关键词： IL-28B   腺病毒   宫颈癌   U14细胞   Tregs  

摘要： 目的：构建小鼠(Babl/C和c57bl/6j )U14宫颈癌皮下移植瘤模型,研究腺病毒介导的IL-28B (Ad-mIL-28B)对U14宫颈癌皮下移植瘤小鼠脾脏中调节性T细胞(Tregs)的影响及其抗肿瘤的作用。方法：体外培养人胚肾293(HEK293)细胞；使用HEK293细胞扩增腺病毒(Ad-mIL-28B和Ad-EGFP)；采用微量全细胞病变法(CPE)进行病毒(Ad-mIL-28B 和 Ad-EGFP)滴度的测定；体外培养小鼠U14宫颈癌细胞,建立Babl/C 和 c57bl/6j小鼠U14宫颈癌腹水模型和皮下移植瘤模型；观察并测定Ad-mIL-28B处理后小鼠(Babl/C口c57bl/6j) U14宫颈癌皮下移植瘤瘤体的生长、瘤重,并计算抑瘤率、脾脏、肺脏和肝脏指数；流式细胞术检测Ad-mIL-28B处理后,U14宫颈癌皮下移植瘤小鼠(Babl/C口c57b1/6j)脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Tregs的变化；HE染色法检测小鼠(Babl/C 和 c57bl/6j) U14宫颈癌皮下移植瘤瘤体、肺脏及肝脏组织的病理变化。结果：1.采用CPE法测定病毒滴度后,病毒(Ad-mIL-28B 和 Ad-EGFP)滴度均为：108PFU/100μL。2成功建立了小鼠(Babl/C 和 c57b1/6j) U14宫颈癌腹水模型和皮下移植瘤模型。***-mIL-28B组、Ad-EGFP组及PBS组小鼠脾脏中的CD4+CD25+Foxp3+Tregs在淋巴细胞中所占的比例分别为4.76%±0.97%、5.38%±1.55%和6.92%±1.18%,与PBS组相比,Ad-mIL-28B组脾脏中的CD4+CD25+Foxp3+Tregs在淋巴细胞中所占的比例减少(p=0.034).4. Ad-mIL-28B组、Ad-EGFP组和PBS组Babl/C小鼠移植瘤的体积分别为107.6mm3±30.8mm3、 181.8mm3±14.2mm3 和 240.2mm3±21.3mm3,与PBS组相比,Ad-mIL-28B组能够明显的减小移植瘤的体积(p=0.008)。***-mIL-28B组、Ad-EGFP组和PBS组c57bl/6j小鼠移植瘤的体积分别为9.9mm3±2.7mm3、44.4mm3±7.6mm3和48.2mm3±8.1mm3,与 PBS组相比,Ad-mIL-28B组能够明显的减小移植瘤的体积(p=0.001)。***-mIL-28B组、Ad-EGFP组及PBS组小鼠移植瘤瘤重分别为78.4g±23.3g、200.1g±90.3g口303.2g±123.2g,与PBS组相比,Ad-mIL-28B组小鼠移植瘤瘤重明显减轻(p=0.049)。***-mIL-28B组、Ad-EGFP组和PBS组Babl/C小鼠的抑瘤率分别为：66.45%±8.88%、24.76%±6.68%和0%,与PBS组相比,Ad-mIL-28B能明显的抑制移植瘤的生长(p=0.000)。***-mIL-28B组脾脏和肺脏指数的变化与对照组相比,有统计学意义(p<0.05),而肝脏指数的变化无明显的统计学意义。***染色结果表明,Ad-mIL-28B组肿瘤组织中的异型性的肿瘤细胞的数量与对照组相比明显减少,肺脏和肝脏组织未见明显的瘤细胞转移。结论： Ad-mIL-28B能够降低U14宫颈癌皮下移植瘤小鼠(Babl/C和c57b1/6j)脾脏中的CD4+CD25+Foxp3+Tregs,并且能抑制小鼠(Babl/C和c57bl/6j)U14宫颈癌皮下移植瘤的生长,Ad-mIL-28B可能是通过降低CD4+CD25+Foxp3+Tregs的表达从而抑制小鼠(Babl/C和c57bl/6j)U14宫颈癌皮下移植瘤的生长。

关键词： 妊娠   调节性B细胞   白介素10   免疫调控  

摘要： 背景调节性B细胞是近年来发现的一种新的B细胞亚群,主要通过产生白介素(interleukin,IL)-10和转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)负性调控炎症免疫相关疾病的病理过程。妊娠免疫耐受的建立是一个极其复杂而又协调的过程。国内外学者对妊娠免疫耐受的机理做了深入的探索,绝大多数认为机体主要通过调节着床局部免疫功能,诱导产生免疫耐受,接受胎儿的植人并维持妊娠。本实验在前期发现妊娠期外周血血浆IL-10增高的基础上,进一步通过采用酶联免疫法(ELISA)、实时荧光定量PCR和流式细胞术等技术检测产生IL-10的调节性B细胞在不同妊娠周期的变化。探索妊娠耐受建立的分子机制,为流产、胎儿宫内发育迟缓、妊娠高血压综合症等诸多妊娠疾病发病机理的研究和筛选有效的治疗药物提供理论依据。同时也可为减轻同种异体器官的移植排斥反应并诱导免疫耐受开辟一条新路。目的检测产生IL-10的调节性B细胞在不同妊娠周期和健康未孕者体内的变化,探讨该B细胞亚群可能在妊娠免疫耐受的调控作用。方法1.研究对象：按照全国统编人卫版教材《妇产科学》第8版标准,选择驻马店市中心医院妇产科不同妊娠期妇女作为研究对象,根据妊娠周期不同分为妊娠早、中、晚三组。采用同时期体检科健康未孕妇女作为对照。2.样本收集和处理：收集不同妊娠期妇女和健康未孕妇女空腹血样10ml,以肝素锂抗凝,分离血浆冻存,并采用Ficol分离法分离外周血单个核细胞,备用。3.血浆IL-10水平的检测：采用人IL-10 ELISA检测试剂盒,检测血浆IL-10含量。4. IL-10 mRNA的检测：提取不同妊娠期妇女和健康未孕妇女外周血单个核细胞总RNA,经逆转录后,采用实时荧光定量PCR检测IL-10mRNA的表达情况。5.调节性B细胞及其亚群检测：分离同妊娠期妇女和健康未孕妇女外周血单个核细胞,采用多色荧光抗体结合流式细胞术检测并分析样本中产生IL-10的调节性B细胞及其亚群的分布情况,并结合其他检测指标分析其意义。6.统计学方法：计量数据以均数加减标准差(x±s)表示,两组间差异比较采用t检验,各组数据阳性率比较采用卡方检验。检验水准a=0.05,P<0.05为差异有统计学意。结果1.标本分组情况：妊娠早期妇女(<13周)20例,妊娠中期妇女(14周-27周末)20例,妊娠晚期妇女(>28周)20例,健康未孕妇女20例,共计80例样本。2.酶联免疫法ELISA检测结果：妊娠期妇女血浆IL-10含量明显高于未受孕女,妊娠早、中期IL-10含量分别为(326.85±33.91) pg/ml和(213.76±66.10) pg/ml,明显高于未受孕妇女(99.10±23.22) pg/ml,经t检验显示有显著统计学差异。3.荧光定量PCR检测结果：妊娠早期IL-10相对表达最高达(3712.00±123.00)倍数,随着妊娠周期的延长,IL-10mRNA的表达下降。4.流式细胞术结果：妊娠早、中期CD19+IL-10+B细胞百分比分别为(14.30±2.12)%和(7.53±1.11)%,明显高于非妊娠妇女百分比,经过卡方检验结果有统计学差异,且发现该群细胞高表达CD24和CD38,而非CDld和CD5。结论***-10mRNA及其蛋白在妊娠期均高表达,特别是在妊娠早、中期,说明妊娠期机体高表达IL-10从而负性调节妊娠期免疫、参与妊娠免疫耐受的建立。2. CD19+CD24+CD38+IL-10+B细胞可能参与妊娠期免疫耐受的调控。

关键词： 慢性HBV感染   调节性B细胞   细胞因子   IL-10   IP-10  

摘要： 目的:观察不同免疫状态下慢性HBV(hepatitis B virus,乙型肝炎病毒)感染者外周血调节性B细胞(regulatory B cells,Breg细胞)比例及血清中细胞因子IL-10、IP-10水平的变化特点。方法:采集63例处于不同免疫状态的慢性HBV感染者(免疫耐受期15例,免疫活化期23例,非活动性HBV携带期25例)及16例健康个体的外周血,采用流式细胞术检测其外周血Breg细胞(CD24hi CD38hi B细胞)占外周血B细胞总数的比例。同时对患者的血清标本使用luminex技术检测IL-10、IP-10细胞因子水平。结果:免疫活化组外周血Breg细胞比例高于免疫耐受组和健康对照组(7.11(5.82,8.18)%vs 4.40(3.48,5.50)%,P=0.010;7.11(5.82,8.18)%vs 5.32(3.11,6.05)%,P<0.001),免疫耐受组成熟B细胞(CD24int CD38int B细胞)比例低于健康对照组(47.19(35.33,52.91)%vs 57.00(48.23,61.14)%,P=0.02)。免疫活化组血清IL-10、IP-10水平高于免疫耐受组、非活动HBV携带组及健康对照组(18.14(5.85,25.16)pg/ml vs 0.01(0.00,0.46)pg/ml,18.14(5.85,25.16)pg/ml vs0.00(0.00,0.10)pg/ml,18.14(5.85,25.16)pg/ml vs 0(0.00,0.00)pg/ml,P均<0.001;1720.0(1040.0,4042.0)pg/ml vs 661.4(508.0,940.6)pg/ml,1720.0(1040.0,4042.0)pg/ml vs 554.7(390.1,740.7)pg/ml,1720.0(1040.0,4042.0)pg/ml vs 653.2(398.6,715.8)pg/ml,P均<0.001)。慢性HBV感染者Breg细胞比例与血清IL-10水平、ALT水平存在正相关关系(r=0.282,P=0.025;r=0.305,P=0.026)。免疫活化期的慢性HBV感染者血清IL-10水平与ALT水平正相关(r=0.715,P<0.001),血清IP-10水平与ALT水平正相关(r=0.653,P<0.001)。结论:慢性HBV感染者在不同的免疫状态时期外周血Breg细胞比例及血清中细胞因子水平表现不同。免疫活化期的慢性HBV感染者Breg细胞比例升高,且其外周血IL-10、IP-10也显著升高。慢性HBV感染者外周血Breg细胞比例与血清IL-10、ALT水平正相关,免疫活化期感染者血清IL-10、IP-10水平与ALT水平正相关。

关键词： 类风湿关节炎   调节性T细胞   调节性B细胞   临床观察  

摘要： 本文主要从以下几个部分进行论述：　　第一部分 类风湿关节炎患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Tregs的变化　　目的：　　调节性T细胞（RegulatoryT cell，Tregs）参与免疫性疾病的发病机制目前尚不十分清楚，但其在自身免疫耐受和维持内环境稳态中起着重要作用，当失去平衡时会影响疾病的发生、活动性。Tregs在类风湿关节炎(RheumatoidArthritis，RA)发病、病情进展方面作用如何，临床研究报告不多。本研究通过应用流式细胞仪技术检测RA患者外周血CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占CD4+T淋巴细胞百分比变化，并与正常对照组、患者病情活动情况进行比较分析，探讨Tregs与RA发生、发展的关系。　　方法：　　选择RA患者69例，健康对照者(Health control，HC)26例。患者排除其他自身免疫性疾病、肿瘤、感染及相关药物应用史。采集并提取外周血单个核细胞，应用流式细胞仪技术进行相关检测。分析CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占外周血CD4+T淋巴细胞比例和CD4+CD25+FoxP3+ Tregs与疾病活动度（依据DAS28评分）及临床疾病活动相关指标的关系;同时，将RA患者根据病程分为3组，即病程不超过1年组，病程1-5年组，病程超过5年组，结合DAS28评分，将其分为DAS28＞3.2、DAS28＞5.1组进行分析。　　结果：　　1、RA患者组CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占外周血CD4+T淋巴细胞比例总体分析较HC组明显增多;但在病程不超过1年，DAS28＞3.2组，其CD4+CD25+FoxP3+ Tregs比例呈现减少改变，但与正常对照组无统计学差异;2、CD4+CD25+FoxP3+ Tregs比例变化与RA患者红细胞沉降率(Erythrocytesedimentation rate，ESR)和C反应蛋白(C reactive protein，CRP)呈正相关，但与类风湿因子(Rheumatoid factor，RF)和抗CCP抗体间无明显相关性;3、CD4+CD25+FoxP3+ Tregs比例变化与RA患者疾病活动度呈正相关;4、在病程不超过1年组和病程1-5年组，CD4+CD25+FoxP3+ Tregs比例变化在DAS28＞5.1组和DAS28＞3.2组间具有显著差异，且病程越短差异性越显著;但在病程超过5年组无明显差异。　　结论：　　CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占外周血CD4+T淋巴细胞比例在RA组总体表现增多，并且与ESR、CRP、DAS28呈正相关性，说明CD4+CD25+FoxP3+ Tregs的变化与RA疾病活动相关。通过对不同病程、疾病活动程度不同（即通过DAS28进行判断）的患者进行该项分析研究表明，病程越短，CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占外周血CD4+T淋巴细胞比例变化越大，对疾病的影响越大。而CD4+CD25+FoxP3+ Tregs比例的增加除了有机体反应性增高因素外，其可能通过多种途径参与RA发生、发展、加重过程。因此，在临床诊治过程中，早期选择能够有效调节或影响CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占CD4+T淋巴细胞比例及功能的药物，对控制RA病情变化及进展具有重要意义。　　第二部分 三种临床常用治疗药物在体外培养中对CD4+CD25+FoxP3+Tregs变化的影响　　目的：　　Tregs通过抑制多种免疫细胞的增殖和功能参与维持免疫稳态。近年，也有文献报告其参与机体炎症反应过程。调整Tregs在外周血中占CD4+T淋巴细胞比例可能成为临床上免疫相关疾病治疗的一种新策略。在RA相关研究中，关于临床药物在RA患者中针对CD4+CD25+FoxP3+ Tregs调控作用的比较分析报告尚少。本研究选取甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)、糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)、抗TNF-α靶向药等目前RA治疗中常用药物，利用细胞培养技术，通过流式细胞仪分析给药前及细胞培养结束时CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占CD4+T淋巴细胞百分变化，探讨其在RA临床治疗中对CD4+CD25+FoxP3+ Tregs的作用及影响。　　方法：　　选择RA患者90例，随机分为5组，分别设为无药组、MTX组、GC组、抗TNF-α靶向药组、联合应用3种药物组，选择健康对照者10例，同时选择临床应用MTX患者10例。患者排除其他自身免疫性疾病、肿瘤、感染及相关药物应用史。无菌条件下采集并提取外周血单个核细胞，利用细胞培养技术，通过流式细胞仪在给药前及细胞培养结束时进行相关检测。分析不同治疗药物和方法对CD4+CD25+FoxP3+ Tregs变化的作用及影响，探讨在临床治疗中可能的意

关键词： 胸腺B细胞   调节性B细胞   调节性T细胞   T细胞分化   免疫稳态  

摘要： 背景:胸腺是机体重要的中枢免疫器官,是T细胞分化、发育、成熟的场所。胸腺细胞经过阳性选择、阴性选择逐渐分化为成熟的T细胞,并迁移到外周免疫器官发挥功能。胸腺为T细胞发育提供了一个复杂的微环境,该微环境由胸腺基质细胞、可溶性分子以及细胞外基质共同构成,有序调控T细胞的发育、成熟和迁移等。近年来有少数研究工作证明,人和鼠的胸腺中均存在着少量的B细胞,其比例占到整个胸腺中所有细胞的0.1-0.5%。正常胸腺中存在着不同发育阶段的B细胞,初步资料显示,胸腺中B细胞具有一定的生理功能,例如参与胸腺内T细胞的分化发育过程。胸腺B细胞可定位于胸腺皮质和髓质的连接处,该区域被认为是胸腺T细胞分化发育过程中阴性选择的发生场所,由此研究人员认为胸腺B细胞在T细胞的阴性选择过程中发挥关键作用,然而胸腺B细胞如何参与T细胞的阴性选择过程及影响T细胞分化、发育机制等仍不清楚。在病理状态下,在胸腺内可发生B细胞的浸润和淋巴滤泡的形成等异常表现,少量研究表明,胸腺B细胞的异常可能与自身免疫病的发生发展相关联,但是胸腺B细胞在自身免疫病中的功能和作用机制等仍不清楚。要解答这些问题都有待于进一步阐明胸腺中B细胞的表型、功能和起源等。因此,我们围绕胸腺B细胞的亚群鉴定及胸腺B细胞亚群在免疫调节和应答中的作用及机制进行了初步探讨。目的:探究生理及自身免疫病中胸腺B细胞亚群变化及其在机体免疫调节和应答中的作用及机制。方法:1.首先,为了验证胸腺中是否存在B细胞,应用流式细胞术对小鼠胸腺淋巴细胞进行胞膜染色,对B细胞所占比例和表型进行分析、鉴定;2.为了鉴定胸腺中调节性B细胞及效应性B细胞,我们分析了正常小鼠和自身免疫病系统性红斑狼疮模型小鼠胸腺中B细胞;为了分析胸腺中是否存在调节性B细胞,分离胸腺淋巴细胞,用LPS(10mg/ml)体外刺激后,收集细胞,通过流式细胞术进行胞内染色,分析IL-10的表达水平。在此基础上,通过胞膜染色对胸腺调节性B细胞表型作进一步分析;为了分析自身免疫病中胸腺效应B细胞,分离胸腺淋巴细胞,通过流式细胞术分析了分泌抗体的浆细胞。3.为了进一步检测胸腺调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)内IL-10表达水平,应用流式细胞仪分选调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)和非调节性B细胞(表型为CD19+CD5-CD1dlo)后,通过实时荧光定量PCR检测IL-10 m RNA相对表达量;4.为了研究胸腺调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)体外功能,首先经胞膜染色标记后,应用流式细胞仪分选调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)和非调节性B细胞(表型为CD19+CD5-CD1dlo),并通过磁珠分选CD4+T细胞;一方面用CFSE标记CD4+T细胞后分别与调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)和非调节性B细胞(表型为CD19+CD5-CD1dlo)体外共培养72h,流式检测CD4+T细胞增殖抑制情况;另一方面,直接将CD4+T细胞与调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)和非调节性B细胞(表型为CD19+CD5-CD1dlo)体外共培养72h,收集细胞,经流式胞内染色检测调节性T细胞水平;5.为了研究胸腺调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)体内生理功能,应用流式细胞仪分选调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)和非调节性B细胞(表型为CD19+CD5-CD1dlo)后,经尾静脉回输给CD19cre小鼠和狼疮小鼠,取脾、淋巴结、胸腺等免疫器官和组织,应用流式细胞术检测调节性T细胞,调节性B细胞,CD4-CD8+T细胞和CD8-CD4+T细胞等水平变化;经眼球取血,ELISA分析外周血清中自身抗体滴度;取肾脏,4%甲醛固定后苏木精-伊红染色分析肾脏病理改善状况。6.为了探讨狼疮小鼠胸腺B细胞对T细胞分化的影响,胞膜染色标记后流式分选胸腺B细胞,经尾静脉回输给野生型小鼠,一周后处死小鼠,流式检测ISP细胞,CD4-CD8+和CD8-CD4+T细胞等变化情况。7.为了研究m TOR缺失对胸腺B细胞和ISP细胞的影响,应用流式细胞术检测m TOR+/-小鼠胸腺B细胞、不成熟CD8+T细胞(ISP,表型为CD3lo/-CD4-CD8+)比例和数目的变化。结果:1.在小鼠胸腺中检测到一定比例的B细胞,B细胞占胸腺细胞0.1%;经Ficoll分离胸腺淋巴细胞后,B220+细胞比例提高到13.35%,CD19+细胞比例提高到4.7%,并对B细胞表型做了进一步分析。在胸腺细胞中存在IL-10+B细胞和Ig G+B细胞。2.在正常小鼠胸腺中存在一群表达IL-10的调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi);在IL-10-GFP报告基因小鼠中也发现存在

关键词： 脂氧素A4   调节性B细胞   白介素10   调节性T细胞  

摘要： 目的：脂氧素(LXA4)在炎症的调控中发挥着重要作用。LXA4同样具有抗肿瘤作用。我们实验室先前的研究发现,LXA4能通过重塑肿瘤微环境和抗肿瘤血管生成来抑制肝癌肿瘤细胞的生长,但是其免疫学机制仍不是十分清楚。调节性B细胞,是一种能分泌IL-10的B细胞,已被证明在炎症、自身免疫性疾病和肿瘤的调控中发挥重要作用。最新的研究表明人和小鼠的B细胞上都有LXA4受体的表达。本研究旨在通过研究LXA4对调节性B细胞的作用来阐明其抑制肿瘤生长的免疫学机制。 方法：(1)将不同的肿瘤细胞系通过皮下接种至小鼠,随机分为两组,其中一组腹腔注射LXA4类似物BML-111(1mg/kg)进行治疗,观察并记录肿瘤生长情况。此外,用CFSE标记小鼠肝癌H22细胞,培养24h后,检测LXA4对细胞生长的影响。(2)为寻找LXA4抑制肿瘤的机制,将肝癌H22细胞接种至SCID小鼠,并分为四组：对照组、LXA4治疗组、CD3+T细胞过继转移组、CD3+T细胞过继转移+LXA4治疗组,观察并记录肿瘤生长的情况。(3)为探讨LXA4对调节性B细胞的作用,体外条件下,分离小鼠脾脏B细胞,培养液中加入或不加LXA4,并在PMA、离子霉素、LPS和莫能菌素四种因子的刺激下,5h后通过流式细胞术检测LXA4对调节性B细胞生成的影响。体内条件下,将LXA4治疗的肿瘤小鼠的脾脏取出,比较治疗组和对照组调节性B细胞的数量。为探讨LXA4对B细胞其他功能的作用,通过CFSE标记、流式细胞术和HE染色的方法检测LXA4对B细胞增殖、浆细胞分化以及生发中心结构的影响。(4)将裸鼠皮下接种H22细胞,分为两组,其中一组每两天用LXA4治疗一次,观察并绘制肿瘤生长曲线,并通过流式细胞术和ELISA法检测小鼠脾脏调节性B细胞的数量及外周血、脾脏组织内炎症因子***-α和IL-1β的蛋白表达情况。(5)将纯化的CD4+T细胞标记CFSE,检测LXA4对其增殖的影响;将纯化的CD8+T细胞用PMA和离子霉素刺激,检测LXA4对其分泌IFN-γ能力的影响。(6)将H22细胞皮下接种至Balb/c小鼠,分为两组,其中一组每两天用LXA4治疗一次,第15天取脾脏、接种肿瘤侧引流淋巴结并分离肿瘤组织内浸润的淋巴细胞,通过流式细胞术检测调节性T细胞的数量和CD8+T细胞的杀伤能力。并通过免疫组织化学的方法检测肿瘤组织内浸润的T细胞的数量。(7)通过磁珠分选的方法将CD4+CD25-T细胞纯化出来后,在刺激性抗体CD3和CD28以及细胞因子TGF-β和IL-2的作用下,72h后检测LXA4对诱导生成的调节性T细胞数量的影响。另外,将纯化出来的CD4+T细胞与B细胞按照1：1的比例在CD3和LPS的作用下共培养,72h后检测LXA4能否通过B细胞影响诱导的调节性T细胞的生成。(8)为寻找LXA4影响调节性B细胞的分子机制,将LXA4治疗小鼠的脾脏细胞或纯化的B细胞提取蛋白质,并通过Western Blot的方法检测转录因子ERK和STAT3的磷酸化水平。此外,体外诱导调节性B细胞并加入ERK或STAT3的磷酸化抑制剂,5h后检测调节性B细胞生成的情况。 结果：(1)LXA4类似物BML-111对多种不同的肿瘤细胞系都有抑制其在体内生长的作用。此外,LXA4对肿瘤的生长没有直接的影响。(2)与对照组相比,LXA4能够促进SCID小鼠的肿瘤生长;将CD3+T细胞过继回输至SCID小鼠体内后,增强了抗肿瘤的效应,但是LXA4同样也不影响肿瘤的生长。(3)LXA4在体外和体内都能明显抑制调节性B细胞的生成,但是LXA4不影响B细胞的增殖、生发中心的结构以及浆细胞的分化。(4)在裸鼠中,LXA4能明显抑制调节性B细胞的生成,同时降低了炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β的蛋白表达,但是肿瘤在裸鼠中的生长并没有受到影响。(5)LXA4不影响CD4+T细胞的增殖以及CD8+T细胞分泌IFN-γ的能力。(6)LXA4抑制了引流淋巴结和肿瘤组织内的调节性T细胞的数量,并增强了CD8+T细胞的杀伤能力,但是对脾脏中的这两种细胞没有影响;免疫组化的结果显示LXA4增强了CD3+T细胞浸润肿瘤的能力。(7)LXA4不能通过直接作用影响调节性T细胞的生成,但是可以通过B细胞来抑制这种细胞的数量。(8)LXA4能有效地抑制B细胞而不是脾脏细胞中转录因子ERK和STAT3的磷酸化水平。加入ERK或STAT3的磷酸化抑制剂后能有效地抑制调节性B细胞的生成,说明这两种转录因子的磷酸化与调节性B细胞的生成密切相关。 结论：LXA4能有效地抑制多种肿瘤细胞的生长;LXA4对肿瘤细胞没有直接作用,而是通过对调节性B细胞的抑制从而增强了抗肿瘤效应;LXA4通过抑制调节性B细胞的生成从而减少了引流淋巴结和肿瘤组织内调节性T细胞的数

关键词： ABO血型不合   肝移植   急性肝衰竭   抗体介导的排斥反应   利妥昔单抗   免疫球蛋白   免疫耐受   调节性B细胞  

摘要： 目的 在供肝资源稀缺、无血型相合供肝的情况下,急诊ABO血型不合肝移植是挽救急性肝功能衰竭患者生命的有效手段。但传统的血型不合肝移植围手术期免疫抑制方案过于复杂,需要术前数周开始进行特殊的准备,不适用于急诊肝移植及危重症患者。因此,我们探索并尝试了一种简化的围手术期跨越血型屏障方案（以利妥昔单抗和免疫球蛋白为基础,不采用血浆置换、脾脏切除和肝脏灌注）,观察其是否可以有效预防血型不合肝移植术后发生血型抗体介导的排斥反应;并通过与同期开展的血型相合肝移植治疗急性肝衰竭病例在生存率、并发症等各方面进行比较,探讨其在急诊ABO血型不合肝移植治疗急性肝衰竭中应用的可行性、有效性和安全性。 同时,我们还尝试通过动物实验建立ABO血型不合肝移植受者人PBMC-NOD/SCID小鼠嵌合体模型,以供体血型红细胞抗原致敏,检测小鼠血型抗体水平,以此来验证并阐明ABO血型不合肝移植术后可以产生针对供体血型抗原的特异性免疫耐受。并通过比较健康人群、血型不合患者术后早期和术后晚期的CD19+CD24hiCD38hi调节性B细胞水平,初步探讨了调节性B细胞在血型抗原特异性免疫耐受中可能发挥的作用。 材料与方法 第一部分： 急诊ABO血型不合肝移植治疗急性肝衰竭---利妥昔单抗联合免疫球蛋白简化方案的应用 1.病人资料：分析2010年1月-2013年7月,我中心（浙江大学医学院附属第一医院肝移植中心）共为101例急性肝衰竭患者进行急诊肝移植治疗（尸体供肝）,血型相合组66例,血型不合组35例;2.围手术期免疫抑制方案：血型不合组患者手术当天使用1剂利妥昔单抗（375mg/m2）,免疫球蛋白手术当天开始使用并连续使用10天（0.4g/kg*10d）。两组术后基础免疫抑制方案包括巴利昔单抗、肾上腺糖皮质激素、他克莫司和吗替麦考酚酯;3.术后抗感染治疗方案;4.他克莫司血药浓度检测：酶联免疫吸附分析法;5.血型不合组患者围手术期抗供体血型抗体（IgM）效价检测：盐水稀释法;6.血型不合组患者围手术期CD20+B淋巴细胞检测：直接免疫荧光标记流式细胞术;7.统计学分析：所有统计分析均使用SPSS17.0统计软件包进行统计学处理。连续变量以平均数和标准差描述,非连续变量以数字和百分比描述,以Students’t检验或卡方检验比较组间差异。患者累积生存率与移植肝存活率使用Kaplan-Meier法统计,组间生存曲线比较使用log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。 第二部分： ABO血型不合肝移植诱导供体血型抗原特异性免疫耐受的实验研究 1.研究对象基本数据：2例接受ABO血型不合肝移植长期生存受者作为实验组,并根据其供受者血型设立相应阳性对照与阴性对照,共6例研究对象。分别编号为1A（血型不合受者AB→A）,阳性对照1B（血型相合受者A→A）,阴性对照1C（血型相合受者AB→AB）;2A（血型不合受者AB→）,阳性对照2B（血型相合受者O→O）,阴性对照2C（血型相合受者AB→AB）。另入组18例健康志愿者和6例血型不合肝移植术后早期受者作为CD19+CD24hiCD38hi调节性B细胞检测的对照组;2.主要试剂及其配方;3.主要仪器与设备;4.血型不合受者（1A、2A）外周血抗供体血型抗体（IgM）检测：盐水稀释法;5.人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）的分离：葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法,（1A、1B、1C、2A、2B、2C）;6. NOD/SCID小鼠饲养;7.构建人PBMC-NOD/SCID小鼠嵌合体模型及红细胞致敏：第一天,PBMCs腹腔注射小鼠;第五天,AB型红细胞免疫小鼠;第十四天,获取小鼠血清;8. PBMC-NOD/SCID嵌合小鼠血型抗体（IgM）检测：酶联免疫吸附分析法;9.健康志愿者、血型不合肝移植术后早期受者和术后长期存活受者（1A、2A）外周血CD19+CD24hiCD38hi调节性B细胞检测：直接免疫荧光标记流式细胞术;10.统计学分析：用SPSS17.0软件计算各组数据的平均数和标准差。用Students’t检验比较组间差异。p＜0.05为差异有统计学意义。 结果 第一部分 1.两组患者肝移植术前基本资料比较无统计学差异;2.两组患者肝移植术后他克莫司血药浓度比较无统计学差异;3.血型不合组供受者血型为AB→O最常见,占34%;4.血型不合组患者术前抗供体血型抗体（IgM）效价1：4-1：1024（平均1：192）,术后迅速下降,术后第1天和第7天分别为1：1-1：32（平均1：16）和1：4-1：128（平均1：28）,并在术后数月维持较低水平。CD20+B淋巴细胞计数在术后迅速

关键词： 动脉粥样硬化   调节性T细胞   Th17细胞   HMGB-1蛋白   炎症反应   致病机理  

摘要： 目的：将动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)患者和健康人作为研究对象，检测两种健康状况的外周血中促炎性细胞因子和抑炎性细胞因子含量的变化，以及研究对象中调节性T细胞和Th17细胞含量的变化，研究在动脉粥样硬化发生发展过程中高迁移率族蛋白-1（high mobility group box1 protein,HMGB-1）和Th17/Treg的平衡与AS形成的相互关系，探讨AS的致病因素，寻找可能存在的治疗靶点，并为防治动脉粥样硬化以及动脉粥样硬化所致的并发症提供实验基础和理论依据。　　方法：实验设立对照组和AS组，检测健康人和动脉粥样硬化患者外周血中高迁移率族蛋白-1(HMGB-1)和调节性T细胞（T regulatory cell,Treg）以及Th17细胞之间的含量变化，(1)采用 Ficoll密度梯度离心法分别将动脉粥样硬化患者和健康人外周血分离得到人外周血单个核细胞（PBMCs）。(2)将分离出的单个核细胞采用磁珠分选法分选出调节性T细胞（Tregs）。(3)用流式细胞术检测磁珠分选所得CD4+T细胞和调节性 T细胞的纯度。(4)将不同浓度的 HMGB-1和 Treg细胞共培养，研究HMGB-1对Treg细胞的体外诱导分化，检测封闭TLR4受体和不封闭TLR4受体时培养上清液中细胞因子TGF-β1、IL-10含量的变化。(5)用酶联免疫吸附试验法分别检测动脉粥样硬化患者和健康人血清中的细胞因子TGF-β1、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-23和HMGB-1的含量。（6）用SPSS18.0软件进行统计学分析。所得数据以x±s表示，两组之间的均数比较用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。　　结果：　　(1)AS患者外周血中的HMGB-1的含量比健康人外周血中的含量明显增高。　　(2)AS组外周血中的TGF-β1和IL-10含量比对照组明显降低。　　(3)AS组外周血中IL-6、IL-17A、IL-23的含量较对照组明显增高。　　(4)随着HMGB-1的浓度逐渐增加，封闭TLR4受体的CD4+T细胞分泌IL-10的功能增强，随着HMGB-1刺激的浓度逐渐增加，未封闭TLR4受体的CD4+T细胞分泌IL-10的功能反而减弱。　　(5)随着HMGB-1的浓度逐渐增加，封闭TLR4受体的CD4+T细胞分泌抑炎性细胞因子TGF-β1的功能增强，而未封闭TLR4受体的CD4+T细胞分泌TGF-β1的功能减弱。　　结论：动脉粥样硬化患者外周血中促炎性细胞因子和抑炎性细胞因子与健康人的水平存在较大的差异，本研究通过体外不同浓度的HMGB-1与CD4+T细胞共培养时，未封闭和封闭TLR4受体的CD4+T细胞分泌TGF-β1、IL-10的功能是不同的，随着的HMGB1刺激浓度增加，未封闭TLR4受体的CD4+T细胞的分泌功能减弱，而封闭TLR4受体的CD4+T细胞分泌功能增强。AS患者外周血中HMGB-1、TGF-β1、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-23的含量与健康人之间差异较大，促炎性细胞因子水平明显升高，抑炎性细胞因子 IL-10、TGF-β1水平降低，使炎症反应增强，促进了动脉粥样硬化的发展。

关键词： 细粒棘球蚴感染   Breg   IL-10   TGF-β1  

摘要： 目的:研究调节性B细胞及相关分子表达水平在细粒棘球蚴持续性感染小鼠过程中的表型改变、变化特点的相关性,探讨其在细粒棘球蚴感染中的免疫作用及与细粒棘球蚴感染发生发展的关系。方法:将96只雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,实验组通过腹腔门静脉接种原头蚴悬液制备细粒棘球蚴感染小鼠模型,对照组腹腔注射等量生理盐水。分别在接种2天、8天、30天、90天、180天和270天收集标本。通过流式细胞术检测小鼠脾脏中调节性B细胞CD1dhiCD5+CD19hi细胞和CD1dhiCD5+CD19hiIL-10+细胞比例;通过ELISA法检测小鼠血清IL-10和TGF-β1的水平;HE染色观察小鼠肝脏的病理学改变;用免疫组织化学法检测IL-10和TGF-β1在肝脏的表达及分布;通过实时荧光定量RT-PCR检测小鼠脾脏淋巴细胞IL-10和TGF-β1 mRNA的表达水平。结果:1)流式细胞术检测结果显示与对照组相比,小鼠脾脏CD1dhiCD5+CD19hi细胞和CD1dhiCD5+CD19hiIL-10+细胞比例在感染后90天、180天和270天显著性升高（P<0.05）。2)实时荧光定量RT-PCR结果显示与对照组相比,在感染早期IL-10和TGF-β1 mRNA均低水平表达,感染后90天IL-10 mRNA的表达显著增加（P<0.05）,TGF-β1 mRNA在感染后30天表达显著升高（P<0.05）,随后均保持较高的水平（P<0.05）。3)HE染色观察结果显示,肝细胞中出现水肿,出现胆管增生,肝脏结构破坏,分不清小叶结构,肝细胞空泡样变性,感染晚期可见淋巴细胞浸润。4)免疫组织化学法结果显示肝脏在细粒棘球蚴感染过程中,IL-10和TGF-β1在肝脏的主要表达部位由早期的肝窦区少量肝细胞胞浆转移至纤维囊壁和病灶处的生发层周围。感染早期,IL-10和TGF-β1均不表达或低水平表达;感染中晚期,随着小鼠体内及肝脏细粒棘球蚴的不断增大增多,IL-10和TGF-β1的表达均显著升高（P<0.05）。5)ELISA检测结果显示与对照组相比,感染早期小鼠血清IL-10和TGF-β1水平显无明显改变;感染中、晚期小鼠血清IL-10和TGF-β1水平均显著升高（P<0.05）。结论:CD1dhiCD5+CD19hi调节性B细胞可能是导致细粒棘球蚴感染免疫抑制的原因之一。在细粒棘球蚴感染的早期,小鼠脾脏CD1dhiCD5+CD19hi调节性B细胞和CD1dhiCD5+CD19hiIL-10+调节性B细胞增加不明显,感染晚期,两种细胞均显著增高,提示调节性B细胞参与了细粒棘球蚴感染的发生发展。细粒棘球蚴感染中,IL-10和TGF-β1表达随体内细粒棘球蚴组织的不断增多增大持续升高,推测Breg发挥抑制作用可能通过调节细胞因子的表达并诱导分泌抑制性细胞因子IL-10和TGF-β1发挥抑制作用。

关键词： 心肌炎   柯萨奇病毒感染   B10细胞   调节性B细胞  

摘要： 目的：观察柯萨奇病毒B3 (Coxsackie virus B3, CVB3)诱导的小鼠急性病毒性心肌炎(Acute viral myocarditis, AVMC)发病过程中不同时点脾脏B10细胞亚群比例的变化,初步探讨B10细胞是否参与AVMC的炎症过程。方法：利用CVB3感染无特定病原级(Specific pathogen free, SPF)雄性Balb/c小鼠建立AVMC模型。AVMC组(n=20)小鼠腹腔注射CVB3病毒液,对照组(n=10)小鼠腹腔注射等量磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline, PBS);依据注射CVB3或PBS后的时间,AVMC组和对照组小鼠均随机分为1周和2周两个时点亚组。各亚组在到达相应观察时点后处死存活小鼠,无菌留取心脏及脾脏组织标本。取心脏组织作石蜡切片,行苏木素伊红(Hematoxylin-Eosin, HE)染色,观察心肌组织病理改变并计算心肌病理积分；实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real time-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)检测心肌组织中CVB3 mRNA的表达水平；流式细胞术检测小鼠脾脏CD19+IL-10+细胞(即B10细胞)亚群和CD19+CDldhiCD5+细胞亚群占CD19+细胞的比例。结果：AVMC组各亚组小鼠心肌炎症水平明显高于对照组相应亚组,AVMC组中1周亚组小鼠心肌组织病理积分低于2周亚组,差异均有统计学意义(P均<0.05)；与对照组相比,AVMC组各亚组小鼠心肌组织CVB3mRNA表达水平均明显升高,且AVMC组中1周亚组小鼠心肌CVB3 mRNA表达水平高于2周亚组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。AVMC组小鼠脾脏B10细胞亚群比例和CD19+CDldhiCD5+细胞亚群比例均高于对照组,且AVMC组1周亚组小鼠脾脏B10细胞亚群比例和CD19+CDldhiCD5+细胞亚群比例均高于2周亚组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。AVMC小鼠发病过程中,脾脏B10细胞亚群比例与CD19+CDldhiCD5+细胞亚群比例及心肌组织中CVB3mRNA表达三者相平行,而与心肌组织炎症水平相反。结论：B10细胞在急性病毒性心肌炎小鼠脾脏中所占比例增高,其参与了急性病毒性心肌炎的炎症过程。