关键词： 免疫性血小板减少   利妥昔单克隆抗体   Th1/Th2   调节性B细胞   调节性T细胞   Th17细胞  

摘要： 目的:评估利妥昔单克隆抗体和地塞米松联合环磷酰胺治疗复发难治的免疫性血小板减少症(ITP)的有效性、安全性及其可能的作用机制。方法:前瞻性纳入12例复发难治的ITP患者,给予利妥昔单克隆抗体375 mg/m^2,每周1次,连用4周;地塞米松40 mg,连用4d环磷酰胺500 mg/m^2,两周1次,连用2周。用ELISA法检测患者治疗前后外周血IFN-r和IL-4水平,流式细胞术检测治疗前后调节性淋巴细胞Breg、Treg和Th17的水平,同时观察治疗前后血小板计数的变化,监测不良反应。结果:12例患者中6例(50.00%)获得完全缓解,4例(33.33%)部分缓解,总有效率为83.33%。治疗前血小板计数的平均值为(12.83±6.01)×10~9/L,治疗后血小板的平均峰值为(115.42±76.60)×10~9/L,二者差异有显著统计学意义(P<0.001)。治疗后IFN-r/IL-4比值(5.89±2.30)较治疗前(7.00±2.73)下降,差异均有显著统计学意义(P=0.002)。治疗后外周血Breg细胞(21.27±4.28)%较治疗前(15.48±1.67)%升高(P<0.001),Treg/Th17比值(3.07±1.50)较治疗前(0.98±0.45)升高(P<0.001),差异均有显著统计学意义。不良反应为输液反应(1例),继发性高血压和高血糖(1例),呼吸道感染(2例)。结论:利妥昔单克隆抗体和地塞米松联合环磷酰胺可改善复发难治ITP患者的疗效,且患者耐受性较好,其机制可能为促使辅助T细胞亚群及调节性淋巴细胞达到平衡。

关键词： 实验性自身免疫性脑脊髓炎   雌激素   调节性B细胞   炎性因子   程序性死亡受体-1/配体  

摘要： 目的检测雌激素在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中的预防性治疗作用并初步探讨其体内作用机制。方法用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG_(35-55))和完全弗氏佐剂(CFA)免疫C57BL/6J小鼠制备EAE模型;雌激素于建模始每日皮下注射50μmol/L进行治疗,通过发病指数评分、脊髓病理分析、炎症因子水平检测,并应用流式细胞仪(FACS)及实时荧光定量PCR(q PCR)评价治疗效果;进一步通过分析小鼠脾细胞及脊髓相关功能分子CD4/PD-1、CD19/PD-L1、CD4/CD25/Foxp3、CD19/CD21/CD23及CD19/CD5/CD1d^(high)的表达变化,探讨雌激素可能的作用机制。结果雌激素预防性治疗可有效延缓EAE小鼠的发病,减轻脱髓鞘病变。病理结果显示,雌激素治疗能减少小鼠脊髓组织炎性细胞的浸润,同时下调外周炎性因子TNF-a及IL-17A的分泌表达(P<0.01);与模型组相比,雌激素治疗下调T淋巴细胞表面活化分子CD69的表达(P>0.05)并可显著上调CD4^+T细胞表面PD-1的表达(P<0.05);同时,雌激素治疗后PD-1的配体CD19+B细胞表面PD-L1的表达明显上调(P<0.01),脾细胞中CD19^+CD21^(high)CD23^(low)(P<0.01)及CD19^+CD5^+CD1d^(high)(P<0.01)的比例也有不同程度的升高,但对脾细胞中CD4^+CD25^+Foxp3^+的表达无明显作用。结论雌激素预防性治疗可延缓EAE小鼠的发病进程,其作用机制可能与上调PD-1/PD-L1通路并上调调节性B细胞水平有关。

关键词： 肝炎,丙型,慢性   调节性B细胞   调节性T细胞  

摘要： 目的：探讨慢性丙型肝炎患者外周血IL-10＋CD1＋9调节性B细胞（regulatory B cells，Breg）和CD ＋4 CD ＋25 high 调节性 T 细胞（regulatory T cells，Treg）的表达及其相互关系。方法选取慢性丙肝患者45例，健康对照者25例。流式细胞术分析外周血 Breg 和 Treg 的表达情况，并进行相关性分析，ELISA 测定血清IL-10和 TGF-β水平。结果慢性丙肝组 Breg 较健康对照组显著升高，差异有统计学意义[3．55％（2．40％～4．14％）比1．66％（1．24％～2．02％），t ＝6．78，P ＜0．01]，同时慢性丙肝组 Treg 也显著高于对照组，差异有统计学意义[4．55％（3．35％～5．88％）比2．05％（1．39％～2．61％），t ＝7．17，P ＜0．01]。丙肝组 Breg 与 Treg存在正相关关系（r ＝0．374，P ＝0．019），对照组则无此相关性。慢性丙肝组血清 IL-10表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义[（78．65±17．21）pg／mL 比（53．21±11．47）pg／mL，t ＝7．51，P ＜0．001]。结论Breg 和 Treg 可能在 HCV 慢性感染过程中通过分泌 IL-10发挥免疫抑制作用，促进 HCV 的持续感染和特异性T 细胞的功能缺失。

关键词： B淋巴细胞   调节性B细胞   肿瘤   肿瘤免疫  

摘要： B淋巴细胞作为体液和细胞免疫的重要组成部分,能够通过多种调控方式发挥正性免疫调节作用。然而,越来越多的研究表明,B淋巴细胞亦可通过多种途径参与机体的免疫抑制调节,其中在肿瘤中以免疫抑制作用为主。目前研究多关注于B淋巴细胞特殊亚型-调节性B细胞(regulatory B cells,Bregs)在肿瘤中发挥的免疫抑制性作用,并通过分泌多种细胞因子、调控T细胞的作用以及直接作用于恶性肿瘤细胞等多途径影响肿瘤的发生发展进程。本文就B淋巴细胞在肿瘤免疫抑制机制研究的最新进展作一综述,为B淋巴细胞作为抗肿瘤潜在治疗靶点及治疗策略提供新的思路。

关键词： 系统性红斑狼疮   白介素35   调节性B细胞   发病机制  

摘要： 研究背景：\n 系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种表现有多系统损害慢性自身免疫疾病，其临床特征是产生大量自身抗体和多系统、器官受累。该病女性发病率高于男性，比例约为9:1，且多见于育龄期妇女，对患者的健康和生活质量造成了重大危害，但SLE的发病机制尚不明确，遗传、环境、雌激素、免疫等因素都可能与之相关，免疫失衡贯穿整个发病过程，B细胞和T细胞是SLE发病的重要参与者。既往认为B细胞主要通过分泌大量自身抗体，形成免疫复合物，参与体液免疫或直接对机体造成损害。但最近几年发现在实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)小鼠模型中，缺乏B细胞和CDl9-/-的小鼠病情更加严重，提示B细胞可以缓解病情，推测B细胞有负性调节作用。2006年，Mizoguchi等提出通过分泌IL-10、TGF-β、IL-35等负性调节因子，发挥负性免疫调节作用的B细胞群体称为调节性B细胞（Bregs）。Bregs可以通过调节Thl/Th2平衡抑制有害免疫应答，或可以直接减缓免疫细胞介导的炎症反应。Bregs已成为近几年研究热点，在多种疾病（如多发性硬化、类风湿关节炎、炎性肠病、肿瘤、移植、感染、慢性肝炎等）中参与免疫调节，与疾病的发生、发展、转归密切相关。\n 近年的研究发现，调节性B细胞还有一种新的亚群—白介素35阳性调节性B细胞（IL-35+Bregs）,一些研究证明IL-35和IL-35+Bregs在多种动物实验模型中参与发病，如在缺乏表达IL-35+Bregs的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型中调节性B细胞丧失功能，出现神经系统的脱髓鞘病变[5]。动物实验提示IL-35+Bregs主要通过分泌IL-35发挥免疫作用，IL-35是IL-12家族中的新成员，由EB病毒诱导基因3（Epstein-Barr virus-induced gene3，EBI3）蛋白和IL-12p35（IL-12A）亚基组成的异源二聚体， IL-35可反复诱导IL-35+Bregs细胞及IL-35的再分泌，形成正反馈机制。IL-35也可由调节性T细胞（Tregs）分泌，与Bregs可能有协同作用。IL-35+Bregs作为一种新的负性免疫调节的关键细胞，在体内发挥强有力的抗炎作用。事实上，IL-35可以抑制Th17细胞，在小鼠胶原性关节炎（CIA）、实验性自身免疫性脑炎(EAE)、实验性自身免疫性心肌炎(EAM)中缓解病情，提示IL-35在自身免疫性疾病中起着重要免疫调节的作用，另在MRL/PrA鼠模拟的系统性红斑狼疮模型研究经IL-35治疗的鼠肾炎指标可以得到改善。在SLE患者中血浆IL-35表达下调，与病情活动程度呈负相关，提示IL-35可能参与SLE的发病，而IL-35+Bregs通过分泌IL-35发挥重要的免疫调节作用。\n 因此，我们初步推测IL-35+Bregs可能参与SLE的发生、发展。本研究采用流式细胞术检测SLE患者和健康对照者外周血中CD19+IL-35+Bregs细胞及D4+CD25+F OXP3+Tregs细胞的比例，同时应用ELISA技术检测细胞培养上清中IL-35水平，分析其与疾病活动的关系，探讨IL-35+Bregs细胞及其效应细胞因子在SLE发病机制中的作用。\n 研究目的：\n 检测系统性红斑狼疮患者外周血中IL-35+CD19+Bregs细胞的表达，探讨IL-35+CD19+Bregs细胞在SLE发病机制的作用。\n 研究方法：\n 选择50例SLE患者（其中活动期30例，稳定期20例）和20例健康对照者为研究对象，分离外周血单个核细胞(PBMCs)，以LPS和hINF-γ刺激 PBMCs并进行培养，用流式细胞术分析外周血IL-35+CD19+Breg细胞CD4+CD25+FOXP3+Tregs细胞的表达；ELISA方法检测培养上清中白细胞介素（IL）-35的水平。\n 研究结果：\n 一、外周血IL-35+CD19+Bregs细胞检测结果：\n 1、外周血IL-35+CD19+Bregs细胞的表达：\n 外周血IL-35+CD19+Bregs细胞的表达(IL-35+CD19+Bregs／CD19+B细胞)：活动期SLE患者外周血中IL-35+CD19+Bregs细胞的表达为(1.43±0.67)％，稳定期SLE患者组为(2.27±0.68)％，两组比较P＜0.01；活动期SLE组和正常对照组[(4.24±1.11)％]比较P＜0.01；稳定期SLE患者组与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。\n 2、外周血IL-35+CD19+Bregs细胞的表达与疾病活动程度的相关性：\n SLE患者外周血C

关键词： 调节性B细胞   视神经脊髓炎谱系疾病   体液免疫   流式细胞术  

摘要： 目的:本研究旨在分析比较NMOSDs患者与正常对照组外周血单个核细胞中不同Bregs表型的数量及临床意义,并探讨不同Bregs表型与NMOSDs疾病严重程度的相关性,进一步揭示Bregs在NMOSDs发病过程中起到的重要作用,为今后NMOSDs的治疗提供新的方法。对象与方法:选取2015年5月至2016年3月之间就诊于吉林大学第一医院神经内科住院部的NMOSDs患者22例,同期选取年龄性别匹配的健康志愿者20例。所有患者按2015年最新NMOSDs诊断标准经2位神经免疫专业医生诊断。本实验征得研究对象或家属的同意后签署知情同意书,并收集NMOSDs患者的临床资料,对NMOSDs组患者进行EDSS评分评估疾病的严重程度。1.流式细胞术检测NMOSDs组和对照组外周血单个核细胞中Bregs三种不同表型CD19+CD24hiCD27+、CD19+CD5+CD1dhi、CD19+CD24hiCD38hi的百分数,并分析其比例变化;2.分析Bregs不同表型与NMOSDs患者EDSS评分和年复发率(ARR)的相关性。结果:***组外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs的数量(4.07±0.03)水平较对照组相比明显降低(5.65±0.02),两者差异有统计学意义(P<0.05);***组外周血CD19+CD24hiCD27+Bregs的数量(34.74±0.10)水平较对照组相比明显升高(26.23±0.11),两者差异有统计学意义(P<0.05);***组外周血CD19+CD5+CD1dhiBregs的数量(2.78±0.02)水平较对照组相比明显降低(5.73±0.03),两者差异有统计学意义(P<0.001);4.不同Bregs表型与NMOSDs患者EDSS和年复发率ARR无明显的相关性(P>0.05)。结论:***患者外周血CD19+CD5+CD1dhi、CD19+CD24hiCD38hiBregs表型占CD19+B细胞的比例较对照组明显降低;***患者外周血CD19+CD24hiCD27+Bregs表型占CD19+B细胞的比例较对照组明显增高;3.不同Bregs表型与NMOSDs患者EDSS和年复发率ARR均无明显的相关性。

关键词： 原发性干燥综合征   调节性B细胞   增殖诱导配体   抗SSA抗体   抗SSB抗体   ESSDAI  

摘要： 目的:原发性干燥综合征（primary sj?gren’s syndrome,pSS）是一种以泪腺、唾液腺等外分泌腺体受累,具有高度淋巴细胞浸润为特征的弥漫性结缔组织病。临床上主要表现为干燥性角、结膜炎,口腔干燥症,还可累及肺脏、肝脏、肾脏、血液、骨骼肌肉、神经等多个脏器和系统。pSS病因和发病机制未明,研究发现其发病与遗传因素、环境因素、多种免疫细胞及相关细胞因子有关。调节性B细胞（regulatory B cell,Breg）在pSS发病中的作用是当前研究的热点之一。本研究通过检测原发性干燥综合征患者外周血中调节性B淋巴细胞数目及增殖诱导配体（a proliferation inducing ligand,APRIL）表达水平,分析研究其与免疫球蛋白水平、自身抗体表达、唇腺病理等级以及疾病活动度的相关性,来探讨CD19+CD5+CD1dhi Breg和APRIL在pSS发病发展中的作用,为pSS的诊断和治疗提供新的靶点和思路。方法:1病例选择及分组:选取河北省人民医院风湿免疫科自2015年4月至2015年10月初治的pSS患者30例作为实验组,所有患者均符合2002年修订的pSS国际分类诊断标准,并且排除有其他结缔组织病、颈头面部放疗史、丙肝病毒感染、AIDS、淋巴瘤、移植物抗宿主病、应用抗乙酰胆碱药等。另外,选取年龄、性别与实验组pSS患者匹配的健康志愿者20例为对照组。将pSS患者按照自身抗体的有无、唇腺等级及ESSDAI评分等级进行不同的分组。2实验方法:采用流式细胞术检测表型为CD19+CD5+CD1dhi Breg的百分比;酶联免疫吸附法检测血清中APRIL的表达水平;收集入组患者的基本信息,临床资料,其中临床指标包括WBC、RBC、Plt、Hb、ANA（anti-nuclear antibody,ANA）、ENA抗体谱、类风湿因子（rheumatoid factor,RF）、免疫球蛋白（immune globulin,Ig）、C反应蛋白（C reactive protein,CRP）、血沉（erythrocyte sedimentation rate,ESR）、补体C3（complement3,C3）、C4（complement 4,C4）。3唇腺病理分级:取患者下唇腺病理组织,福尔马林液固定,石蜡包埋,切片,然后进行HE染色。根据Chisholm标准分为IⅣ级。4患者疾病活动指数评估:依据2009年欧洲抗风湿病联盟制定的干燥综合征疾病活动度指数（ESSDAI）对患者疾病活动度进行评估。5采用SPSS17.0统计软件进行统计分析,计量资料符合正态分布的结果以均数±标准差（xˉ±SD）表示,两组间比较应用t检验;多组样本间均数比较采用单因素方差分析。非正态分布的资料采用中位数（四分位间距）[M（P25,P75）],两组资料比较采用非参数Mann-Whitney U检验。符合正态、方差齐的计量资料采用Pearson相关分析,非正态或方差不齐的计量资料采用Spearman相关分析。结果:1 pSS患者外周血中CD19+CD5+CD1dhi Breg及APRIL的表达水平:pSS患者外周血中CD19+CD5+CD1dhi Breg占CD19+细胞百分比为5.06±0.69%,较健康对照组2.55±0.54%显著升高（P<0.001）。血清APRIL的表达水平为7.40±2.20ng/ml,较健康对照组1.99±0.44ng/ml显著升高（P<0.001）。2 pSS患者外周血CD19+CD5+CD1dhi Breg表达和APRIL水平与自身抗体的关系:按照自身抗体的存在与否,将pSS患者分为ANA阴性组（7例）、阳性组（23例）;抗SSA阴性组（11例）、阳性组（19例）;抗SSB阴性组（20例）、阳性组（10例）;RF阴性组（19例）、阳性组（11例）。抗SSA抗体阳性、抗SSB抗体阳性组pSS患者外周血CD19+CD5+CD1dhi Breg表达分别为5.44±0.46%和5.59±0.53%,显著高于对应抗体阴性患者的4.41±0.49%和4.79±0.61%（t=-5.70,-3.53;P<0.001）。上述其余各抗体阳性组和阴性组pSS患者外周血CD19+CD5+CD1dhi Breg表达差异无统计学意义（P>0.05）。pSS患者血清APRIL在各抗体阳性组和阴性组的表达差异均无统计学意义（P>0.05）。3 pSS患者外周血CD19+CD5+CD1dhi Breg表达和APRIL水平与临床指标的关系:pSS患者外周血中CD19+CD5+CD1dhi Breg表达与年龄呈负相关（r=-0.43;P<0.05）,与Ig G呈正相关（r=0.44;P<0.05）;血清中APRIL的表达与ESR成正相关（r=0.

关键词： 肾细胞癌   TIM-3   多态性   肿瘤浸润淋巴细胞   调节性B细胞  

摘要： 研究目的近年肾细胞癌发病率在男性恶性肿瘤中位居第7,作为泌尿系统常见肿瘤之一发病率以每年2-4%的幅度递增。外科手术对于大多数肾细胞癌患者而言是最主要的治疗方式,它在早期肾癌患者中已取得很好的疗效,但对多数肾癌患者而言,切除肾脏原发灶后,影响患者生存率和死亡率的主要因素仍然是肿瘤的复发和转移。而且肾癌对放化疗敏感性较差,5年生存率在发生转移后降至5-10%。因此,进一步探索新的抗肾癌手段,增强机体抗肿瘤的能力,具有极为重要的意义。T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子3(TIM-3)作为免疫球蛋白超族成员,在完全分化的Th1淋巴细胞上高表达,同时也是Th1 CD4+细胞的特异性细胞标志物。已有研究表明TIM-3可以抑制IL-2和γ-IFN的产生,从而加速肿瘤细胞的扩散;同时在部分肿瘤(胃癌、大肠癌等)患者及动物的CD4+、CD8+T淋巴细胞上大量表达的TIM-3还能发挥负向调节T细胞免疫应答的作用,诱导T淋巴细胞的功能减弱及凋亡,进而削弱机体抗肿瘤免疫能力。但是TIM-3在肾癌患者中起到何种作用,其对肿瘤患者的哪些免疫细胞有调节作用,其具体机制如何,目前尚未见报道。一个生物群体中同时和经常存在两种或两种以上的不连续的变异型或基因型或等位基因被称为多态性,单核苷酸多态性是最常见的多态性类型之一。基因多态性在临床工作中的重要意义在于被用于分析人体对疾病、毒物等的易感性和耐受性、疾病临床表现多样性及对药物治疗反应性等。目前关于TIM-3的多态性表现已有文献报道,但是关于其与肾癌易感性之间的相关性如何未见报道。本课题基于上述原因拟研究TIM-3多态性与肾癌易感性之间的关系,同时探讨不同肾癌分期患者体内TIM-3的分布情况、TIM-3与不同分期肾癌患者Th1、CD4+、CD8+Treg、Breg等免疫细胞功能的关系,探讨TIM-3参与细胞免疫调节的作用及机制,进一步明确不同分期的肾癌患者体内TIM-3所起的作用是否不同,为探索新的治疗肾癌的方法充实理论基础。研究方法第一部分:本实验首先收集322名肾癌患者和402名健康人的血液,主要运用聚合酶链式反应-限制片段长度多态性分析技术,对TIM-3基因多态性中最常见的三种类型(即-1516G/T,-574G/T和+4259T/G)进行基因分型,据此评估在中国人群中,TIM-3多态性是否和肾癌的易感性存在有关性。第二部分:在实验的第二部分,我们收集了30名肾癌患者的肿瘤组织标本及外周血,同时采集来自10名健康体检人群的外周血标本作为实验对照,使用流式细胞术、实时定量PCR等技术,研究TIM-3在TIL CD4+T细胞和TIL CD8+T细胞上的表达及功能情况,用于明确TIM-3在肾癌中对肿瘤浸润淋巴细胞发挥的作用。第三部分:我们收集了8名I、II期肾癌患者与7名III、IV期肾癌患者的肿瘤组织标本及外周血,统计肿瘤大小及有无远处转移等情况,通过细胞分离、ELISAs及T细胞增殖和促炎性细胞因子检测等方法,分别研究外周血及肿瘤组织的各类细胞中,IL-10+细胞的分布情况、肿瘤浸润淋巴细胞中IL-10分泌型B细胞的表型、肿瘤浸润型B细胞中抗体的分泌情况、肿瘤组织中IL-10分泌型B细胞的免疫抑制功能及其与TIM-3和肾癌临床进展的相关性。结果1.第一部分(1)-574G/T和+4259T/G单核苷酸多态性在肾癌患者中的发生率明显高于对照组,而-1516G/T SNP单核苷酸多态性的发生率没有统计学差异。同时,-574G/T和+4259T/G等位基因在肾癌患者中也明显增加。(2)TIM-3-574G/T和+4259T/G SNPs互相之间具有较强的LD,而-1516G/T和-574G/T,或者-1516G/T和+4259T/G之间没有LD,肾癌患者中TTG的单体型的发生率明显高于对照组。(3)与未发生转移的患者相比,转移患者中+4259T/G等位基因的发生率明显增加,然而这些多态性在糖尿病和肿瘤组织学类型中并没有显示出任何差别。2.第二部分(1)TIM-3在肾癌患者的TIL CD4+和TIL CD8+细胞上的表达显著升高了,而且与肿瘤分期具有一定的相关性;(2)在TIL TIM-3(+)细胞上,GATA-3和IFN-γ表达下调了,而T-bet的表达上调了。此外,研究结果显示TIM-3阳性CD8+T细胞的STAT5的磷酸化水平较TIM-3阴性对照组降低了60.5%,同样的,与TIM-3(-)相比,p38在TIL TIM-3(+)CD8+T细胞中的磷酸化水平下降了30.6%,这些结果提示在肾细胞癌中TIM-3阳性肿瘤浸润性T细胞的Stat5和p38信号通路受损;(3)使用s TIM-3处理过TIL CD4+T和CD8+T细胞后,其中的CFSE细胞的百分比显著提高,这一结果表明阻断TIM-3通路可以强化TIL增殖。此外

关键词： 肝移植   西罗莫司   调节性B细胞   调节性T细胞   免疫功能  

摘要： 目的:1.筛选影响肝移植受者术后外周血淋巴细胞亚群的临床因素，并探讨相应临床因素下免疫抑制剂的调整策略。2.通过体内及体外实验深入研究西罗莫司提高肝移植术后患者外周血中调节性B细胞(regulatory B cell，Breg)和调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)比值的作用。3.通过采用对人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）培养的方式深入研究Breg在西罗莫司扩增Treg中的协同作用。　　方法:实验一:应用流式细胞技术调查临床肝移植术后患者外周血淋巴细胞亚群状态，通过回归分析筛查影响淋巴细胞亚群的相关临床因素，探讨根据相关临床因素制定个性化免疫抑制方案的可行性。实验二:通过流式细胞技术检测肝移植术后将他克莫司部分转换为西罗莫司抗排异的患者药物转换前后外周血Breg和Treg的变化，并与同时期未应用西罗莫司的患者进行对比，明确西罗莫司对患者外周血Breg和Treg的扩增作用。实验三:采用西罗莫司体外刺激人PBMCs的方法，进一步证实西罗莫司对Breg和Treg的扩增作用，同时通过西罗莫司对剔除B细胞的PBMCs刺激的结果，以及加入细胞因子TGF-β1和IL-10后西罗莫司对剔除B细胞的PBMCs刺激结果，试图证实Breg在西罗莫司刺激Treg增殖的过程中起协同作用。　　结果:1.既往曾发生排斥反应、脾脏机能亢进和术后应用西罗莫司是导致肝移植术后受者外周血中部分淋巴细胞亚群存在差异的三个主要临床因素。既往曾出现排斥反应的患者外周血中CD8+T细胞百分比高于未曾发生排斥反应的患者(P＜0.01)，而Breg百分比低于未发生排斥反应患者(P＜0.05);脾脏机能亢进可以提高Breg和Treg的百分比（P＜0.01和P＜0.01），而减少CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞和NK细胞的绝对值（P＜0.01， P＜0.01， P＜0.01，和P＜0.01）;术后应用西罗莫司可以提高Breg和Treg的百分比（P＜0.01和P＜0.01），同时还可以提高Breg和Treg的绝对值（P＜0.05和P＜0.05）。2.肝移植患者术后将他克莫司部分转换为西罗莫司抗排异治疗后第7天，外周血Breg和Treg比值明显升高（P＜0.05和P＜0.05），转换后第30天升高更为明显（P＜0.01和P＜0.01）;与同时期未应用西罗莫司的患者比较，转换后第7天，Treg比值明显高于对照组(P＜0.05)，转换后第30天，Breg和Treg比值均高于对照组（P＜0.05和P＜0.01）。3.西罗莫司可以在体外PBMCs培养中使TGF-β1+ Breg和IL-10+ Breg占B细胞的比值以及Treg占T细胞的比值增高，同时可以刺激Breg相关的细胞因子TGF-β1和IL-10的分泌;在剔除B细胞后，西罗莫司对Treg的扩增作用和对细胞因子的刺激作用均减弱;而在剔除B细胞的PBMCs中加入适量TGF-β1和IL-10后，西罗莫司对Treg的扩增作用得以恢复。　　结论:1.肝移植术后既往曾出现排斥反应、脾脏机能亢进和术后应用西罗莫司是引起部分淋巴细胞亚群差异的主要因素，脾机能亢进患者可以适当减低免疫抑制剂用量，既往曾经出现排斥反应患者需适当增加免疫抑制剂用量。2.肝移植术后将他克莫司部分转换为西罗莫司抗排异治疗可以明显增加患者外周血Breg和Treg的比值。3.西罗莫司与健康受试者外周血PBMCs体外共培养亦可以明显扩增Breg和Treg，Breg可能在西罗莫司扩增Treg过程中起协同作用。

关键词： 胆汁性肝硬化   免疫机制   调节性B细胞   辅助性T细胞1   细胞分化  

摘要： 原发性胆汁性肝硬化(Primary Biliary Cirrhosis，PBC)是一类进展缓慢的肝脏自身免疫性疾病。临床常见抗线粒体抗体(Antimitochondrial antibody，AMA)阳性、高水平的碱性磷酸酶等异常实验室指标;并伴有慢性胆汁淤积、非化脓性肝内胆管破坏等主要病理表现。中、晚期PBC患者的内科治疗没有满意的效果，且治疗手段比较单一。因此，对PBC的早期诊断治疗是非常必要的。目前，寻求新的治疗靶点是PBC研究的热点。　　B淋巴细胞的异常活化，自身抗体的产生是诱导PBC发病的主要因素。B细胞不仅具备产生抗体、提呈抗原等作用，而且还可以负向调节机体的免疫应答。早在20世纪90年代就有研究者在自身免疫性实验性脑脊髓炎的小鼠模型实验中发现B细胞剔除后的小鼠病情恶化程度增高，并首次在小鼠体内发现调节性B细胞(regulatoryB cells，Bregs)。随后系列研究进一步证实Bregs的存在，并指出其在免疫调节作用的重要性。近年来，已有研究者分别在系统性红斑狼疮(Systemic LupusErythematosus，SLE)、天疱疮、血管炎等不同的自身免疫性疾病中研究CD19+CD24hiCD38hiBreg的生物特性及相关作用。然而，有关CD19+CD24hCD38hiBreg在PBC的研究目前尚未见任何阐述。　　目的：　　观察CD19+CD24hiCD38hiBreg在PBC患者外周血中的表达情况。分析该群细胞与疾病的相关性，并初步探讨PBC外周血中CD19+CD24hiCD38hiBreg对辅助性T细胞1(Thelper cell1，Th1)、辅助性T细胞17(T helper cell17，Th17)细胞分化的影响，为PBC免疫机制的研究及未来治疗策略的开发提供新的实验依据。　　方法：　　1.采集PBC患者组与健康对照组(HC)的EDTA抗凝血，密度梯度离心法提取外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，流式细胞仪检测CD19+B细胞以及CD19+CD24hiCD38hiBreg在CD19+B细胞的表达频率。比较上述两者在PBC患者与正常人中的变化情况。　　2.采集PBC患者组血清，用Modular PPT生化分析仪检测患者的ADA、ALT、AST、GGT、ALP、TBIL、DBIL、IBIL、TBA等肝功相关指标，分析其与CD19+CD24hiCD38hiBreg的相关性。　　3.流式细胞仪检测HC组中Th1、Th17细胞的频率，分别与HC组的CD19+CD24hiCD38hiBreg进行相关性分析，初步分析HC组中Th1、Th17细胞的频率与CD19+CD24hiCD38hiBreg的潜在关系。　　4.流式细胞仪检测PBC组中Th1、Th17细胞的频率，分别与PBC组的CD19+CD24hiCD38hiBreg进行相关性分析，初步分析PBC组中Th1、Th17细胞的频率与CD19+CD24hiCD38hiBreg的潜在关系。　　4..流式分选正常人的CD4+T细胞与CD19+CD24hiCD38hiBreg、PBC的CD19+CD24hiCD38hiBreg。正常人CD4+T细胞单独培养作为对照;将正常人CD4+T细胞分别与正常人CD19+CD24hiCD38hiBreg、PBC患者的CD19+CD24hiCD38hiBreg共培养。流式检测Th1细胞的分化情况。　　结果：　　1.外周血中CD19+B细胞所占比例情况:PBC组为(12.210±6.204)％， HC组为(8.469±3.399)％;且具有显著差异(P=0.009)。此外，PBC组中CD19+CD24hiCD38hiBreg/CD19+B细胞的比例(12.379±6.417)％较HC组(4.225±3.318)％的比例增高，且具有统计学意义(p=0.000)。　　***中CD19+CD24hiCD38hiBreg与TBIL(P=0.049, r=0.535)、DBIL(P=0.035,r=0.566)、IBIL(P=0.046，r=0.521)、TBA(P=0.014，r=0.619)呈正相关性。　　3..HC组中Th1、Th17频率为(11.807±5.144)％、(0.846±0.904)％。其中HC组中CD19+CD24hiCD38hiBreg与Th1细胞具有负相关性（P=0.017，r=-0.426），与Th17细胞没有相关性(P=0.941，r=0.014)。　　***组中Th1、Th17频率为(17.689±7.444)％、(1.797±2.784)％。其中PBC组中CD19+CD24hiCD38hiBreg与Th1具有正相关性(P=0.003，r=