关键词： 急性呼吸窘迫综合征   急性肺损伤   调节性T细胞   高迁移率族蛋白B1   Toll样受体4  

摘要： 目的:探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)通过Toll样受体4(TLR4)介导小鼠急性肺损伤时CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)免疫功能及免疫抑制活性的变化;研究CD4+CD25+Treg与CD4+CD25-T细胞相互作用的影响。方法:分别给健康清洁级C57BL/10J和C57BL/10Sc[分别为TLR4野生型(TLR4+/+)和敲除型(TLR4-/-)]小鼠气管内注射HMGB1(20μg/只)为实验组,同时设立气管内注射生理盐水野生型小鼠为对照组;(1)于造模后饲养48小时眼球取血法法处死小鼠收集血清及肺泡灌洗液(BALF),光镜下观察肺脏病理改变,称重测定肺脏干湿比;采用免疫磁珠分离脾脏CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-T细胞。(2)将各组部分CD4+CD25+Treg体外培养24小时后,采用流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg表达叉头翼状螺旋转录因子(FOXP3)和淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的表达强度,并且用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测BALF中白细胞介素-1(IL-1),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及CD4+CD25+Treg分泌的白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-β(TGF-β)的含量。(3)将各组CD4+CD25+Treg与对照组CD4+CD25-T细胞按1:1比例共培养,包被CD3单抗和可溶性CD28单抗辅助活化;CCK-8法检测CD4+CD25+Treg对CD4+CD25-T细胞增殖的抑制作用。并采用ELISA法检测共培养体系中分泌的白细胞介素-4(IL-4)、IL-2和干扰素-γ(IFN-γ)的含量。结果:1、与对照组相比,两实验组小鼠气管内注射HMGB1后,肺组织损伤程度明显严重,肺脏干湿比值及BALF灌洗液中TNF-α,IL-1含量显著增高,且TLR4野生型小鼠较TLR4敲除型小鼠病变程度更加严重;2、流式细胞学检测免疫磁珠分选的CD4+CD25+Treg纯度在90%以上;TLR4野生型急性肺损伤小鼠FOXP3和CTLA-4表达强度低于对照组和TLR4敲除型(P<0.05);野生型实验组小鼠Treg分泌的IL-10及TGF-β含量较对照组含量降低(P<0.05),而TLR4敲除型较对照组IL-10及TGF-β含量升高(P<0.05);3、经CD3和CD28辅助活化后,TLR4野生型急性肺损伤小鼠CD4+CD25+Treg与效应T细胞共培养上清中,IL-2,IFN-γ含量高于对照组(P<0.05),IL-4含量低于对照组(P<0.05),提示CD4+CD25+Treg可使T细胞极化Th2细胞能力减弱,向Th1细胞方向极化;而TLR4敲除型急性肺损伤小鼠CD4+CD25+Treg与效应T细胞共培养上清中,IL-2,IFN-γ含量低于对照组(P<0.05),IL-4含量高于对照组(P<0.05),CD4+CD25+Treg介导的免疫抑制效应促使T细胞极化为Th2细胞,引起Th1/Th2的漂移。结论:1、气管内注射HMGB1可以诱导小鼠急性肺损伤模型;2、免疫磁珠分选的CD4+CD25+Treg细胞纯度较高,可以满足后续实验的要求;3、在急性肺损伤时HMGB1可通过TLR4下调CD4+CD25+Treg的免疫功能,使CD4+CD25+Treg中Foxp3和CTLA-4分子的表达下调,从而减弱其免疫抑制功能的发挥;4、在急性肺损伤时HMGB1可通过TLR4使CD4+CD25+Treg极化Th2细胞能力减弱,向Th1细胞方向极化,弱化了CD4+CD25+Treg的功能,影响炎症反应的结局;为ARDS开辟新的治疗靶点。

关键词： 过敏性紫癜   调节性B细胞   免疫平衡   细胞病理学  

摘要： 本文对CD40/CD40L信号通路调控调节性B细胞在HSP和HSPN中的作用机制进行了研究。本研究分为两个部分：　　第一部分：调节性B细胞对HSP和HSPN患儿Th17/Treg免疫平衡的影响。过敏性紫癜（HSP）是儿童时期最常见的自身免疫性血管炎，并发肾脏损害时称为紫癜性肾炎（HSPN）。大量研究显示CD4+T细胞亚群（Th1，Th2，Th17和Treg）功能紊乱参与儿童HSP的发生发展，包括 Th1/Th2的免疫失衡和 Th17/Treg的免疫失衡。同时，有研究指出Th17/Treg的免疫失衡与HSPN肾脏损害的严重程度密切相关。而目前尚无研究中心就不同肾脏累及程度的 HSPN患儿进行分组详细讨论Th17、Treg细胞比例及 Th17/Treg比值在其中的具体变化。调节性 B细胞作为一群能通过分泌IL-10调控CD4+T细胞免疫反应的负向调节性免疫细胞，参与影响Th17/Treg的免疫平衡，在多种自身免疫性疾病中得到了普遍研究，如系统性红斑狼疮（SLE），风湿性关节炎（RA），炎症性肠病（IBD）等，但是其在儿童 HSP及 HSPN中是否能影响Th17/Treg的免疫平衡，进而在 HSP的发生和HSPN肾脏损害及预后中发挥作用，目前尚不清楚。因此本研究通过检测HSP及HSPN患儿外周血Th17、Treg细胞的比例和Th17/Treg比值的变化，调节性B细胞及其两个亚群(CD19+CD24hiCD38hiB细胞和CD19+CD24hiCD27+B细胞)在其中的比例变化及其与Th17、Treg和Th17/Treg的相关性分析，初步探索调节性B细胞对Th17/Treg免疫平衡的影响。　　目的：探讨调节性B细胞水平、功能异常可能通过影响Th17/Treg免疫平衡在HSP和HSPN的发生发展及转归中发挥作用。　　方法：选取确诊的HSP及HSPN患儿76例，根据肾脏累及情况分为以下几组：无肾脏累及组20例（Group A），单纯镜下血尿组12例（Group B），单纯少量蛋白尿组17例（Group C），血尿合并少量蛋白尿组15例（Group D），大量蛋白尿组12例（Group E）;HSP/HSPN缓解期患儿（皮疹、腹痛、关节痛、血尿、蛋白尿等症状消失）16例（Group F），健康对照者16例（Control）。采用流式细胞术检测外周血中CD19+CD24hiCD38hiB细胞、CD19+CD24hiCD27+B细胞，Th17细胞和Treg细胞的百分比，以及CD19+B细胞、CD19+CD24hiCD38hiB细胞和CD19+CD24hiCD27+B细胞IL-10的表达水平;同时对B10细胞及其两个亚群与Th17细胞、Treg细胞和Th17/Treg的比值进行相关性分析。　　结果：与Control组相比，Group A, B, C, D, E组中Th17细胞的比例明显升高（P<0.05）;Treg细胞的比例明显降低（P<0.05）;Th17/Treg的比值明显升高（P<0.05）;Group B, C, D, E中CD19+CD24hiCD38hiB细胞的比例和B10细胞、CD19+CD24hiCD38hiB、CD19+CD24hiCD27+B细胞分泌 IL-10的水平显著降低（ P<0.05）;Group D， E中CD19+CD24hiCD27+B细胞的比例显著降低（P<0.05）。与Group A相比， Group D, E中Th17细胞的比例、Th17/Treg的比值明显升高（P<0.05）;B10、CD19+CD24hiCD38hiB细胞的比例及分泌 IL-10的水平明显降低（P<0.05）;GroupE中Treg细胞、CD19+CD24hiCD27+B细胞及其IL-10的分泌水平显著降低（P<0.05）。Group F组中上述指标与 Control和Group A相比均无明显统计学差异（P>0.05）。B10、CD19+CD24hiCD38hiB和CD19+CD24hiCD27+B细胞与Th17细胞以及Th17/Treg的比值呈显著负相关（ P<0.05）， B10和 CD19+CD24hiCD38hiB细胞与CD4+CD25+Treg细胞呈显著正相关（P<0.05）。　　结论：B10细胞及其两个亚群水平及功能异常（分泌IL-10的能力降低）可能参与HSP/HSPN的Th17/Treg免疫失衡。　　第二部分：CD40/CD40L信号通路-调节性B细胞-Th17/Treg轴参与HSP和HSPN发生发展及转归。除了细胞免疫功能紊乱，大量研究表明HSP患儿体内也存在体液免疫功能紊乱，表现为血浆中IgA水平明显增高和血管壁IgA循环免疫复合物的沉积。而 CD40-CD40L，作为特异性免疫系统中重要的一对共刺激分子，其在诱导

关键词： 异基因造血干细胞移植   慢性移植物抗宿主病   Nrf2抗氧化通路   调节性B细胞   白介素-10  

摘要： 目的建造异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)术后小鼠慢性移植物抗宿主病(c GVHD)模型,检测c GVHD小鼠Nrf2抗氧化通路、氧化应激、调节性B细胞(Bregs)及相关免疫炎症反应的水平,在体内实验中初步探讨它们在c GVHD发病机制中的作用。方法以雄性BALB/c(H-2d)小鼠作为供鼠,雌性CB6F1(B6)(H-2b)小鼠作为受鼠,受鼠经过致死性全身照射(TBI)(9.0Gy)预处理后,4-6小时内经尾静脉注射供鼠骨髓细胞(8×106)及脾脏细胞(6-7×107)混悬液,建立Scl-c GVHD小鼠模型。本实验分组如下:(1)对照组;(2)致死性全身照射(TBI)组:雌性CB6F1小鼠只接受照射不移植;(3)同基因移植(syn BMT)组:雄性CB6F1小鼠作为移植供鼠(供受鼠同源);(4)异基因移植(allo BMT)组:雄性BALB/c小鼠作为供鼠(供受鼠非同源)。各组小鼠均于移植后27-33天处死。c GVHD临床评分和组织病理学分析共同作为评判c GVHD的标准。第一部分:活性氧(ROS)试剂检测小鼠外周血单个核细胞(PBMCs)的氧化活性水平;Western blot检测各组小鼠骨髓、肝脏中Nrf2抗氧化通路蛋白表达水平,实时定量RT-PCR检测检测各组小鼠骨髓、肝脏中Nrf2抗氧化通路m RNA水平。第二部分:小鼠外周血中Bregs(CD19+CD5+CD1d+B细胞)的比例采用流式细胞术进行检测;小鼠血浆中炎症抑制因子白介素-10(IL-10)和纤维生成相关因子-β1(TGF-β1)的水平采用ELISA进行检测。本实验数据中,所有计量资料行t检验,均采用均数±标准误表示;所有计数资料行卡方检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。结果成功构建Scl-c GVHD小鼠模型:小鼠c GVHD临床评分和组织病理学分析均提示allo BMT组小鼠发生c GVHD,而syn BMT组小鼠未见c GVHD发生;第一部分(1)活性氧检测结果显示allo BMT组(c GVHD)小鼠PMBCs中ROS水平较syn BMT组(non-c GVHD)小鼠显著升高(P<0.05);(2)Western blotting结果显示c GVHD小鼠肝脏及脾脏Nrf2,NQO1及HO-1蛋白表达水平均较non-c GVHD小鼠显著降低(P<0.05);(3)实时定量RT-PCR结果显示c GVHD小鼠肝脏及脾脏Nrf2,NQO1及HO-1m RNA水平水平均比较non-c GVHD小鼠显著降低(P<0.05);第二部分(1)流式细胞术结果显示c GVHD小鼠外周血中Bregs水平较non-c GVHD小鼠显著降低(P<0.05);(2)ELISA检测结果显示c GVHD小鼠血浆中IL-10水平较non-c GVHD小鼠显著下降(P<0.001);而TGF-β1水平无显著差异(P=0.264)。结论本研究首次报道了allo-HSCT后c GVHD小鼠体内Nrf2抗氧化信号通路下调,氧化应激水平增高。研究尚显示c GVHD小鼠外周血Bregs水平明显降低,且细胞因子IL-10水平(与Bregs免疫抑制活性有关)也显著降低。Nrf2抗氧化信号通路下调,可能参与c GVHD的发病机制;Bregs及其分泌IL-10水平的降低也可能介导c GVHD的发生发展,而其内在机制、两者之间的关联尚需进一步研究,为c GVHD的预防及治疗提供新靶点。

关键词： 糖尿病   免疫调节   BIP分泌   细胞生物学  

摘要： 目的：免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP)又称葡萄糖调节蛋白78，是热休克蛋白70家族的成员。BIP作为分子伴侣在细胞内发挥重要作用，但是分泌型BIP也可以在细胞外发挥重要作用。分泌型BIP可以诱导自身抗体，与炎性关节炎的进展相关;但是也有报道分泌型BIP亦可以诱导具有负性调节功能的DC和T细胞，以及在RA的动物模型中可以抑制疾病的进展，然而对其诱导免疫细胞的特点及其功能尚待研究阐明。B细胞一般被认为是促进免疫反应，因为B细胞可以分泌抗体和抗原提呈。但近年来，发现B细胞也具有调节功能，并且发现调节性B细胞亦可分为不同亚群，其通过不同的机制发挥调节作用。另外，许多微环境中分子和细胞因子被证明对调节性B细胞分化发育的起作用，如IL-21、IL-35、BUFF和LPS等也可以影响调节性B细胞分化发育。分泌型BIP在调节性B细胞分化发育中的作用值得研究。本论文旨在探究微环境中 BIP在调节性B细胞分化发育中的作用以及BIP处理的B细胞对NOD糖尿病鼠免疫功能的影响。　　方法：⑴通过ELISA检测自身免疫病人血清中BIP及细胞因子的表达;⑵通过荧光抗体单标记染色流式细胞术检测BIP诱导脾细胞表面分子的表达;⑶通过荧光抗体多标记染色流式细胞术检测BIP诱导脾细胞多重表面分子的表达，以及细胞内分子的表达;⑷ELISA检测BIP诱导脾细胞培养上清细胞因子的表达;⑸通过蛋白荧光偶联流式细胞术检测BIP与B细胞的结合;⑹通过磁珠分选B细胞和多色流式细胞术检测BIP诱导调节性B细胞的表型特征;⑺通过CFSE，7-ADD染色流式细胞术检测B细胞和T细胞的增殖;⑻通过NOD糖尿病鼠模型检测BIP处理的B细胞对NOD小鼠免疫功能的影响。　　结果：①与正常人的血清标本比较，在类风湿关节炎病人血清中BIP水平高于正常对照组，并且BIP表达和RF，IL-10表达呈正相关;②采用流式细胞术检测小鼠脾细胞表面分子的表达，结果显示BIP可以诱导脾细胞表达PD-L1和FasL，并诱导CD19的表达增强;③CD19, CD5荧光抗体双染流式细胞术检测结果表明，BIP可诱导CD19+CD5+双阳性细胞增加;④CD19，PD-L1或PD-L2荧光抗体双染流式细胞术分析结果表明，BIP可诱导CD19+PD-L1+双阳性细胞增加;⑤CD19，FasL荧光抗体双染流式细胞术分析结果表明，BIP可诱导CD19+FasL+双阳性细胞增加;⑥采用流式细胞术和ELISA检测小鼠脾细胞和CD19+细胞细胞因子的表达，结果表明BIP可以诱导CD19+IL-10+双阳性细胞增加和IL-10分泌;⑦采用荧光素标记BIP和流式细胞术检测了可溶性BIP与CD19+B细胞结果表明表明大部分的CD19+细胞可以与BIP结合;⑧多色流式细胞术检测结果表明，BIP可以诱导C57BL/6小鼠CD19+细胞中表型为CD19+CD5+PD-L1+，CD19+CD5+FasL+，CD19+CD5+IL-10+细胞扩增;⑨细胞功能检测结果表明 BIP诱导的CD19+细胞可以促进 T细胞的增殖，提示BIP诱导的B细胞在体外可以抑制T细胞的功能;⑩BIP诱导的调节性B细胞对NOD鼠胰岛炎进展影响不明显，但可以降低淋巴结中活化的CD8+T细胞的比例，其效应有待进一步研究。　　结论：⑴BIP可以诱导表型为CD19+CD5+PD-L1+，CD19+CD5+FasL+，CD19+CD5+ IL-10+细胞扩增,表明BIP可以诱导B1a来源的调节性B细胞;⑵BIP诱导的B细胞在体外可以抑制T细胞的增殖，表明BIP诱导的B细胞在体外可以抑制T细胞的功能;⑶BIP诱导的B细胞输注给NOD糖尿病鼠可以降低淋巴结中活化的CD8+T细胞的比例，表明BIP诱导的B细胞在体内有一定抑制免疫反应的作用;⑷通过与B细胞表面相关的受体结合，BIP可以诱导调节性B细胞。

关键词： 他汀   树突状细胞   实验性自身免疫性重症肌无力   体液免疫   滤泡辅助性T细胞   调节性B细胞   ROCK抑制剂   实验性自身免疫性重症肌无力   滤泡辅助性T细胞   生发中心   抗体  

摘要： 研究背景：重症肌无力(Myasthenia gravis, MG)是一种由抗体介导、T细胞依赖、补体参与的经典的器官特异性自身免疫性疾病,由于神经肌肉接头突触后膜上的乙酰胆碱受体损伤而导致神经肌肉接头处传递功能障碍。目前临床上针对重症肌无力的免疫治疗主要包括糖皮质激素和免疫抑制剂,因其缺乏特异性,且需要长期应用,副作用较大,因此促使我们探索新的治疗策略和方法。树突状细胞(dendritic cells, DC)是体内最重要的专职抗原提呈细胞,根据其成熟状态的不同,既可以诱导免疫反应,也可诱导免疫耐受。他汀类药物是临床常用的抗动脉粥样硬化药物,近来研究发现其作用机制除降低血脂外,更重要的是其抗炎及免疫调节作用。我们的前期研究发现,应用阿托伐他汀在体外修饰脾脏来源的树突状细胞,可诱导树突状细胞呈不成熟状态。给实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG)大鼠腹腔注射这些不成熟DC,可缓解EAMG的发展,减少抗体的产生。其机制主要是抑制了EAMG的细胞免疫反应,表现为抑制淋巴细胞增殖,上调调节性T细胞,使Th1/Th17细胞反应转化为Th2细胞反应。然而,他汀修饰的DC减少抗体产生的具体机制仍不明确,尤其是对体液免疫反应的影响及作用机制仍有待进一步研究。近来研究发现一群以CXCR5 (CXC chemokine receptor 5, CXC趋化因子受体5)、ICOS (inducible T-cell costimulator,诱导性协同刺激分子)、PD-1 (programmed death protein-1,程序性死亡受体1)、Bcl6 (B-cell lymphoma 6, B细胞淋巴瘤因子6)及IL-21为特征的新的细胞亚群,即滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cells, Tfh)。Tfh直接辅助B细胞产生抗体,在体液免疫反应过程中发挥重要作用,因此在很多自身免疫性疾病的研究中备受关注。另外,调节性B细胞(regulatory B cells, Breg)作为一群发挥负性调节作用的B细胞,其发现挑战了B细胞提呈抗原和分泌抗体的传统观点。因此,耐受性DC对EAMG大鼠的Tfh和Breg的影响也是本研究关注的重点。研究目的：探讨阿托伐他汀修饰的骨髓源性DC对EAMG体液免疫的调节及机制。研究方法：1. EAMG模型的建立及临床评分用大鼠来源的AChRα亚基97-116肽段(R97-116)免疫Lewis大鼠,第11天加强免疫一次,建立EAMG模型。采用双盲法隔天进行观察并评分,评分标准参考Lennon评分方法,结果以每个时间点的平均数表示。2.骨髓源性DC的诱导、培养与表型检测无菌条件下取免疫后20天的EAMG大鼠的胫骨和股骨,冲洗骨髓腔得到骨髓细胞悬液,去除红细胞后接种于培养瓶中。贴壁3天,去除悬浮细胞后继续培养。第8天加入药物处理,他汀组(AT-BMDC)加入阿托伐他汀(10 μM),对照组(0-BMDC)加入等体积的DMSO (dimethysulfoxide,二甲基亚砜)。48 h后收集悬浮细胞,经流式细胞仪检测表面CD80、CD86及MHCII分子的表达情况。3. EAMG大鼠的分组与治疗将15只大鼠随机分为3组(5只／组),在免疫后第5天及第16天各给予一次腹腔注射治疗。AT-BMDC组给予他汀处理的DC(1×106个／只),0-BMDC组给予未用他汀处理的DC(1×106个／只),EAMG组给予等体积的1640培养基。4. ELISA检测抗体数量及亲和力于免疫后第43天处死大鼠,取心脏血,离心取血清。用R97-116肽段包板,采用ELISA方法检测血清中抗R97-116抗体的数量,用硫氰酸盐洗脱法检测抗体的亲和力。5.免疫荧光法检测脾脏中的生发中心免疫后第43天处死大鼠,取新鲜脾脏,液氮速冻后-80℃冰箱冻存。OCT包埋后切片,用PNA (peanut agglutinin,花生凝集素)染色,PNA+细胞代表生发中心内的B细胞。6.流式细胞术检测淋巴结单个核细胞中的Tfh、IL-21+细胞及Breg取大鼠腹股沟淋巴结制备单细胞悬液,加入CD4、CXCR5、ICOS抗体检测Tfh细胞,加入CD19、IL-10抗体检测B10细胞,加入CD19、Foxp3抗体检测B-Foxp3 细胞。另外,用IL-21抗体检测IL-21+细胞。标记完成后经流式细胞仪检测。7.统计学分析应用SPSS17.0软件对资料进行统计分析,应用单因素方差分析(one-factor analysis of variance, ANOVA)或Kruskal-Wallis秩和检验进行组间比较,p<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1.阿托伐他汀

关键词： Bla细胞   自身免疫性胆管炎   调节紊乱   调节性B细胞   腹腔  

摘要： 原发性胆汁性胆管炎(PBC)是一种自身免疫性肝脏疾病,它的典型特征是肝脏有大量淋巴细胞浸润在胆管周围,并且血清中有高滴度的由自身反应性B细胞分泌的抗线粒体抗体AMAs。有很多因素参与到PBC的发病过程中,包括免疫失调、遗传的易感性以及环境因素等。已有的研究指出B细胞在PBC的发病过程中的作用十分复杂,根据情况不同,可能发挥致病性作用或者免疫调节性功能。但是其具体机制尚不清楚,仍然需要进一步研究和探索。B细胞是一类重要的免疫细胞,主要分为2个亚群,即B1细胞(包含B1a细胞和Blb细胞)和B2细胞。这两个B细胞亚群在前体细胞来源、发育途径、组织分布、表型及功能等方面存在差异。在自身免疫性疾病发生过程中,一般认为B细胞通过分泌抗体发挥致病性作用。但最近的研究发现B细胞除了包含发挥致病性功能的亚群,同时还具有免疫调节性功能的亚群。调节性B细胞(Breg细胞)发挥功能的机制主要包括产生IL-10和TGF-β、参与次级抗原递呈、与致病性T细胞相互作用以及诱导调节性T细胞(Treg细胞)的产生等。B1细胞是一个特殊的B细胞亚群,大量存在于腹腔及胸腔中,主要通过分泌天然抗体、作为抗原递呈细胞以及分泌细胞因子来发挥免疫保护作用。B1细胞来源的天然抗体在细菌和病毒感染过程中发挥重要的保护作用。Bla细胞是腹腔B1细胞中的主要亚群,Bla细胞经典的功能包括产生血清中静息状态的IgM、分泌肠道IgA以及发挥免疫调节功能等。B1a细胞是抗炎性细胞因子IL-10的主要来源,并且在接触性超敏反应模型以及病理条件下能够发挥免疫调节性功能。为了更好的阐明B细胞亚群在PBC发病进程中的作用,我们以p40-/-IL-2Rα-/-小鼠以及被广泛研究的dnTGF-βRII小鼠作为PBC的模型鼠展开研究。本论文主要探究了p40-/-IL-2Rα-/-小鼠中腹腔B1a细胞的紊乱与自身免疫性胆管炎的关系,同时利用dnTGF-βRⅡ小鼠腹腔B细胞的共转输实验对模型鼠中腹腔B细胞的免疫调节性功能进行验证。目前取得的结果如下：1.p40-/-IL-2R α-/-模型鼠腹腔徽环境改变影响腹腔B细胞数目并与肝脏炎症具有相关性为了探究p40-/-IL-2Rα-/-模型鼠肝脏损伤时腹腔微环境的变化,通过检测腹腔中各细胞亚群数量,我们发现模型鼠中腹腔总细胞数目显著增多,且增多的主要是T细胞,尤其是致病性的CD8+T细胞,而B细胞数目显著减少。进一步研究表明模型鼠腹腔CD4+和CD8+T细胞分泌Thl型炎性细胞因子IFN-γ的能力显著增强。通过检测腹腔灌洗液中炎性细胞因子的水平,我们发现促炎性细胞因子TNF和MCP-1水平显著升高,这可能是导致腹腔各细胞亚群改变的原因。通过相关性分析,发现模型鼠中腹腔总细胞数与肝脏单个核细胞数呈正相关,腹腔中B1a细胞占B细胞的比例与腹腔及肝脏单个核细胞数呈负相关,且腹腔中Bla细胞占B细胞的比例与腹腔及肝脏中致病性的CD8T细胞的比例呈负相关。2. p40-/-IL-2Rα-/-模型鼠腹腔Bla细胞数目减少且功能性分子改变通过对PBC模型鼠发病过程中腹腔B细胞的详细检测,我们发现相比于对照鼠,模型鼠腹腔B1a及B1b细胞的比例和数目显著降低,而且模型鼠腹腔Bla细胞的比例随着年龄增长逐渐降低。进一步的机制研究表明模型鼠腹腔Bla细胞增殖能力显著降低且凋亡水平显著升高。模型鼠腹腔B1a细胞数目显著减少的同时,与Bla细胞免疫调节性功能相关分子,包括IL-10, CTLA-4和GITR的表达水平都显著下降；与B1a细胞活化及免疫共刺激相关分子CD44和CD80的表达水平明显降低。通过对另一种PBC模型鼠,即dnTGF-βRII小鼠的表型检测,我们发现与p40-/-IL-2Ra-/-模型鼠类似, dnTGF-βRII小鼠腹腔B1a细胞比例下降,且表达IL-10、CTLA-4、CD44和CD80的水平同样显著低于同窝对照鼠。3. p40-/-IL-2Rα-/-模型鼠腹腔Bla细胞转录组学分析为了全面探究p40-/-IL-2Ra-/-模型鼠腹腔B1a细胞转录组变化及其内在机制,利用基因芯片技术并配合荧光定量PCR验证,我们发现与对照鼠相比,模型鼠腹腔Bla细胞有381个基因发生了显著变化(2倍以上差异),其中包含大量细胞因子及其受体相互作用相关、转录因子活化相关及细胞周期相关基因的变化。且多个与B细胞功能相关的基因都发生了显著改变,其中具有免疫抑制性基序(ITIM)的分子CD72 (Cd72)、CD22 (Cd22)等表达显著上升,与流式结果一致的Cd44、Ctla4等表达显著下降,以及IL-10的上游抑制分子AHR (Ahr)等表达显著上升。这些发现详细地展示了模型鼠与对照鼠腹腔Bla细胞存在的差异,揭示了B1a细胞异常在PBC发病过程中的重要作用机制,并提示了

关键词： 过敏性紫癜   调节性B细胞   Th2细胞   IL-10   IL-4  

摘要： 第一部分过敏性紫癜患儿外周血调节性B细胞、Th2细胞及其相关细胞因子变化的研究目的:运用流式细胞术检测过敏性紫癜患儿外周血调节性B细胞(Bregs)、Th2细胞的表达情况,采用Luminex多功能液相芯片法检测过敏性紫癜患儿血清中与调节性B细胞、Th2细胞相关细胞因子IL-10和IL-4的水平变化,以便探索调节性B细胞、Th2细胞及其相关细胞因子在过敏性紫癜发病中的作用机制。方法:收集资料完整的过敏性紫癜患儿血清共50例,其中男性患儿31例,女性患儿19例,单纯皮疹型8例,关节型23例,胃肠型12例,肾炎型16例,运用流式细胞术检测过敏性紫癜患儿和19例正常健康儿童外周血中调节性B细胞、Th2细胞的表达情况;应用Luminex多功能液相芯片(Millipore公司)技术检测IL-10以及Th2相关细胞因子在过敏性紫癜患儿血清中的变化情况;并分析它们之间及其与过敏性紫癜临床病理参数之间的相关性。结果:(1)过敏性紫癜患儿外周血CD19+IL-10+B细胞显著低于正常健康儿童,(P=0.0004);(2)过敏性紫癜患儿外周血CD4+IL-4+T细胞显著高于正常健康儿童,(P<0.0001);(3)50例过敏性紫癜患儿血清中IL-10水平明显低于正常健康儿童,(P<0.0001);但IL-10的水平变化在过敏性紫癜患儿皮疹有无、关节病变、胃肠道反应、肾脏病变、感染、过敏源、血小板高低、年龄以及性别等临床各参数间并无明显统计学差异(P>0.05);(4)过敏性紫癜患儿血清中IL-4水平明显高于正常健康儿童(P=0.047);同时,IL-4的水平变化在过敏性紫癜患儿的关节病变、性别等临床参数间亦有明显的差异(P=0.0279,P=0.0324)。结论:(1)过敏性紫癜患儿外周血调节性B细胞的表达显著低于正常健康儿童。(2)Th2细胞在过敏性紫癜患儿中高表达。(3)过敏性紫癜患儿血清中细胞因子IL-10的水平低于健康儿童,而细胞因子IL-4的水平则高于健康儿童。(4)过敏性紫癜患儿血清中调节性B细胞、Th2细胞分泌的相应细胞因子IL-10、IL-4的水平与外周血调节性B细胞、Th2细胞的水平相关。第二部分过敏性紫癜患儿外周血调节性B细胞与Th2细胞相互关系及其生物学意义目的:利用T细胞、B细胞共培养体系,运用流式细胞仪检测技术研究Bregs与Th2之间的相互作用,为寻找过敏性紫癜新的治疗靶点提供理论依据。方法:收集健康儿童及过敏性紫癜患儿的外周单个核细胞,应用磁珠分选的方法分别收集CD19+B细胞、CD4+T细胞,分别使用LPS、激发型CD3和CD28抗体进行活化,将活化的B细胞与活化的T细胞进行共育后,应用流式细胞仪检测技术检测Bregs、Th2细胞的表达情况,研究Bregs与Th2之间的相关关系。结果:(1)T细胞、B细胞共培养体系中,过敏性紫癜患儿的B细胞组中CD19+IL-10+B细胞的数量明显低于来自健康儿童的B细胞组(P<0.05)。(P<0.05)。(2)T细胞、B细胞共培养体系中,来自过敏性紫癜患儿的T细胞组中,CD4+IL-4+T细胞的数量明显高于来自健康儿童的T细胞组(P<0.05)。结论:过敏性紫癜患儿中CD19+IL-10+Bregs在共培养后的活化比率低于正常儿童,或许与其数量及分泌IL-10的功能受限有关,从而不能抑制Th2细胞的分化。

关键词： 系统性红斑狼疮   调节性B淋巴细胞   体液免疫  

摘要： 目的:检测CD1d^(high)CD5^+CD19^+调节性B淋巴细胞数量的变化,讨论其对免疫功能的影响及其与SLE活动性指数的关系。方法:以10例健康人群和10例SLE为研究对象,检测CD1d^(high)CD5^+CD19^+B细胞的含量。同时,检测各受试者的IgG和IgM水平。结果:正常对照组CD1d^(high)CD5^+CD19^+B细胞占B淋巴细胞百分比平均为0.20%±0.21%,SLE组CD1d^(high)CD5^+CD19^+B细胞为0.83%±0.28%,前者明显低于后者(P<0.01)。对照组和SLE患者的IgG含量分别为13.27±2.31和10.31±4.79,两者差异无统计学意义(P>0.05)。对照组和SLE患者的IgM含量分别为1.79±0.50和0.80±0.40,两者差异有统计学意义(P<0.05)。进行相关性分析,SLE组患者CD1d^(high)CD5^+CD19^+B细胞数与IgG水平呈负相关(r=-0.634 4,P<0.05),与IgM水平无相关性(r=-0.188 6,P>0.05),与活动性指数无相关性(r=0.242 3,P>0.05)。结论:SLE患者体内表达的CD1d^(high)CD5^+CD19^+B细胞显著高于正常对照组,且其细胞数与其IgG水平呈负相关,提示调节性B淋巴细胞在SLE病程过程中对机体的体液免疫调节可能起到一定作用。

关键词： 系统性红斑狼疮患者   调节性T细胞   B细胞表达   外周血单个核细胞   CD19^+   TGFβ   免疫系统异常   类风湿性关节炎  

摘要： 系统性红斑狼疮（SLE）的致病原因尚未完全阐明，可能与遗传、环境因素及免疫系统异常等相关。抗原提呈细胞、T细胞、B细胞、调节性T细胞、调节性B细胞的免疫细胞功能异常也与SLE的发病密切相关。调节性B细胞减少或功能障碍可能导致SLE、类风湿性关节炎及ANCA相关性血管炎等风湿性疾病。

关键词： 系统性红斑狼疮   调节性T细胞   CD45RA   Foxp3   白细胞介素17  

摘要： 目的:采用体外实验观察系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者分泌白细胞介素17(interleukin,IL-17)的调节性T细胞在促进B细胞的存活及抗体分泌中的作用。方法 :采用流式细胞仪分选20例活动期SLE患者及20名健康对照者外周血调节性T细胞的3个功能亚群和B细胞,并分组、分条件共培养,分时段进行细胞功能实验。结果:在活动期SLE患者中,CD45RA-Foxp3low CD25+非抑制性调节性T细胞亚群分泌IL-17明显增加,能够增强CD19+B细胞存活并促进其抗体产生;而加入抗IL-17抗体阻断后,该群细胞的正向促进功能减退(P<0.05)。结论 :SLE患者中增多的不具抑制功能的CD45RA-Foxp3low CD25+调节性T细胞,可能通过分泌大量的IL-17,促进B细胞的存活、增殖,并向浆细胞分化,分泌大量的自身抗体,参与疾病的发生、发展。