl细胞比例无差别外(P=0.2403),均有显著上升(P<0.05)。结论：WASp缺陷可能导致B10细胞稳态失衡和(或)功能障碍,缺陷的B10细胞可能是WAS自身免疫性并发症发生的主要参与者。第二部分不典型重症联合免疫缺陷病临床研究目的：向临床医师,尤其是儿童免疫专科医师引入不典型重症联合免疫缺陷病的概念；汇集目前报道过的所有不典型重症联合免疫缺陷病的临床病例报道文献,总结其临床特点,尤其是免疫学检查特点,为临床不典型重症联合免疫缺陷病的早期诊断提供辅助。方法：从中英文数据库中检索截止到2013年6月12日的相关病例报道,并对目标病例的临床特点、免疫表型、分子特征等进行归纳总结。结果：该组不典型SCID患者的发病年龄从3月到17岁不等,中值约为9月,诊断年龄从10月到41岁不等,中值约为5岁。其感染的间隔和趋势主要表现出以下特点：感染较轻的(无并发症及严重后遗症),感染间隔相对较短(1个月左右),感染较重的(有并发症或严重后遗症),其感染间隔会相对较长(数月至数年不等),更有少数病例几乎没有反复感染的病史。不典型SCID患者的T、B细胞功能受损程度都较典型患者小,如不典型SCID的T细胞对PHA的增殖反应多数得到了保留,ADA组(7/19)、JAK3组(6/8)、Artemis组(3/3)、RAG1/2组(11/11)；免疫球蛋白的水平也较典型患者高,ADA组(19/20)、Artemis组(3/3)、RAG1/2组(11/11)；特异抗体反应也有相当程度的保留。结论：不典型重症联合免疫缺陷病在感染特征、淋巴细胞计数、抗体产生及淋巴细胞增殖等方面较典型重症联合免疫缺陷病有诸多不同。目前国内临床医师对不典型重症联合免疫缺陷病的认识不足,提高诊断意识,结合不典型重症联合免疫缺陷病的临床特征,免疫学检测及基因分析将极大帮助该病的诊断。