关键词： 髓系抑制性细胞   调节性B细胞   调控作用   免疫应答  

摘要： 髓系抑制性细胞(MDSC)是一群具有很强免疫抑制功能的细胞，在肿瘤和炎症等疾病的进展和转归过程中起着重要调节作用。但以往的研究主要集中于它们对T细胞和NK等细胞免疫应答的调控作用。它们对于B细胞的功能调控作用还不是十分清楚，尤其是对于调节性B细胞的分化调控作用目前尚未见报道。因此，本研究主要围绕MDSC对调节性B细胞的分化调控及相关的机制进行了探讨。　　第一部分:MDSC诱导高分泌IL-10的B细胞产生　　为了探讨MDSC能否诱导调节性B细胞的分化，我们将小鼠MDSC与不同刺激剂活化的B细胞（anti-IgM、可溶性CD40L、LPS）共培养，检测共培养后上清中IL-10的表达水平。结果发现，经LPS刺激后的B细胞与MDSC共培养后其上清中IL-10的分泌水平明显增高。接着我们通过胞内染色的方法分别检测了共培养前后B细胞及MDSC胞内IL-10表达水平的变化，结果发现共培养之后B细胞胞内IL-10的表达水平明显增高，而MDSC共培养前后IL-10的表达没有明显变化。随后我们将共培养体系中的MDSC与B细胞通过流式分选出来，分别提取其总RNA，利用qRT-PCR的方法检测其IL-10的表达，结果发现，共培养体系中的IL-10主要来源于B细胞。进一步的检测发现该群高分泌IL-10的B细胞表达独特表型即CD19hiFcγRⅡbhi。此外，我们通过流式分选出不同亚群的MDSC(粒系及单核系MDSC)，将其分别与LPS活化B细胞共培养，发现不论是粒系MDSC还是单核系MDSC均能诱导LPS活化B细胞高分泌IL-10。另外，我们分选出脾脏不同亚群的B细胞，经LPS活化后分别与MDSC共培养，结果发现，经MDSC诱导后，T1，T2，T3及MZB细胞均能够高分泌IL-10。在体内实验中，我们将CFSE标记的LPS活化B细胞，单独或与MDSC共同尾静脉注射小鼠，取小鼠脾脏，流式胞内染色法检测CFSE+B细胞分泌IL-10的情况，发现在与MDSC共注射的情况下，B细胞分泌IL-10的水平增强。以上结果说明:MDSC能够诱导高分泌IL-10的CD19hiFcγRⅡbhiB细胞产生。　　第二部分:MDSC的CD19hiFcγRⅡbhi调节性B细胞的功能及其机制研究　　为了研究MDSC诱导产生的高分泌IL-10的具有CD19hiFcγRⅡbhi表型的B细胞对T细胞是否具有调节功能，我们先通过流式将MDSC与B细胞共培养体系中CD19hiFcγRⅡbhi及CD19lowFcγRⅡblowB细胞分选出来，分别与带有CFSE标记且经抗CD3/CD28活化的CD4+T细胞共培养，3天以后检测T细胞增殖情况。结果发现CD19hiFcγRⅡbhiB细胞能够明显抑制活化的CD4+T细胞增殖，且在共培养体系中加入IL-10的中和性抗体后，CD4+T细胞可恢复增殖，这一结果提示CD19hiFcγRⅡbhiB细胞可以通过其分泌的IL-10抑制活化T细胞增殖。另外，我们检测了CD19hiFcγRⅡbhiB细胞和CD19lowFcγRⅡblowB细胞对活化CD4+T细胞表面CD69分子表达的影响，结果发现CD19hiFcγRⅡbhiB和CD19lowFcγRⅡblowB细胞对CD69的表达均没有明显影响，以上结果提示CD19hiFcγRⅡbhiB细胞并非通过抑制T细胞活化，而是通过抑制已活化T细胞的增殖发挥调节作用。此外，我们还检测了CD19hiFcγRⅡbhiB细胞和CD19lowFcγRⅡblowB细胞对活化CD4+T细胞分泌IL-4及IFN-γ的影响，结果发现（数据未显示），CD19hiFcγRⅡbhiB和CD19lowFCγRⅡblowB细胞不能影响CD4+T细胞向Th1及Th2方向的分化。　　在对机制的研究上，首先我们利用transwell系统将MDSC与B细胞隔离，共培养48h后检测上清中IL-10的分泌情况，结果发现，MDSC诱导B细胞产生IL-10。此外，将MDSC培养上清与LPS活化B细胞共培养后，与单独的LPS活化B细胞相比，IL-10的水平也没有明显变化。我们探索了MDSC上哪些膜分子参与诱导了调节性B细胞高分泌IL-10。已有研究表明:CD40L-CD40通路在调节性B细胞的分化中起到着重要作用。通过流式检测我们发现， MDSC表面表达CD40L分子，B细胞表面表达CD40分子，且B细胞经LPS活化后其表面CD40的表达量增加，另外，在B细胞中加入可溶性CD40L可使其上清中IL-10的表达水平增高。下一步我们将用CD40-/-小鼠的B细胞与CD40L-/-小鼠的MDSC共培养，检测上清及胞内IL-10的分泌情况，从而明确CD40L-CD40通路在MDSC诱导高分泌IL-10调节性B细胞产生过程中的作用。　　总之，本研究发现粒系和单核系MDSC均能够促

关键词： 乳腺浸润癌   Bregs   Tregs   PD-L1  

摘要： 第一部分乳腺浸润癌中CD19+调节性B细胞的确定及其生物学意义目的:研究乳腺肿瘤组织中Bregs表达情况及其与乳腺浸润性癌的相关性和临床意义。方法:本研究利用免疫组化技术分析CD19、IL-10在134例乳腺浸润性癌组织中的表达情况,免疫荧光技术研究两者之间的相互关系以及流式细胞检测技术研究乳腺肿瘤组织中CD19+IL-10+B细胞表达并与CD24、CD38之间的相互关系。结果:(1):乳腺浸润性癌中IL-10主要定位于肿瘤周围浸润的淋巴细胞的细胞浆,表达与肿瘤分化程度相关,即低分化肿瘤组织高表达IL-10分子(P=0.048),IL-10的阳性表达在ER-、PR-、HER2+组中表达增高,相对于ER+、PR+以及HER2-组差异具有统计学意义(P=0.02,P=0.049,P=0.049)。(2):乳腺肿瘤周围浸润CD19+B细胞与IL-10存在共表达(P=0.001),部分CD19+细胞胞浆内可见IL-10颗粒,表明乳腺癌肿瘤周围浸润CD19+B细胞可能具有分泌IL-10能力。(3):乳腺浸润性癌外周血CD19+IL-10+的比例比纤维瘤中增高(P=0.046),且高表达CD24、CD38分子,同时CD19+CD24+CD38+中B细胞IL-10+B细胞表达比非CD19+CD24+CD38+B增高。(4):乳腺浸润性癌组织中CD19+B、CD19+CD24+CD38+Bregs细胞的表达相较纤维瘤中增高。结论:本研究证实在乳腺浸润性癌病人外周血及其肿瘤组织中CD19+IL-10+的B细胞的比例较高,且其表面标志为CD24、CD38。为深入研究B细胞亚群与乳腺浸润癌细胞之间的相关性,以及与肿瘤免疫的相关性奠定基础。第二部分CD19+CD24+CD38+调节性B细胞与调节性T细胞的相互关系及其生物学意义目的:检测Bregs、Tregs在乳腺肿瘤患者中的表达情况,探讨两者之间的相互关系及其生物学意义。方法:利用流式细胞技术检测健康人、纤维瘤以及乳腺浸润性癌中Bregs、Tregs表达情况,与临床病理参数之间的关系及其两者之间的相互关系。结果:(1):乳腺浸润性癌病人外周血中CD19+B不仅能够提高乳腺浸润性癌病人T细胞中Tregs的比例,同样促进健康人的CD4+T细胞向Tregs分化。(2):乳腺浸润性癌外周血的中Bregs的比例增高,与健康人(P<0.001)和纤维瘤(P<0.001)相比具有显著差异,CD19+B细胞在肿瘤直径小于3cm组中表达增高,与直径大于3cm组差异具有统计学意义(P=0.019),而与其他临床病理参数均无统计学意义。(3):乳腺浸润性癌外周血中Tregs的比例表达增高,与健康人(P<0.001)、纤维瘤(P<0.001)相比,存在显著统计学意义。同时CD4+T细胞在年龄小于49岁组中表达增高,与年龄大于49岁组相比,差异具有统计学意义(P=0.047),而与其他临床病理参数均无统计学意义。(4):乳腺浸润性癌外周血中,B细胞与T细胞之间的相互关系(P≤0.001,r=0.397),同时Bregs与Tregs之间表达也存在显著正相关性(P=0.001,r=0.361)结论:乳腺浸润性癌患者外周血表达高水平的Bregs、Tregs且存在正相关性,肿瘤细胞如何通过Bregs、Tregs发挥免疫逃避的机制仍需进一步研究。第三部分PD-L1分子对CD19+CD24+CD38+调节性B细胞的调节以及生物学意义目的:通过对乳腺癌细胞株表面所表达PD-L1分子来研究肿瘤细胞对Bregs的作用以及功能的影响,为针对肿瘤细胞表达的PD-L1分子治疗新的策略提供新的依据。方法:将活化刺激的CD19+B细胞、分别与MCF-7,MDA-MB-231乳腺癌细胞株共育培养,流式细胞仪检测Bregs的表达,再与CD4+T细胞共育培养检测Tregs的表达。Si RNA下调MDA-MB-231细胞上PD-L1,与CD19+B,CD4+T细胞共育培养,流式细胞仪检测Bregs,Tregs的表达情况结果:(1):肿瘤细胞株表面所表达的PD-L1分子可诱导CD19+Bregs的扩增,进而促进CD4+的T细胞分化为Tregs。(2):Si RNA干扰下调PD-L1分子的表达后,Bregs及Tregs的数量也随之下降。结论:肿瘤细胞所表达PD-L1可诱导CD19+B细胞向Bregs分化,进而抑制机体的免疫应答,从而逃避宿主免疫攻击;这也为针对PD-L1分子的肿瘤免疫治疗提供依据。

关键词： 弥漫大B细胞淋巴瘤   调节性B细胞   白介素-10   利妥昔单抗  

摘要： 目的:本研究的目的是检测初治DLBCL患者接受利妥昔单抗联合化疗前后调节性B细胞比例及IL-10的分泌水平。研究DLBCL患者与健康对照组调节性B细胞比例、IL-10水平差异;DLBCL不同临床分期调节性B细胞比例、IL-10水平差异,利妥昔单抗联合化疗对Breg、IL-10的影响,探讨Breg在DLBCL发病机制中的作用和意义,及其作为判断疗效及预后指标的意义。方法:收集2013年12月-2016年1月在兰州大学第二医院血液科住院部确诊的初治DLBCL的患者20例,患者均应用利妥昔单抗(375mg/m2)联合化疗(经典R-CHOP方案)进行化疗。15例健康对照组。应用流式细胞术分别检测DLBCL患者化疗前、经1周期含利妥昔单抗联合化疗后和健康对照组Breg的比例(即CD19+CD24hiCD38hiB细胞占CD19+B淋巴细胞的比例);应用酶联免疫吸附法检测IL-10分泌水平变化。结果:***组化疗前Breg的比例明显高于正常健康对照组(2.88±0.58vs 0.98±0.42)%,差异有统计学意义(P<0.01);DLBCL组化疗后Breg的比例较化疗前(0.66±0.43 vs 2.88±0.58)%明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);DLBCL组化疗后与健康对照组(0.66±0.43 vs 0.98±0.42)%无统计学差异(P>0.05)。在不同分期阶段,DLBCL组临床晚期Breg的比例高于临床早期(3.38±0.45 vs 2.47±0.26)%,差异有统计学意义(P<0.01)。***组化疗前IL-10的分泌水平明显高于健康对照组(9.81±2.07 vs 4.99±1.36),差异有统计学意义(P<0.01);DLBCL组化疗后IL-10的分泌水平(3.94±0.87 vs9.81±2.07)较化疗前明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);DLBCL组化疗后与健康对照组(3.94±0.87 vs 4.99±1.36)无统计学差异(P>0.05)。在不同分期阶段,DLBCL组临床晚期IL-10的分泌水平明显高于临床早期(11.56±1.13 vs2.47±0.26),差异有统计学意义(P<0.01)。***组化疗前后,Breg比例和I L-10分泌水平均呈正相关,差异有统计学意义(P<0.01);DLBCL组临床早期,Breg比例和I L-10分泌水平差异无统计学意义(P>0.05),两者无相关性;DLBCL组临床晚期,Breg比例和I L-10分泌水平均呈正相关,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:***患者存在Breg比例和IL-10分泌水平的变化,与健康对照组相比,Breg比例升高,IL-10分泌水平增加,提示Breg、IL-10参与DLBCL发病、发展过程;2.利妥昔单抗治疗可下调DLBCL患者外周血Breg的表达,抑制IL-10产生,两者呈正相关;***患者经利妥昔单抗治疗后,外周血Breg细胞的比例较治疗前减低,IL-10水平较治疗前降低,两者呈正相关。

关键词： 肺癌   调节性B细胞   表型分子   免疫抑制   肿瘤逃逸  

摘要： 目的:分析肺癌病人外周血中CD19+CD20-B细胞表型特点,为其免疫抑制功能提供理论依据。通过肺癌细胞上清诱导B细胞,检测对T细胞增殖的抑制效应,验证肺癌中抑制性B细胞的存在。内容和方法:收集26例肺癌初治患者及11例健康人外周血,所有患者均经术后病理证实为肺癌。用流式细胞术检测肺癌患者和健康人外周血中CD19+B细胞及其亚群CD19+CD20-B细胞比例,并比较患者和健康人之间的差异。分析26例肺癌患者外周血B细胞中CD19+CD20-B细胞的比例,结合临床病理资料分析CD19+CD20-B细胞比例和淋巴结转移、远处转移及肺癌分期等临床指标的关系。通过多色流式分析的方法检测肺癌患者外周血CD19+B细胞中CD19+CD20-及CD19+CD20+B细胞亚群的表型分子特点,分析抑制性分子PD-1、CTLA-4和Tim-1在两群细胞上的不同表达水平。分析两者之间CD62L、CCR6、CD27、C24以及CD38表达的差异;收集肺癌组织及癌旁组织标本,检测并比较癌和癌旁组织浸润淋巴细胞的密度。将分选的外周血B细胞分别在加入刺激因子TNF家族B细胞活化因子（B cell-activating factor belonging to the TNF family,BAFF）的培养液及加入肿瘤细胞系NCI-H1299、NCI-520培养上清的培养液中进行培养,比较三种方案培养后B细胞表型分子的变化,同时比较不同上清刺激后的B细胞对CD4+及CD8+T细胞增殖抑制程度的差异。结果:流式分析结果显示,与健康人相比,肺癌患者外周血中CD19+B细胞比例显著下降（p=0.0013）。CD19+CD20-B细胞在肺癌患者比例高于健康人（p=0.0379）。进一步将肺癌患者分成转移组（包括淋巴结转移和远处转移）和非转移组,发现转移组CD19+CD20-B细胞显著高于非转移组（p=0.0341）,但是未能发现CD19+CD20-B细胞比例与肺癌患者的其他临床病理特征（性别、年龄、肿瘤大小、临床分期等）有关。多色流式分析结果显示在人外周血CD19+B细胞亚群中,与CD19+CD20+B细胞相比,CD19+CD20-B细胞中高表达抑制性分子PD-1（p<0.0001）、CTLA-4（p<0.0001）和Tim-1（p<0.0001）,说明CD19+D20-B细胞代表一群具有免疫抑制作用的B细胞亚群;同时低表达CD62L,说明CD19+CD20-B细胞无法到达脾脏、淋巴结等次级淋巴器官,接受抗原刺激而发育成为成熟的浆细胞;而低表达CCR6则说明其不能有效地启动体液免疫应答。CD19+CD20-B细胞较CD19+CD20+B细胞高表达CD38（p<0.0001）,高表达CD27（p<0.0001）,低表达CD24（p<0.0001）,说明肺癌中CD19+CD20-B细胞与免疫相关性疾病中调节性B细胞（regulatory B cell,Breg）有所差异。与癌旁组织相比,癌组织浸润较多的CD19+B细胞（p=0.0070）和CD19+CD20-B细胞（p=0.0120）。功能实验显示,与BAFF刺激组相比,肺癌细胞系NCI-H1299上清刺激后的B细胞可以诱导产生一群表型为CD19+CD20-B细胞,而NCI-H520肺癌细胞上清刺激组则未诱导产生该群细胞。将三组B细胞分别与CD3+T细胞进行共培养,检测CD3+T细胞中CD4+及CD8+T细胞的增殖情况,体外实验结果显示,NCI-H1299上清培养后的B细胞对CD4+及CD8+T细胞增殖均具有明显的抑制效应。结论:肺癌病人外周血CD19+CD20-B在肺癌转移患者高于未转移患者;表型分子分析结果显示这群B细胞高表达抑制性分子;但是存在归巢障碍,可能不能到达刺激淋巴器官,有效启动体液免疫应答。体外实验显示肺癌细胞系NCI-H1299上清可以体外诱导产生抑制性B细胞;诱导产生的抑制性B细胞对T细胞增殖具有抑制作用。

关键词： B细胞   调节性B细胞   白细胞介素-10   Rbm47   转录后调节   AU富集序列   调节性T细胞   溃疡性结肠炎  

摘要： 研究背景B细胞是免疫系统的重要组成部分,其主要功能为产生抗体、介导体液免疫应答,同时还具备提呈抗原、分泌细胞因子的功能。长期以来,基于对B细胞经典作用的认识,人们一方面将其视为机体抵抗病原入侵并保持稳态的主要的免疫效应细胞,另一方面又将其异常活化视为多种免疫相关疾病(特别是自身免疫病)的关键致病因素。然而,在过去的二十多年中,人们逐渐发现一部分B细胞具有免疫负调控作用且对维持机体免疫平衡具有重要意义,根据其功能特征人们将这部分细胞称之为调节性B细胞(Breg, regulatory B cells)。虽然大量的工作都已经证实了Breg的存在,但人们对其表面标志物和表型的界定并未达成一致观点。在Breg具体的研究工作中,白细胞介素-10(IL-10,interleukin-10)的表达水平常被作为公认指标以对Breg进行分析甚至分离。而在目前已发现的Breg的几种功能相关分子中,IL-10是Breg发挥调节功能的关键分子,对其研究也最为广泛深入。一方面,体内外的实验均表明IL-10缺失的Breg无法正常行使调节功能；另一方面,多项研究表明B细胞特异性的IL-10缺失会引发多种免疫相关疾病并与多种病理损伤相关。由于IL-10的表达与Breg的调节功能的紧密相关,研究B细胞中IL-10产生机制的对于深入认识Breg具有重要的科学意义。IL-10是免疫系统中经典的抑炎因子,是调节机体免疫平衡的重要组分。IL-10可介导包括抑制天然免疫细胞的成熟与活化,抑制炎性细胞因子的分泌,诱导Treg分化等在内的多种免疫效应,同时IL-10信号的缺失会导致多种免疫相关疾病的发生。外源性输入的IL-10蛋白在体内的代谢周期很短,限制了其作为药物的临床应用,而利用内源性的IL-10则能较好地解决这一问题。内源性的IL-10可以来源于多种细胞,但近年来的多项研究表明B细胞是多种生理和病理状态下IL-10的主要来源,而通过过继回输IL-10分泌的Breg细胞可以缓解和治疗多种免疫相关疾病。因此对B细胞中IL-10产生机制的研究具有重要的应用价值。IL-10的表达调控主要发生在转录水平和转录后水平。长期以来,对Breg特异性转录因子的探索一直没有停止但始终没有结果,而已经报道的能够在B细胞中调控IL-10转录的几种转录因子,如NF-kB,Bc16和Blimp1等对B细胞多种其他生物学功能亦有影响,因此目前并没有在B细胞中找到特异性调节IL-10表达的转录因子。对IL-10转录后调控水平的研究表明,IL-10的mRNA的3’非翻译区(3'UTR,3'-untranslated region)具有多个腺嘌呤和尿嘧啶富集序列(ARE, AU-rich element),当RNA结合蛋白或microRNA与之结合后会对IL-10 mRNA的稳定性产生显著影响。因此,IL-10的最终蛋白表达水平会显著地受到转录后调控的影响,但目前对B细胞中IL-10表达的转录后调控研究仍少有报道。我们应用IL-10抗体标记磁珠分选了IL-10表达阳性和IL-10表达阴性的B细胞并通过基因芯片分析寻找IL-10表达相关的转录后调控因子。RBM47是我们筛选到的差异基因之一,其表达产物为一个具有3个RNA识别基序(RNA recognition motif)结构的RNA结合蛋白。已有的研究表明Rbm47可通过转录后调控的方式影响mRNA分子的存在状态并最终影响多种生物学进程,但其对免疫系统的影响并未见报道。通过基因改造和免疫治疗相结合,T细胞、DC细胞、NK细胞及间充质干细胞都已在临床上用于疾病的治疗。Breg由于其独特的免疫抑制功能也引起了人们将其应用于临床治疗的关注,而一些研究也探索了通过基因改造提高Breg免疫抑制效果的可行性,并得到了肯定的结论。由于IL-10是B细胞行使调节功能的关键分子,而IL-10的蛋白和mRNA都具有不稳定性,因此我们假设通过找到并调控IL-10表达相关的转录后调控因子可以促进B细胞的调节性功能,并针对Rbm47这一分子进行了验证。研究目标检测IL-10+B细胞中Rbm47的表达情况；探讨Rbm47对B细胞IL-10产生及免疫抑制作用的影响及潜在机制；加深对Breg免疫调控作用形成机制的认识并为推进其临床应用转化提供理论依据。方法与结果1. 应用IL-10抗体标记的磁珠,我们分选了IL-10分泌阳性和IL-10分泌阴性的B细胞,并应用表达谱芯片技术分析差异表达的转录后调控相关蛋白,RBM47在IL-10分泌阳性的B细胞中表达显著升高。2. 通过应用LPS体外诱导IL-10和及应用IL-10-GFP报告基因小鼠分选IL-10分泌阳性和IL-10分泌阴性细胞,我们对基因芯片的结果进行了验证。结果表明,B细胞中的Rbm47在IL-10诱导过程中表达升高,且特异性

关键词： 急性呼吸窘迫综合征   急性肺损伤   调节性T细胞   高迁移率族蛋白B1   Toll样受体4  

摘要： 目的:探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)通过Toll样受体4(TLR4)介导小鼠急性肺损伤时CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)免疫功能及免疫抑制活性的变化;研究CD4+CD25+Treg与CD4+CD25-T细胞相互作用的影响。方法:分别给健康清洁级C57BL/10J和C57BL/10Sc[分别为TLR4野生型(TLR4+/+)和敲除型(TLR4-/-)]小鼠气管内注射HMGB1(20μg/只)为实验组,同时设立气管内注射生理盐水野生型小鼠为对照组;(1)于造模后饲养48小时眼球取血法法处死小鼠收集血清及肺泡灌洗液(BALF),光镜下观察肺脏病理改变,称重测定肺脏干湿比;采用免疫磁珠分离脾脏CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-T细胞。(2)将各组部分CD4+CD25+Treg体外培养24小时后,采用流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg表达叉头翼状螺旋转录因子(FOXP3)和淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的表达强度,并且用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测BALF中白细胞介素-1(IL-1),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及CD4+CD25+Treg分泌的白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-β(TGF-β)的含量。(3)将各组CD4+CD25+Treg与对照组CD4+CD25-T细胞按1:1比例共培养,包被CD3单抗和可溶性CD28单抗辅助活化;CCK-8法检测CD4+CD25+Treg对CD4+CD25-T细胞增殖的抑制作用。并采用ELISA法检测共培养体系中分泌的白细胞介素-4(IL-4)、IL-2和干扰素-γ(IFN-γ)的含量。结果:1、与对照组相比,两实验组小鼠气管内注射HMGB1后,肺组织损伤程度明显严重,肺脏干湿比值及BALF灌洗液中TNF-α,IL-1含量显著增高,且TLR4野生型小鼠较TLR4敲除型小鼠病变程度更加严重;2、流式细胞学检测免疫磁珠分选的CD4+CD25+Treg纯度在90%以上;TLR4野生型急性肺损伤小鼠FOXP3和CTLA-4表达强度低于对照组和TLR4敲除型(P<0.05);野生型实验组小鼠Treg分泌的IL-10及TGF-β含量较对照组含量降低(P<0.05),而TLR4敲除型较对照组IL-10及TGF-β含量升高(P<0.05);3、经CD3和CD28辅助活化后,TLR4野生型急性肺损伤小鼠CD4+CD25+Treg与效应T细胞共培养上清中,IL-2,IFN-γ含量高于对照组(P<0.05),IL-4含量低于对照组(P<0.05),提示CD4+CD25+Treg可使T细胞极化Th2细胞能力减弱,向Th1细胞方向极化;而TLR4敲除型急性肺损伤小鼠CD4+CD25+Treg与效应T细胞共培养上清中,IL-2,IFN-γ含量低于对照组(P<0.05),IL-4含量高于对照组(P<0.05),CD4+CD25+Treg介导的免疫抑制效应促使T细胞极化为Th2细胞,引起Th1/Th2的漂移。结论:1、气管内注射HMGB1可以诱导小鼠急性肺损伤模型;2、免疫磁珠分选的CD4+CD25+Treg细胞纯度较高,可以满足后续实验的要求;3、在急性肺损伤时HMGB1可通过TLR4下调CD4+CD25+Treg的免疫功能,使CD4+CD25+Treg中Foxp3和CTLA-4分子的表达下调,从而减弱其免疫抑制功能的发挥;4、在急性肺损伤时HMGB1可通过TLR4使CD4+CD25+Treg极化Th2细胞能力减弱,向Th1细胞方向极化,弱化了CD4+CD25+Treg的功能,影响炎症反应的结局;为ARDS开辟新的治疗靶点。

关键词： 过敏性紫癜   调节性B细胞   免疫平衡   细胞病理学  

摘要： 本文对CD40/CD40L信号通路调控调节性B细胞在HSP和HSPN中的作用机制进行了研究。本研究分为两个部分：　　第一部分：调节性B细胞对HSP和HSPN患儿Th17/Treg免疫平衡的影响。过敏性紫癜（HSP）是儿童时期最常见的自身免疫性血管炎，并发肾脏损害时称为紫癜性肾炎（HSPN）。大量研究显示CD4+T细胞亚群（Th1，Th2，Th17和Treg）功能紊乱参与儿童HSP的发生发展，包括 Th1/Th2的免疫失衡和 Th17/Treg的免疫失衡。同时，有研究指出Th17/Treg的免疫失衡与HSPN肾脏损害的严重程度密切相关。而目前尚无研究中心就不同肾脏累及程度的 HSPN患儿进行分组详细讨论Th17、Treg细胞比例及 Th17/Treg比值在其中的具体变化。调节性 B细胞作为一群能通过分泌IL-10调控CD4+T细胞免疫反应的负向调节性免疫细胞，参与影响Th17/Treg的免疫平衡，在多种自身免疫性疾病中得到了普遍研究，如系统性红斑狼疮（SLE），风湿性关节炎（RA），炎症性肠病（IBD）等，但是其在儿童 HSP及 HSPN中是否能影响Th17/Treg的免疫平衡，进而在 HSP的发生和HSPN肾脏损害及预后中发挥作用，目前尚不清楚。因此本研究通过检测HSP及HSPN患儿外周血Th17、Treg细胞的比例和Th17/Treg比值的变化，调节性B细胞及其两个亚群(CD19+CD24hiCD38hiB细胞和CD19+CD24hiCD27+B细胞)在其中的比例变化及其与Th17、Treg和Th17/Treg的相关性分析，初步探索调节性B细胞对Th17/Treg免疫平衡的影响。　　目的：探讨调节性B细胞水平、功能异常可能通过影响Th17/Treg免疫平衡在HSP和HSPN的发生发展及转归中发挥作用。　　方法：选取确诊的HSP及HSPN患儿76例，根据肾脏累及情况分为以下几组：无肾脏累及组20例（Group A），单纯镜下血尿组12例（Group B），单纯少量蛋白尿组17例（Group C），血尿合并少量蛋白尿组15例（Group D），大量蛋白尿组12例（Group E）;HSP/HSPN缓解期患儿（皮疹、腹痛、关节痛、血尿、蛋白尿等症状消失）16例（Group F），健康对照者16例（Control）。采用流式细胞术检测外周血中CD19+CD24hiCD38hiB细胞、CD19+CD24hiCD27+B细胞，Th17细胞和Treg细胞的百分比，以及CD19+B细胞、CD19+CD24hiCD38hiB细胞和CD19+CD24hiCD27+B细胞IL-10的表达水平;同时对B10细胞及其两个亚群与Th17细胞、Treg细胞和Th17/Treg的比值进行相关性分析。　　结果：与Control组相比，Group A, B, C, D, E组中Th17细胞的比例明显升高（P<0.05）;Treg细胞的比例明显降低（P<0.05）;Th17/Treg的比值明显升高（P<0.05）;Group B, C, D, E中CD19+CD24hiCD38hiB细胞的比例和B10细胞、CD19+CD24hiCD38hiB、CD19+CD24hiCD27+B细胞分泌 IL-10的水平显著降低（ P<0.05）;Group D， E中CD19+CD24hiCD27+B细胞的比例显著降低（P<0.05）。与Group A相比， Group D, E中Th17细胞的比例、Th17/Treg的比值明显升高（P<0.05）;B10、CD19+CD24hiCD38hiB细胞的比例及分泌 IL-10的水平明显降低（P<0.05）;GroupE中Treg细胞、CD19+CD24hiCD27+B细胞及其IL-10的分泌水平显著降低（P<0.05）。Group F组中上述指标与 Control和Group A相比均无明显统计学差异（P>0.05）。B10、CD19+CD24hiCD38hiB和CD19+CD24hiCD27+B细胞与Th17细胞以及Th17/Treg的比值呈显著负相关（ P<0.05）， B10和 CD19+CD24hiCD38hiB细胞与CD4+CD25+Treg细胞呈显著正相关（P<0.05）。　　结论：B10细胞及其两个亚群水平及功能异常（分泌IL-10的能力降低）可能参与HSP/HSPN的Th17/Treg免疫失衡。　　第二部分：CD40/CD40L信号通路-调节性B细胞-Th17/Treg轴参与HSP和HSPN发生发展及转归。除了细胞免疫功能紊乱，大量研究表明HSP患儿体内也存在体液免疫功能紊乱，表现为血浆中IgA水平明显增高和血管壁IgA循环免疫复合物的沉积。而 CD40-CD40L，作为特异性免疫系统中重要的一对共刺激分子，其在诱导

关键词： 异基因造血干细胞移植   慢性移植物抗宿主病   Nrf2抗氧化通路   调节性B细胞   白介素-10  

摘要： 目的建造异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)术后小鼠慢性移植物抗宿主病(c GVHD)模型,检测c GVHD小鼠Nrf2抗氧化通路、氧化应激、调节性B细胞(Bregs)及相关免疫炎症反应的水平,在体内实验中初步探讨它们在c GVHD发病机制中的作用。方法以雄性BALB/c(H-2d)小鼠作为供鼠,雌性CB6F1(B6)(H-2b)小鼠作为受鼠,受鼠经过致死性全身照射(TBI)(9.0Gy)预处理后,4-6小时内经尾静脉注射供鼠骨髓细胞(8×106)及脾脏细胞(6-7×107)混悬液,建立Scl-c GVHD小鼠模型。本实验分组如下:(1)对照组;(2)致死性全身照射(TBI)组:雌性CB6F1小鼠只接受照射不移植;(3)同基因移植(syn BMT)组:雄性CB6F1小鼠作为移植供鼠(供受鼠同源);(4)异基因移植(allo BMT)组:雄性BALB/c小鼠作为供鼠(供受鼠非同源)。各组小鼠均于移植后27-33天处死。c GVHD临床评分和组织病理学分析共同作为评判c GVHD的标准。第一部分:活性氧(ROS)试剂检测小鼠外周血单个核细胞(PBMCs)的氧化活性水平;Western blot检测各组小鼠骨髓、肝脏中Nrf2抗氧化通路蛋白表达水平,实时定量RT-PCR检测检测各组小鼠骨髓、肝脏中Nrf2抗氧化通路m RNA水平。第二部分:小鼠外周血中Bregs(CD19+CD5+CD1d+B细胞)的比例采用流式细胞术进行检测;小鼠血浆中炎症抑制因子白介素-10(IL-10)和纤维生成相关因子-β1(TGF-β1)的水平采用ELISA进行检测。本实验数据中,所有计量资料行t检验,均采用均数±标准误表示;所有计数资料行卡方检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。结果成功构建Scl-c GVHD小鼠模型:小鼠c GVHD临床评分和组织病理学分析均提示allo BMT组小鼠发生c GVHD,而syn BMT组小鼠未见c GVHD发生;第一部分(1)活性氧检测结果显示allo BMT组(c GVHD)小鼠PMBCs中ROS水平较syn BMT组(non-c GVHD)小鼠显著升高(P<0.05);(2)Western blotting结果显示c GVHD小鼠肝脏及脾脏Nrf2,NQO1及HO-1蛋白表达水平均较non-c GVHD小鼠显著降低(P<0.05);(3)实时定量RT-PCR结果显示c GVHD小鼠肝脏及脾脏Nrf2,NQO1及HO-1m RNA水平水平均比较non-c GVHD小鼠显著降低(P<0.05);第二部分(1)流式细胞术结果显示c GVHD小鼠外周血中Bregs水平较non-c GVHD小鼠显著降低(P<0.05);(2)ELISA检测结果显示c GVHD小鼠血浆中IL-10水平较non-c GVHD小鼠显著下降(P<0.001);而TGF-β1水平无显著差异(P=0.264)。结论本研究首次报道了allo-HSCT后c GVHD小鼠体内Nrf2抗氧化信号通路下调,氧化应激水平增高。研究尚显示c GVHD小鼠外周血Bregs水平明显降低,且细胞因子IL-10水平(与Bregs免疫抑制活性有关)也显著降低。Nrf2抗氧化信号通路下调,可能参与c GVHD的发病机制;Bregs及其分泌IL-10水平的降低也可能介导c GVHD的发生发展,而其内在机制、两者之间的关联尚需进一步研究,为c GVHD的预防及治疗提供新靶点。

关键词： 糖尿病   免疫调节   BIP分泌   细胞生物学  

摘要： 目的：免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP)又称葡萄糖调节蛋白78，是热休克蛋白70家族的成员。BIP作为分子伴侣在细胞内发挥重要作用，但是分泌型BIP也可以在细胞外发挥重要作用。分泌型BIP可以诱导自身抗体，与炎性关节炎的进展相关;但是也有报道分泌型BIP亦可以诱导具有负性调节功能的DC和T细胞，以及在RA的动物模型中可以抑制疾病的进展，然而对其诱导免疫细胞的特点及其功能尚待研究阐明。B细胞一般被认为是促进免疫反应，因为B细胞可以分泌抗体和抗原提呈。但近年来，发现B细胞也具有调节功能，并且发现调节性B细胞亦可分为不同亚群，其通过不同的机制发挥调节作用。另外，许多微环境中分子和细胞因子被证明对调节性B细胞分化发育的起作用，如IL-21、IL-35、BUFF和LPS等也可以影响调节性B细胞分化发育。分泌型BIP在调节性B细胞分化发育中的作用值得研究。本论文旨在探究微环境中 BIP在调节性B细胞分化发育中的作用以及BIP处理的B细胞对NOD糖尿病鼠免疫功能的影响。　　方法：⑴通过ELISA检测自身免疫病人血清中BIP及细胞因子的表达;⑵通过荧光抗体单标记染色流式细胞术检测BIP诱导脾细胞表面分子的表达;⑶通过荧光抗体多标记染色流式细胞术检测BIP诱导脾细胞多重表面分子的表达，以及细胞内分子的表达;⑷ELISA检测BIP诱导脾细胞培养上清细胞因子的表达;⑸通过蛋白荧光偶联流式细胞术检测BIP与B细胞的结合;⑹通过磁珠分选B细胞和多色流式细胞术检测BIP诱导调节性B细胞的表型特征;⑺通过CFSE，7-ADD染色流式细胞术检测B细胞和T细胞的增殖;⑻通过NOD糖尿病鼠模型检测BIP处理的B细胞对NOD小鼠免疫功能的影响。　　结果：①与正常人的血清标本比较，在类风湿关节炎病人血清中BIP水平高于正常对照组，并且BIP表达和RF，IL-10表达呈正相关;②采用流式细胞术检测小鼠脾细胞表面分子的表达，结果显示BIP可以诱导脾细胞表达PD-L1和FasL，并诱导CD19的表达增强;③CD19, CD5荧光抗体双染流式细胞术检测结果表明，BIP可诱导CD19+CD5+双阳性细胞增加;④CD19，PD-L1或PD-L2荧光抗体双染流式细胞术分析结果表明，BIP可诱导CD19+PD-L1+双阳性细胞增加;⑤CD19，FasL荧光抗体双染流式细胞术分析结果表明，BIP可诱导CD19+FasL+双阳性细胞增加;⑥采用流式细胞术和ELISA检测小鼠脾细胞和CD19+细胞细胞因子的表达，结果表明BIP可以诱导CD19+IL-10+双阳性细胞增加和IL-10分泌;⑦采用荧光素标记BIP和流式细胞术检测了可溶性BIP与CD19+B细胞结果表明表明大部分的CD19+细胞可以与BIP结合;⑧多色流式细胞术检测结果表明，BIP可以诱导C57BL/6小鼠CD19+细胞中表型为CD19+CD5+PD-L1+，CD19+CD5+FasL+，CD19+CD5+IL-10+细胞扩增;⑨细胞功能检测结果表明 BIP诱导的CD19+细胞可以促进 T细胞的增殖，提示BIP诱导的B细胞在体外可以抑制T细胞的功能;⑩BIP诱导的调节性B细胞对NOD鼠胰岛炎进展影响不明显，但可以降低淋巴结中活化的CD8+T细胞的比例，其效应有待进一步研究。　　结论：⑴BIP可以诱导表型为CD19+CD5+PD-L1+，CD19+CD5+FasL+，CD19+CD5+ IL-10+细胞扩增,表明BIP可以诱导B1a来源的调节性B细胞;⑵BIP诱导的B细胞在体外可以抑制T细胞的增殖，表明BIP诱导的B细胞在体外可以抑制T细胞的功能;⑶BIP诱导的B细胞输注给NOD糖尿病鼠可以降低淋巴结中活化的CD8+T细胞的比例，表明BIP诱导的B细胞在体内有一定抑制免疫反应的作用;⑷通过与B细胞表面相关的受体结合，BIP可以诱导调节性B细胞。

关键词： 他汀   树突状细胞   实验性自身免疫性重症肌无力   体液免疫   滤泡辅助性T细胞   调节性B细胞   ROCK抑制剂   实验性自身免疫性重症肌无力   滤泡辅助性T细胞   生发中心   抗体  

摘要： 研究背景：重症肌无力(Myasthenia gravis, MG)是一种由抗体介导、T细胞依赖、补体参与的经典的器官特异性自身免疫性疾病,由于神经肌肉接头突触后膜上的乙酰胆碱受体损伤而导致神经肌肉接头处传递功能障碍。目前临床上针对重症肌无力的免疫治疗主要包括糖皮质激素和免疫抑制剂,因其缺乏特异性,且需要长期应用,副作用较大,因此促使我们探索新的治疗策略和方法。树突状细胞(dendritic cells, DC)是体内最重要的专职抗原提呈细胞,根据其成熟状态的不同,既可以诱导免疫反应,也可诱导免疫耐受。他汀类药物是临床常用的抗动脉粥样硬化药物,近来研究发现其作用机制除降低血脂外,更重要的是其抗炎及免疫调节作用。我们的前期研究发现,应用阿托伐他汀在体外修饰脾脏来源的树突状细胞,可诱导树突状细胞呈不成熟状态。给实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG)大鼠腹腔注射这些不成熟DC,可缓解EAMG的发展,减少抗体的产生。其机制主要是抑制了EAMG的细胞免疫反应,表现为抑制淋巴细胞增殖,上调调节性T细胞,使Th1/Th17细胞反应转化为Th2细胞反应。然而,他汀修饰的DC减少抗体产生的具体机制仍不明确,尤其是对体液免疫反应的影响及作用机制仍有待进一步研究。近来研究发现一群以CXCR5 (CXC chemokine receptor 5, CXC趋化因子受体5)、ICOS (inducible T-cell costimulator,诱导性协同刺激分子)、PD-1 (programmed death protein-1,程序性死亡受体1)、Bcl6 (B-cell lymphoma 6, B细胞淋巴瘤因子6)及IL-21为特征的新的细胞亚群,即滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cells, Tfh)。Tfh直接辅助B细胞产生抗体,在体液免疫反应过程中发挥重要作用,因此在很多自身免疫性疾病的研究中备受关注。另外,调节性B细胞(regulatory B cells, Breg)作为一群发挥负性调节作用的B细胞,其发现挑战了B细胞提呈抗原和分泌抗体的传统观点。因此,耐受性DC对EAMG大鼠的Tfh和Breg的影响也是本研究关注的重点。研究目的：探讨阿托伐他汀修饰的骨髓源性DC对EAMG体液免疫的调节及机制。研究方法：1. EAMG模型的建立及临床评分用大鼠来源的AChRα亚基97-116肽段(R97-116)免疫Lewis大鼠,第11天加强免疫一次,建立EAMG模型。采用双盲法隔天进行观察并评分,评分标准参考Lennon评分方法,结果以每个时间点的平均数表示。2.骨髓源性DC的诱导、培养与表型检测无菌条件下取免疫后20天的EAMG大鼠的胫骨和股骨,冲洗骨髓腔得到骨髓细胞悬液,去除红细胞后接种于培养瓶中。贴壁3天,去除悬浮细胞后继续培养。第8天加入药物处理,他汀组(AT-BMDC)加入阿托伐他汀(10 μM),对照组(0-BMDC)加入等体积的DMSO (dimethysulfoxide,二甲基亚砜)。48 h后收集悬浮细胞,经流式细胞仪检测表面CD80、CD86及MHCII分子的表达情况。3. EAMG大鼠的分组与治疗将15只大鼠随机分为3组(5只／组),在免疫后第5天及第16天各给予一次腹腔注射治疗。AT-BMDC组给予他汀处理的DC(1×106个／只),0-BMDC组给予未用他汀处理的DC(1×106个／只),EAMG组给予等体积的1640培养基。4. ELISA检测抗体数量及亲和力于免疫后第43天处死大鼠,取心脏血,离心取血清。用R97-116肽段包板,采用ELISA方法检测血清中抗R97-116抗体的数量,用硫氰酸盐洗脱法检测抗体的亲和力。5.免疫荧光法检测脾脏中的生发中心免疫后第43天处死大鼠,取新鲜脾脏,液氮速冻后-80℃冰箱冻存。OCT包埋后切片,用PNA (peanut agglutinin,花生凝集素)染色,PNA+细胞代表生发中心内的B细胞。6.流式细胞术检测淋巴结单个核细胞中的Tfh、IL-21+细胞及Breg取大鼠腹股沟淋巴结制备单细胞悬液,加入CD4、CXCR5、ICOS抗体检测Tfh细胞,加入CD19、IL-10抗体检测B10细胞,加入CD19、Foxp3抗体检测B-Foxp3 细胞。另外,用IL-21抗体检测IL-21+细胞。标记完成后经流式细胞仪检测。7.统计学分析应用SPSS17.0软件对资料进行统计分析,应用单因素方差分析(one-factor analysis of variance, ANOVA)或Kruskal-Wallis秩和检验进行组间比较,p<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1.阿托伐他汀