关键词： 原发性干燥综合征   调节性B细胞   增殖诱导配体   抗SSA抗体   抗SSB抗体   ESSDAI  

摘要： 目的:原发性干燥综合征（primary sj?gren’s syndrome,pSS）是一种以泪腺、唾液腺等外分泌腺体受累,具有高度淋巴细胞浸润为特征的弥漫性结缔组织病。临床上主要表现为干燥性角、结膜炎,口腔干燥症,还可累及肺脏、肝脏、肾脏、血液、骨骼肌肉、神经等多个脏器和系统。pSS病因和发病机制未明,研究发现其发病与遗传因素、环境因素、多种免疫细胞及相关细胞因子有关。调节性B细胞（regulatory B cell,Breg）在pSS发病中的作用是当前研究的热点之一。本研究通过检测原发性干燥综合征患者外周血中调节性B淋巴细胞数目及增殖诱导配体（a proliferation inducing ligand,APRIL）表达水平,分析研究其与免疫球蛋白水平、自身抗体表达、唇腺病理等级以及疾病活动度的相关性,来探讨CD19+CD5+CD1dhi Breg和APRIL在pSS发病发展中的作用,为pSS的诊断和治疗提供新的靶点和思路。方法:1病例选择及分组:选取河北省人民医院风湿免疫科自2015年4月至2015年10月初治的pSS患者30例作为实验组,所有患者均符合2002年修订的pSS国际分类诊断标准,并且排除有其他结缔组织病、颈头面部放疗史、丙肝病毒感染、AIDS、淋巴瘤、移植物抗宿主病、应用抗乙酰胆碱药等。另外,选取年龄、性别与实验组pSS患者匹配的健康志愿者20例为对照组。将pSS患者按照自身抗体的有无、唇腺等级及ESSDAI评分等级进行不同的分组。2实验方法:采用流式细胞术检测表型为CD19+CD5+CD1dhi Breg的百分比;酶联免疫吸附法检测血清中APRIL的表达水平;收集入组患者的基本信息,临床资料,其中临床指标包括WBC、RBC、Plt、Hb、ANA（anti-nuclear antibody,ANA）、ENA抗体谱、类风湿因子（rheumatoid factor,RF）、免疫球蛋白（immune globulin,Ig）、C反应蛋白（C reactive protein,CRP）、血沉（erythrocyte sedimentation rate,ESR）、补体C3（complement3,C3）、C4（complement 4,C4）。3唇腺病理分级:取患者下唇腺病理组织,福尔马林液固定,石蜡包埋,切片,然后进行HE染色。根据Chisholm标准分为IⅣ级。4患者疾病活动指数评估:依据2009年欧洲抗风湿病联盟制定的干燥综合征疾病活动度指数（ESSDAI）对患者疾病活动度进行评估。5采用SPSS17.0统计软件进行统计分析,计量资料符合正态分布的结果以均数±标准差（xˉ±SD）表示,两组间比较应用t检验;多组样本间均数比较采用单因素方差分析。非正态分布的资料采用中位数（四分位间距）[M（P25,P75）],两组资料比较采用非参数Mann-Whitney U检验。符合正态、方差齐的计量资料采用Pearson相关分析,非正态或方差不齐的计量资料采用Spearman相关分析。结果:1 pSS患者外周血中CD19+CD5+CD1dhi Breg及APRIL的表达水平:pSS患者外周血中CD19+CD5+CD1dhi Breg占CD19+细胞百分比为5.06±0.69%,较健康对照组2.55±0.54%显著升高（P<0.001）。血清APRIL的表达水平为7.40±2.20ng/ml,较健康对照组1.99±0.44ng/ml显著升高（P<0.001）。2 pSS患者外周血CD19+CD5+CD1dhi Breg表达和APRIL水平与自身抗体的关系:按照自身抗体的存在与否,将pSS患者分为ANA阴性组（7例）、阳性组（23例）;抗SSA阴性组（11例）、阳性组（19例）;抗SSB阴性组（20例）、阳性组（10例）;RF阴性组（19例）、阳性组（11例）。抗SSA抗体阳性、抗SSB抗体阳性组pSS患者外周血CD19+CD5+CD1dhi Breg表达分别为5.44±0.46%和5.59±0.53%,显著高于对应抗体阴性患者的4.41±0.49%和4.79±0.61%（t=-5.70,-3.53;P<0.001）。上述其余各抗体阳性组和阴性组pSS患者外周血CD19+CD5+CD1dhi Breg表达差异无统计学意义（P>0.05）。pSS患者血清APRIL在各抗体阳性组和阴性组的表达差异均无统计学意义（P>0.05）。3 pSS患者外周血CD19+CD5+CD1dhi Breg表达和APRIL水平与临床指标的关系:pSS患者外周血中CD19+CD5+CD1dhi Breg表达与年龄呈负相关（r=-0.43;P<0.05）,与Ig G呈正相关（r=0.44;P<0.05）;血清中APRIL的表达与ESR成正相关（r=0.

关键词： 乳腺浸润癌   Bregs   Tregs   PD-L1  

摘要： 第一部分乳腺浸润癌中CD19+调节性B细胞的确定及其生物学意义目的:研究乳腺肿瘤组织中Bregs表达情况及其与乳腺浸润性癌的相关性和临床意义。方法:本研究利用免疫组化技术分析CD19、IL-10在134例乳腺浸润性癌组织中的表达情况,免疫荧光技术研究两者之间的相互关系以及流式细胞检测技术研究乳腺肿瘤组织中CD19+IL-10+B细胞表达并与CD24、CD38之间的相互关系。结果:(1):乳腺浸润性癌中IL-10主要定位于肿瘤周围浸润的淋巴细胞的细胞浆,表达与肿瘤分化程度相关,即低分化肿瘤组织高表达IL-10分子(P=0.048),IL-10的阳性表达在ER-、PR-、HER2+组中表达增高,相对于ER+、PR+以及HER2-组差异具有统计学意义(P=0.02,P=0.049,P=0.049)。(2):乳腺肿瘤周围浸润CD19+B细胞与IL-10存在共表达(P=0.001),部分CD19+细胞胞浆内可见IL-10颗粒,表明乳腺癌肿瘤周围浸润CD19+B细胞可能具有分泌IL-10能力。(3):乳腺浸润性癌外周血CD19+IL-10+的比例比纤维瘤中增高(P=0.046),且高表达CD24、CD38分子,同时CD19+CD24+CD38+中B细胞IL-10+B细胞表达比非CD19+CD24+CD38+B增高。(4):乳腺浸润性癌组织中CD19+B、CD19+CD24+CD38+Bregs细胞的表达相较纤维瘤中增高。结论:本研究证实在乳腺浸润性癌病人外周血及其肿瘤组织中CD19+IL-10+的B细胞的比例较高,且其表面标志为CD24、CD38。为深入研究B细胞亚群与乳腺浸润癌细胞之间的相关性,以及与肿瘤免疫的相关性奠定基础。第二部分CD19+CD24+CD38+调节性B细胞与调节性T细胞的相互关系及其生物学意义目的:检测Bregs、Tregs在乳腺肿瘤患者中的表达情况,探讨两者之间的相互关系及其生物学意义。方法:利用流式细胞技术检测健康人、纤维瘤以及乳腺浸润性癌中Bregs、Tregs表达情况,与临床病理参数之间的关系及其两者之间的相互关系。结果:(1):乳腺浸润性癌病人外周血中CD19+B不仅能够提高乳腺浸润性癌病人T细胞中Tregs的比例,同样促进健康人的CD4+T细胞向Tregs分化。(2):乳腺浸润性癌外周血的中Bregs的比例增高,与健康人(P<0.001)和纤维瘤(P<0.001)相比具有显著差异,CD19+B细胞在肿瘤直径小于3cm组中表达增高,与直径大于3cm组差异具有统计学意义(P=0.019),而与其他临床病理参数均无统计学意义。(3):乳腺浸润性癌外周血中Tregs的比例表达增高,与健康人(P<0.001)、纤维瘤(P<0.001)相比,存在显著统计学意义。同时CD4+T细胞在年龄小于49岁组中表达增高,与年龄大于49岁组相比,差异具有统计学意义(P=0.047),而与其他临床病理参数均无统计学意义。(4):乳腺浸润性癌外周血中,B细胞与T细胞之间的相互关系(P≤0.001,r=0.397),同时Bregs与Tregs之间表达也存在显著正相关性(P=0.001,r=0.361)结论:乳腺浸润性癌患者外周血表达高水平的Bregs、Tregs且存在正相关性,肿瘤细胞如何通过Bregs、Tregs发挥免疫逃避的机制仍需进一步研究。第三部分PD-L1分子对CD19+CD24+CD38+调节性B细胞的调节以及生物学意义目的:通过对乳腺癌细胞株表面所表达PD-L1分子来研究肿瘤细胞对Bregs的作用以及功能的影响,为针对肿瘤细胞表达的PD-L1分子治疗新的策略提供新的依据。方法:将活化刺激的CD19+B细胞、分别与MCF-7,MDA-MB-231乳腺癌细胞株共育培养,流式细胞仪检测Bregs的表达,再与CD4+T细胞共育培养检测Tregs的表达。Si RNA下调MDA-MB-231细胞上PD-L1,与CD19+B,CD4+T细胞共育培养,流式细胞仪检测Bregs,Tregs的表达情况结果:(1):肿瘤细胞株表面所表达的PD-L1分子可诱导CD19+Bregs的扩增,进而促进CD4+的T细胞分化为Tregs。(2):Si RNA干扰下调PD-L1分子的表达后,Bregs及Tregs的数量也随之下降。结论:肿瘤细胞所表达PD-L1可诱导CD19+B细胞向Bregs分化,进而抑制机体的免疫应答,从而逃避宿主免疫攻击;这也为针对PD-L1分子的肿瘤免疫治疗提供依据。

关键词： 异基因造血干细胞移植   慢性移植物抗宿主病   Nrf2抗氧化通路   调节性B细胞   白介素-10  

摘要： 目的建造异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)术后小鼠慢性移植物抗宿主病(c GVHD)模型,检测c GVHD小鼠Nrf2抗氧化通路、氧化应激、调节性B细胞(Bregs)及相关免疫炎症反应的水平,在体内实验中初步探讨它们在c GVHD发病机制中的作用。方法以雄性BALB/c(H-2d)小鼠作为供鼠,雌性CB6F1(B6)(H-2b)小鼠作为受鼠,受鼠经过致死性全身照射(TBI)(9.0Gy)预处理后,4-6小时内经尾静脉注射供鼠骨髓细胞(8×106)及脾脏细胞(6-7×107)混悬液,建立Scl-c GVHD小鼠模型。本实验分组如下:(1)对照组;(2)致死性全身照射(TBI)组:雌性CB6F1小鼠只接受照射不移植;(3)同基因移植(syn BMT)组:雄性CB6F1小鼠作为移植供鼠(供受鼠同源);(4)异基因移植(allo BMT)组:雄性BALB/c小鼠作为供鼠(供受鼠非同源)。各组小鼠均于移植后27-33天处死。c GVHD临床评分和组织病理学分析共同作为评判c GVHD的标准。第一部分:活性氧(ROS)试剂检测小鼠外周血单个核细胞(PBMCs)的氧化活性水平;Western blot检测各组小鼠骨髓、肝脏中Nrf2抗氧化通路蛋白表达水平,实时定量RT-PCR检测检测各组小鼠骨髓、肝脏中Nrf2抗氧化通路m RNA水平。第二部分:小鼠外周血中Bregs(CD19+CD5+CD1d+B细胞)的比例采用流式细胞术进行检测;小鼠血浆中炎症抑制因子白介素-10(IL-10)和纤维生成相关因子-β1(TGF-β1)的水平采用ELISA进行检测。本实验数据中,所有计量资料行t检验,均采用均数±标准误表示;所有计数资料行卡方检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。结果成功构建Scl-c GVHD小鼠模型:小鼠c GVHD临床评分和组织病理学分析均提示allo BMT组小鼠发生c GVHD,而syn BMT组小鼠未见c GVHD发生;第一部分(1)活性氧检测结果显示allo BMT组(c GVHD)小鼠PMBCs中ROS水平较syn BMT组(non-c GVHD)小鼠显著升高(P<0.05);(2)Western blotting结果显示c GVHD小鼠肝脏及脾脏Nrf2,NQO1及HO-1蛋白表达水平均较non-c GVHD小鼠显著降低(P<0.05);(3)实时定量RT-PCR结果显示c GVHD小鼠肝脏及脾脏Nrf2,NQO1及HO-1m RNA水平水平均比较non-c GVHD小鼠显著降低(P<0.05);第二部分(1)流式细胞术结果显示c GVHD小鼠外周血中Bregs水平较non-c GVHD小鼠显著降低(P<0.05);(2)ELISA检测结果显示c GVHD小鼠血浆中IL-10水平较non-c GVHD小鼠显著下降(P<0.001);而TGF-β1水平无显著差异(P=0.264)。结论本研究首次报道了allo-HSCT后c GVHD小鼠体内Nrf2抗氧化信号通路下调,氧化应激水平增高。研究尚显示c GVHD小鼠外周血Bregs水平明显降低,且细胞因子IL-10水平(与Bregs免疫抑制活性有关)也显著降低。Nrf2抗氧化信号通路下调,可能参与c GVHD的发病机制;Bregs及其分泌IL-10水平的降低也可能介导c GVHD的发生发展,而其内在机制、两者之间的关联尚需进一步研究,为c GVHD的预防及治疗提供新靶点。

关键词： 强直性脊柱炎   调节性B细胞   分布特征   调节作用  

摘要： 强直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis AS）是一种常见的自身免疫性疾病,欧洲人群的发病率大约为0.55%,中国人群为0.23%。主要表现为累及脊柱和骨盆的慢性炎症性关节炎,引起疼痛、关节僵硬并受影响的区域进展性的新骨形成和融合。因为确切的疾病发生和进展的原因尚不清楚,目前针对于强直性脊柱炎治疗只是症状上的缓解而不能完全根治。非甾类抗炎药（NSAID）可以减轻患者疼痛和僵硬感,但未证实其对骨性强直的进展有何影响。柳氮磺吡啶（SSZ）被证实治疗AS有效,主要适用于改善患者的外周关节炎。相当一部分AS患者采用常规的治疗难以控制症状,而且缺乏证据证实这些治疗可以抑制中轴关节病变的进展和改善疾病的预后。早在1973年就发现HLA-B27等位基因是目前已知的强直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis AS）的高危因素之一。比较流行的强直性脊柱炎的发病机制过程认为许多细菌携带与内源性的肽段相似的肽段,并能够作为一种交互反应的资源,通过分子模拟激活,在AS患者体内引发基于HLA-B27限制性的T细胞介导的的自身反应。激活的CD8+T细胞攻击关节组织处的自身抗原进一步加重慢性炎症。目前对HLA-B27在AS中的免疫病理作用形成了一些假说,与这一假说相互关联,根据基因分型多种免疫相关基因与强直性脊柱炎的风险的具有相关性。然而,尽管80%的强直性脊柱炎携带患者HLA-B 27,但在所有携带HLA-B 27的人群中只有1-5%的人表现为强直性脊柱炎。此外,多项研究显示突变和免疫调节基因的表达之间的关联,提示免疫调节机制可以防止或加剧疾病的发展。在小鼠模型和人类疾病中研究发现调节性B细胞具有可以控制过度炎症（excessive inflammation）和防止自身免疫性诱导（preventing autoimmune induction）的作用。在小鼠自身免疫模型中过继移植CD1dhiCD5+B大幅度降低T细胞介导的炎症。CD24+CD38+B抑制人体内病毒特异性的T细胞反应。调节性B细胞（1egulatory B cells）产生抑制自身免疫炎症反应的机制虽然目前也认为可能包括免疫抑制抗原呈递等其他机制,但是现在主要认为通过IL-10介导的。调节性B细胞在自身免疫性疾病和炎症性肠病的小鼠模型的作用发挥依赖于CD40信号。CD40在B细胞可以直接参与IL-10的产生。另外一个令人感兴趣的现象是,在其他一些自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosusSLE）和免疫系血小板减少性紫癜（immune thrombocytopenia ITP）相对于他们的正常人群而言,其CD24+CD38+B的调节功能存在缺陷。这些都暗示着在自身免疫性疾病中调节性B细胞功能存在着缺陷。在本篇论文中我们主要研究强直性脊柱炎中B细胞介导的免疫抑制功能。目的：1、调查强直性脊柱炎患者外周血中B细胞各个亚群的分部和比例。2、AS患者中分泌IL-10的主要B细胞亚群3、CD24+CD38+B细胞对CD8+T细胞的调节作用方法：1.病例选取：总共选取30例患者,其中15例强直性脊柱炎患者（10例男性,5例女性）,年龄在27到60岁之间。选择性别和年龄匹配的15名健康成年人作为对照（10例男性,5例女性）,年龄在25到65岁之间。所有强直性脊柱炎的患者诊断都按照修正的纽约标准诊断（modified New York criteria）。所有的强直性脊柱炎和健康对照组人群都是HLA-B27阳性。在强制性脊柱炎标本收集前患者没有使用非甾体类抗炎药（non-steroidal anti-inflammatory drug）和/或者抗风湿类缓解药物（disease-modifying anti-rheumatic drug）的治疗。本研究方案系经通过了山东省千佛山医院伦理委员会的同意后实施的,并且每位受试者在试验始前都被恰当地告知有关本项临床研究的目的、方法、预期效益、潜在危险及可能要承受的不适,自愿地签署知情同意书。外周血的单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells PBMCs）在病人诊断时抽取血液后通过Ficoll离心获得。新鲜细胞直接用于IL-10分泌和B细胞表面标志的检测;对于T细胞和B细胞培养,细胞在-80℃温度冰箱中冷藏至少1月,然后解冻在37℃ 5%CO2条件下过夜后备用。2.流式细胞技术细胞表面染色,PBMCs悬浮在FACS染色Buffer（PBS supplemented with 1% BSA,2nM EDTA and 0.1% sodium azide）中。细胞表面抗体包括抗人CD3、CD8、CD19, CD20, CD21, CD24、CD27、CD38

关键词： 髓系抑制性细胞   调节性B细胞   调控作用   免疫应答  

摘要： 髓系抑制性细胞(MDSC)是一群具有很强免疫抑制功能的细胞，在肿瘤和炎症等疾病的进展和转归过程中起着重要调节作用。但以往的研究主要集中于它们对T细胞和NK等细胞免疫应答的调控作用。它们对于B细胞的功能调控作用还不是十分清楚，尤其是对于调节性B细胞的分化调控作用目前尚未见报道。因此，本研究主要围绕MDSC对调节性B细胞的分化调控及相关的机制进行了探讨。<br>　　第一部分:MDSC诱导高分泌IL-10的B细胞产生<br>　　为了探讨MDSC能否诱导调节性B细胞的分化，我们将小鼠MDSC与不同刺激剂活化的B细胞（anti-IgM、可溶性CD40L、LPS）共培养，检测共培养后上清中IL-10的表达水平。结果发现，经LPS刺激后的B细胞与MDSC共培养后其上清中IL-10的分泌水平明显增高。接着我们通过胞内染色的方法分别检测了共培养前后B细胞及MDSC胞内IL-10表达水平的变化，结果发现共培养之后B细胞胞内IL-10的表达水平明显增高，而MDSC共培养前后IL-10的表达没有明显变化。随后我们将共培养体系中的MDSC与B细胞通过流式分选出来，分别提取其总RNA，利用qRT-PCR的方法检测其IL-10的表达，结果发现，共培养体系中的IL-10主要来源于B细胞。进一步的检测发现该群高分泌IL-10的B细胞表达独特表型即CD19hiFcγRⅡbhi。此外，我们通过流式分选出不同亚群的MDSC(粒系及单核系MDSC)，将其分别与LPS活化B细胞共培养，发现不论是粒系MDSC还是单核系MDSC均能诱导LPS活化B细胞高分泌IL-10。另外，我们分选出脾脏不同亚群的B细胞，经LPS活化后分别与MDSC共培养，结果发现，经MDSC诱导后，T1，T2，T3及MZB细胞均能够高分泌IL-10。在体内实验中，我们将CFSE标记的LPS活化B细胞，单独或与MDSC共同尾静脉注射小鼠，取小鼠脾脏，流式胞内染色法检测CFSE+B细胞分泌IL-10的情况，发现在与MDSC共注射的情况下，B细胞分泌IL-10的水平增强。以上结果说明:MDSC能够诱导高分泌IL-10的CD19hiFcγRⅡbhiB细胞产生。<br>　　第二部分:MDSC的CD19hiFcγRⅡbhi调节性B细胞的功能及其机制研究<br>　　为了研究MDSC诱导产生的高分泌IL-10的具有CD19hiFcγRⅡbhi表型的B细胞对T细胞是否具有调节功能，我们先通过流式将MDSC与B细胞共培养体系中CD19hiFcγRⅡbhi及CD19lowFcγRⅡblowB细胞分选出来，分别与带有CFSE标记且经抗CD3/CD28活化的CD4+T细胞共培养，3天以后检测T细胞增殖情况。结果发现CD19hiFcγRⅡbhiB细胞能够明显抑制活化的CD4+T细胞增殖，且在共培养体系中加入IL-10的中和性抗体后，CD4+T细胞可恢复增殖，这一结果提示CD19hiFcγRⅡbhiB细胞可以通过其分泌的IL-10抑制活化T细胞增殖。另外，我们检测了CD19hiFcγRⅡbhiB细胞和CD19lowFcγRⅡblowB细胞对活化CD4+T细胞表面CD69分子表达的影响，结果发现CD19hiFcγRⅡbhiB和CD19lowFcγRⅡblowB细胞对CD69的表达均没有明显影响，以上结果提示CD19hiFcγRⅡbhiB细胞并非通过抑制T细胞活化，而是通过抑制已活化T细胞的增殖发挥调节作用。此外，我们还检测了CD19hiFcγRⅡbhiB细胞和CD19lowFcγRⅡblowB细胞对活化CD4+T细胞分泌IL-4及IFN-γ的影响，结果发现（数据未显示），CD19hiFcγRⅡbhiB和CD19lowFCγRⅡblowB细胞不能影响CD4+T细胞向Th1及Th2方向的分化。<br>　　在对机制的研究上，首先我们利用transwell系统将MDSC与B细胞隔离，共培养48h后检测上清中IL-10的分泌情况，结果发现，MDSC诱导B细胞产生IL-10。此外，将MDSC培养上清与LPS活化B细胞共培养后，与单独的LPS活化B细胞相比，IL-10的水平也没有明显变化。我们探索了MDSC上哪些膜分子参与诱导了调节性B细胞高分泌IL-10。已有研究表明:CD40L-CD40通路在调节性B细胞的分化中起到着重要作用。通过流式检测我们发现， MDSC表面表达CD40L分子，B细胞表面表达CD40分子，且B细胞经LPS活化后其表面CD40的表达量增加，另外，在B细胞中加入可溶性CD40L可使其上清中IL-10的表达水平增高。下一步我们将用CD40-/-小鼠的B细胞与CD40L-/-小鼠的MDSC共培养，检测上清及胞内IL-10的分泌情况，从而明确CD40L-CD40通路在MDS

关键词： 急性呼吸窘迫综合征   急性肺损伤   调节性T细胞   高迁移率族蛋白B1   Toll样受体4  

摘要： 目的:探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)通过Toll样受体4(TLR4)介导小鼠急性肺损伤时CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)免疫功能及免疫抑制活性的变化;研究CD4+CD25+Treg与CD4+CD25-T细胞相互作用的影响。方法:分别给健康清洁级C57BL/10J和C57BL/10Sc[分别为TLR4野生型(TLR4+/+)和敲除型(TLR4-/-)]小鼠气管内注射HMGB1(20μg/只)为实验组,同时设立气管内注射生理盐水野生型小鼠为对照组;(1)于造模后饲养48小时眼球取血法法处死小鼠收集血清及肺泡灌洗液(BALF),光镜下观察肺脏病理改变,称重测定肺脏干湿比;采用免疫磁珠分离脾脏CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-T细胞。(2)将各组部分CD4+CD25+Treg体外培养24小时后,采用流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg表达叉头翼状螺旋转录因子(FOXP3)和淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的表达强度,并且用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测BALF中白细胞介素-1(IL-1),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及CD4+CD25+Treg分泌的白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-β(TGF-β)的含量。(3)将各组CD4+CD25+Treg与对照组CD4+CD25-T细胞按1:1比例共培养,包被CD3单抗和可溶性CD28单抗辅助活化;CCK-8法检测CD4+CD25+Treg对CD4+CD25-T细胞增殖的抑制作用。并采用ELISA法检测共培养体系中分泌的白细胞介素-4(IL-4)、IL-2和干扰素-γ(IFN-γ)的含量。结果:1、与对照组相比,两实验组小鼠气管内注射HMGB1后,肺组织损伤程度明显严重,肺脏干湿比值及BALF灌洗液中TNF-α,IL-1含量显著增高,且TLR4野生型小鼠较TLR4敲除型小鼠病变程度更加严重;2、流式细胞学检测免疫磁珠分选的CD4+CD25+Treg纯度在90%以上;TLR4野生型急性肺损伤小鼠FOXP3和CTLA-4表达强度低于对照组和TLR4敲除型(P<0.05);野生型实验组小鼠Treg分泌的IL-10及TGF-β含量较对照组含量降低(P<0.05),而TLR4敲除型较对照组IL-10及TGF-β含量升高(P<0.05);3、经CD3和CD28辅助活化后,TLR4野生型急性肺损伤小鼠CD4+CD25+Treg与效应T细胞共培养上清中,IL-2,IFN-γ含量高于对照组(P<0.05),IL-4含量低于对照组(P<0.05),提示CD4+CD25+Treg可使T细胞极化Th2细胞能力减弱,向Th1细胞方向极化;而TLR4敲除型急性肺损伤小鼠CD4+CD25+Treg与效应T细胞共培养上清中,IL-2,IFN-γ含量低于对照组(P<0.05),IL-4含量高于对照组(P<0.05),CD4+CD25+Treg介导的免疫抑制效应促使T细胞极化为Th2细胞,引起Th1/Th2的漂移。结论:1、气管内注射HMGB1可以诱导小鼠急性肺损伤模型;2、免疫磁珠分选的CD4+CD25+Treg细胞纯度较高,可以满足后续实验的要求;3、在急性肺损伤时HMGB1可通过TLR4下调CD4+CD25+Treg的免疫功能,使CD4+CD25+Treg中Foxp3和CTLA-4分子的表达下调,从而减弱其免疫抑制功能的发挥;4、在急性肺损伤时HMGB1可通过TLR4使CD4+CD25+Treg极化Th2细胞能力减弱,向Th1细胞方向极化,弱化了CD4+CD25+Treg的功能,影响炎症反应的结局;为ARDS开辟新的治疗靶点。

关键词： 他汀   树突状细胞   实验性自身免疫性重症肌无力   体液免疫   滤泡辅助性T细胞   调节性B细胞   ROCK抑制剂   生发中心   抗体  

摘要： 研究背景：重症肌无力(Myasthenia gravis, MG)是一种由抗体介导、T细胞依赖、补体参与的经典的器官特异性自身免疫性疾病,由于神经肌肉接头突触后膜上的乙酰胆碱受体损伤而导致神经肌肉接头处传递功能障碍。目前临床上针对重症肌无力的免疫治疗主要包括糖皮质激素和免疫抑制剂,因其缺乏特异性,且需要长期应用,副作用较大,因此促使我们探索新的治疗策略和方法。树突状细胞(dendritic cells, DC)是体内最重要的专职抗原提呈细胞,根据其成熟状态的不同,既可以诱导免疫反应,也可诱导免疫耐受。他汀类药物是临床常用的抗动脉粥样硬化药物,近来研究发现其作用机制除降低血脂外,更重要的是其抗炎及免疫调节作用。我们的前期研究发现,应用阿托伐他汀在体外修饰脾脏来源的树突状细胞,可诱导树突状细胞呈不成熟状态。给实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG)大鼠腹腔注射这些不成熟DC,可缓解EAMG的发展,减少抗体的产生。其机制主要是抑制了EAMG的细胞免疫反应,表现为抑制淋巴细胞增殖,上调调节性T细胞,使Th1/Th17细胞反应转化为Th2细胞反应。然而,他汀修饰的DC减少抗体产生的具体机制仍不明确,尤其是对体液免疫反应的影响及作用机制仍有待进一步研究。近来研究发现一群以CXCR5 (CXC chemokine receptor 5, CXC趋化因子受体5)、ICOS (inducible T-cell costimulator,诱导性协同刺激分子)、PD-1 (programmed death protein-1,程序性死亡受体1)、Bcl6 (B-cell lymphoma 6, B细胞淋巴瘤因子6)及IL-21为特征的新的细胞亚群,即滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cells, Tfh)。Tfh直接辅助B细胞产生抗体,在体液免疫反应过程中发挥重要作用,因此在很多自身免疫性疾病的研究中备受关注。另外,调节性B细胞(regulatory B cells, Breg)作为一群发挥负性调节作用的B细胞,其发现挑战了B细胞提呈抗原和分泌抗体的传统观点。因此,耐受性DC对EAMG大鼠的Tfh和Breg的影响也是本研究关注的重点。研究目的：探讨阿托伐他汀修饰的骨髓源性DC对EAMG体液免疫的调节及机制。研究方法：1. EAMG模型的建立及临床评分用大鼠来源的AChRα亚基97-116肽段(R97-116)免疫Lewis大鼠,第11天加强免疫一次,建立EAMG模型。采用双盲法隔天进行观察并评分,评分标准参考Lennon评分方法,结果以每个时间点的平均数表示。2.骨髓源性DC的诱导、培养与表型检测无菌条件下取免疫后20天的EAMG大鼠的胫骨和股骨,冲洗骨髓腔得到骨髓细胞悬液,去除红细胞后接种于培养瓶中。贴壁3天,去除悬浮细胞后继续培养。第8天加入药物处理,他汀组(AT-BMDC)加入阿托伐他汀(10 μM),对照组(0-BMDC)加入等体积的DMSO (dimethysulfoxide,二甲基亚砜)。48 h后收集悬浮细胞,经流式细胞仪检测表面CD80、CD86及MHCII分子的表达情况。3. EAMG大鼠的分组与治疗将15只大鼠随机分为3组(5只／组),在免疫后第5天及第16天各给予一次腹腔注射治疗。AT-BMDC组给予他汀处理的DC(1×106个／只),0-BMDC组给予未用他汀处理的DC(1×106个／只),EAMG组给予等体积的1640培养基。4. ELISA检测抗体数量及亲和力于免疫后第43天处死大鼠,取心脏血,离心取血清。用R97-116肽段包板,采用ELISA方法检测血清中抗R97-116抗体的数量,用硫氰酸盐洗脱法检测抗体的亲和力。5.免疫荧光法检测脾脏中的生发中心免疫后第43天处死大鼠,取新鲜脾脏,液氮速冻后-80℃冰箱冻存。OCT包埋后切片,用PNA (peanut agglutinin,花生凝集素)染色,PNA+细胞代表生发中心内的B细胞。6.流式细胞术检测淋巴结单个核细胞中的Tfh、IL-21+细胞及Breg取大鼠腹股沟淋巴结制备单细胞悬液,加入CD4、CXCR5、ICOS抗体检测Tfh细胞,加入CD19、IL-10抗体检测B10细胞,加入CD19、Foxp3抗体检测B-Foxp3 细胞。另外,用IL-21抗体检测IL-21+细胞。标记完成后经流式细胞仪检测。7.统计学分析应用SPSS17.0软件对资料进行统计分析,应用单因素方差分析(one-factor analysis of variance, ANOVA)或Kruskal-Wallis秩和检验进行组间比较,p<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1.阿托伐他汀

关键词： 肝移植   西罗莫司   调节性B细胞   调节性T细胞   免疫功能  

摘要： 目的:1.筛选影响肝移植受者术后外周血淋巴细胞亚群的临床因素，并探讨相应临床因素下免疫抑制剂的调整策略。2.通过体内及体外实验深入研究西罗莫司提高肝移植术后患者外周血中调节性B细胞(regulatory B cell，Breg)和调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)比值的作用。3.通过采用对人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）培养的方式深入研究Breg在西罗莫司扩增Treg中的协同作用。<br>　　方法:实验一:应用流式细胞技术调查临床肝移植术后患者外周血淋巴细胞亚群状态，通过回归分析筛查影响淋巴细胞亚群的相关临床因素，探讨根据相关临床因素制定个性化免疫抑制方案的可行性。实验二:通过流式细胞技术检测肝移植术后将他克莫司部分转换为西罗莫司抗排异的患者药物转换前后外周血Breg和Treg的变化，并与同时期未应用西罗莫司的患者进行对比，明确西罗莫司对患者外周血Breg和Treg的扩增作用。实验三:采用西罗莫司体外刺激人PBMCs的方法，进一步证实西罗莫司对Breg和Treg的扩增作用，同时通过西罗莫司对剔除B细胞的PBMCs刺激的结果，以及加入细胞因子TGF-β1和IL-10后西罗莫司对剔除B细胞的PBMCs刺激结果，试图证实Breg在西罗莫司刺激Treg增殖的过程中起协同作用。<br>　　结果:1.既往曾发生排斥反应、脾脏机能亢进和术后应用西罗莫司是导致肝移植术后受者外周血中部分淋巴细胞亚群存在差异的三个主要临床因素。既往曾出现排斥反应的患者外周血中CD8+T细胞百分比高于未曾发生排斥反应的患者(P＜0.01)，而Breg百分比低于未发生排斥反应患者(P＜0.05);脾脏机能亢进可以提高Breg和Treg的百分比（P＜0.01和P＜0.01），而减少CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞和NK细胞的绝对值（P＜0.01， P＜0.01， P＜0.01，和P＜0.01）;术后应用西罗莫司可以提高Breg和Treg的百分比（P＜0.01和P＜0.01），同时还可以提高Breg和Treg的绝对值（P＜0.05和P＜0.05）。2.肝移植患者术后将他克莫司部分转换为西罗莫司抗排异治疗后第7天，外周血Breg和Treg比值明显升高（P＜0.05和P＜0.05），转换后第30天升高更为明显（P＜0.01和P＜0.01）;与同时期未应用西罗莫司的患者比较，转换后第7天，Treg比值明显高于对照组(P＜0.05)，转换后第30天，Breg和Treg比值均高于对照组（P＜0.05和P＜0.01）。3.西罗莫司可以在体外PBMCs培养中使TGF-β1+ Breg和IL-10+ Breg占B细胞的比值以及Treg占T细胞的比值增高，同时可以刺激Breg相关的细胞因子TGF-β1和IL-10的分泌;在剔除B细胞后，西罗莫司对Treg的扩增作用和对细胞因子的刺激作用均减弱;而在剔除B细胞的PBMCs中加入适量TGF-β1和IL-10后，西罗莫司对Treg的扩增作用得以恢复。<br>　　结论:1.肝移植术后既往曾出现排斥反应、脾脏机能亢进和术后应用西罗莫司是引起部分淋巴细胞亚群差异的主要因素，脾机能亢进患者可以适当减低免疫抑制剂用量，既往曾经出现排斥反应患者需适当增加免疫抑制剂用量。2.肝移植术后将他克莫司部分转换为西罗莫司抗排异治疗可以明显增加患者外周血Breg和Treg的比值。3.西罗莫司与健康受试者外周血PBMCs体外共培养亦可以明显扩增Breg和Treg，Breg可能在西罗莫司扩增Treg过程中起协同作用。

关键词： 过敏性紫癜   调节性B细胞   免疫平衡   细胞病理学  

摘要： 本文对CD40/CD40L信号通路调控调节性B细胞在HSP和HSPN中的作用机制进行了研究。本研究分为两个部分：　　第一部分：调节性B细胞对HSP和HSPN患儿Th17/Treg免疫平衡的影响。过敏性紫癜（HSP）是儿童时期最常见的自身免疫性血管炎，并发肾脏损害时称为紫癜性肾炎（HSPN）。大量研究显示CD4+T细胞亚群（Th1，Th2，Th17和Treg）功能紊乱参与儿童HSP的发生发展，包括 Th1/Th2的免疫失衡和 Th17/Treg的免疫失衡。同时，有研究指出Th17/Treg的免疫失衡与HSPN肾脏损害的严重程度密切相关。而目前尚无研究中心就不同肾脏累及程度的 HSPN患儿进行分组详细讨论Th17、Treg细胞比例及 Th17/Treg比值在其中的具体变化。调节性 B细胞作为一群能通过分泌IL-10调控CD4+T细胞免疫反应的负向调节性免疫细胞，参与影响Th17/Treg的免疫平衡，在多种自身免疫性疾病中得到了普遍研究，如系统性红斑狼疮（SLE），风湿性关节炎（RA），炎症性肠病（IBD）等，但是其在儿童 HSP及 HSPN中是否能影响Th17/Treg的免疫平衡，进而在 HSP的发生和HSPN肾脏损害及预后中发挥作用，目前尚不清楚。因此本研究通过检测HSP及HSPN患儿外周血Th17、Treg细胞的比例和Th17/Treg比值的变化，调节性B细胞及其两个亚群(CD19+CD24hiCD38hiB细胞和CD19+CD24hiCD27+B细胞)在其中的比例变化及其与Th17、Treg和Th17/Treg的相关性分析，初步探索调节性B细胞对Th17/Treg免疫平衡的影响。　　目的：探讨调节性B细胞水平、功能异常可能通过影响Th17/Treg免疫平衡在HSP和HSPN的发生发展及转归中发挥作用。　　方法：选取确诊的HSP及HSPN患儿76例，根据肾脏累及情况分为以下几组：无肾脏累及组20例（Group A），单纯镜下血尿组12例（Group B），单纯少量蛋白尿组17例（Group C），血尿合并少量蛋白尿组15例（Group D），大量蛋白尿组12例（Group E）;HSP/HSPN缓解期患儿（皮疹、腹痛、关节痛、血尿、蛋白尿等症状消失）16例（Group F），健康对照者16例（Control）。采用流式细胞术检测外周血中CD19+CD24hiCD38hiB细胞、CD19+CD24hiCD27+B细胞，Th17细胞和Treg细胞的百分比，以及CD19+B细胞、CD19+CD24hiCD38hiB细胞和CD19+CD24hiCD27+B细胞IL-10的表达水平;同时对B10细胞及其两个亚群与Th17细胞、Treg细胞和Th17/Treg的比值进行相关性分析。　　结果：与Control组相比，Group A, B, C, D, E组中Th17细胞的比例明显升高（P<0.05）;Treg细胞的比例明显降低（P<0.05）;Th17/Treg的比值明显升高（P<0.05）;Group B, C, D, E中CD19+CD24hiCD38hiB细胞的比例和B10细胞、CD19+CD24hiCD38hiB、CD19+CD24hiCD27+B细胞分泌 IL-10的水平显著降低（ P<0.05）;Group D， E中CD19+CD24hiCD27+B细胞的比例显著降低（P<0.05）。与Group A相比， Group D, E中Th17细胞的比例、Th17/Treg的比值明显升高（P<0.05）;B10、CD19+CD24hiCD38hiB细胞的比例及分泌 IL-10的水平明显降低（P<0.05）;GroupE中Treg细胞、CD19+CD24hiCD27+B细胞及其IL-10的分泌水平显著降低（P<0.05）。Group F组中上述指标与 Control和Group A相比均无明显统计学差异（P>0.05）。B10、CD19+CD24hiCD38hiB和CD19+CD24hiCD27+B细胞与Th17细胞以及Th17/Treg的比值呈显著负相关（ P<0.05）， B10和 CD19+CD24hiCD38hiB细胞与CD4+CD25+Treg细胞呈显著正相关（P<0.05）。　　结论：B10细胞及其两个亚群水平及功能异常（分泌IL-10的能力降低）可能参与HSP/HSPN的Th17/Treg免疫失衡。　　第二部分：CD40/CD40L信号通路-调节性B细胞-Th17/Treg轴参与HSP和HSPN发生发展及转归。除了细胞免疫功能紊乱，大量研究表明HSP患儿体内也存在体液免疫功能紊乱，表现为血浆中IgA水平明显增高和血管壁IgA循环免疫复合物的沉积。而 CD40-CD40L，作为特异性免疫系统中重要的一对共刺激分子，其在诱导

关键词： 胶质瘤   外泌体   调节性B细胞   TGF-β   免疫逃避  

摘要： 侵袭和转移是恶性肿瘤的重要生物学标志,也是导致肿瘤治疗失败和复发的重要原因之一。高度侵袭性是恶性胶质瘤的重要病理学特征,瘤体边界不清致使手术完整切除难度增大,从而导致肿瘤很快复发,这是患者预后差,复发率、死亡率高的主要原因。脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,国内脑胶质瘤的发生率占颅内肿瘤的35%0%,5年生存率仅为20%0%,是神经外科临床工作中面临的最严重的肿瘤之一。对脑胶质瘤的治疗措施,传统上仍然以手术为最重要的手段,但由于胶质瘤多为浸润型生长,单纯的手术治疗后,很容易复发,疗效并不能使人满意。由于肿瘤细胞存在放疗抗拒,术后放疗尚不能杀灭残余的肿瘤细胞,因此研究肿瘤细胞是通过怎样的机制逃避放疗的杀伤和如何降低此种机制的作用,对提高放疗在胶质瘤治疗中的疗效有很大的必要性。肿瘤细胞的免疫逃避是指其通过多种方式逃避机体的免疫识别和攻击,例如:细胞表面标志物的改变,包括肿瘤细胞表面的MHCⅠ类分子表达下降或者缺失、肿瘤抗原的变异、FAS系统的作用、B7分子的表达异常等。肿瘤来源的免疫抑制因子:如IL-10、VEGF、TGF-β等,其可以影响DC细胞及T细胞的成熟活化。肿瘤微环境诱导T细胞功能障碍,其中主要是通过受体/配体结合的方式释放抑制性的信号,降低T细胞的功能。T细胞功能的障碍,会导致机体免疫减弱。PIGF在癌变的情况下会引起高表达,同时它的相关受体VEGFR1的表达也会提高。PIGF在多种肿瘤中明显上升,可以作为某些癌症的指标性物质。PIGF不仅可以刺激血管源细胞形成新血管,而且PIGF可以直接作用于肿瘤细胞,损伤DC细胞,从而促进肿瘤的生长,也可以刺激骨髓中血管生成祖细胞转移向肿瘤病灶。加入PIGF抗体在体内不仅可以阻止新血管的生成,还可以刺激已生成血管的退化。最近研究报道显示PlGF也参与了神经胶质瘤的病理和免疫调节过程。我们假设胶质瘤分泌的PlGF通过外泌体作用于胶质瘤病灶微环境中的B细胞,使B细胞能够表达TGF-β,转化为TGF-β(+)的Bregs细胞,Bregs细胞可以特异性的抑制胶质瘤患者CD8(+)T细胞的增殖和活性,从而胶质瘤细胞逃避免疫监视向正常组织侵袭扩散。通过本研究证明:1从胶质瘤组织中分离纯化的恶性胶质瘤细胞(whoⅢ级)在体外培养后,细胞内plgfmrna和蛋白有表达,当用不同浓度的pma刺激后plgf随其浓度增加而增加。表明恶性胶质瘤细胞中有plgf表达。2密度梯度离心分离胶质瘤细胞上清中的外泌体,lamp-1特异性验证外泌体后,裂解外泌体后可检测出plgf蛋白,表明胶质瘤细胞可以表达plgf,并且其外泌体中也含有plgf蛋白3正常人全血中分离获得na?veb细胞(cd19+il-7r+cd45+),将收集的胶质瘤外泌体用csfe标记后与na?veb细胞共培养,免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜观察发现na?veb细胞可以捕获胶质瘤外泌体;进一步将捕获胶质瘤外泌体的na?veb细胞,用单价plgf和其抑制剂的na?veb细胞为对照,结果显示:不同浓度外泌体刺激的b细胞随外泌体浓度的升高tgf-βmrna和蛋白都增高,单加plgf也可使na?veb细胞表达tgf-β增加。表明携带plgf的胶质瘤外泌体可以被naiveb细胞捕获,捕获后的na?veb细胞可特异表达tgf-β,且与plgf调控有关;即携带plgf的外泌体可以将胶质瘤病灶微环境中na?veb细胞转化为tgf-β(+)bregs细胞。4将胶质瘤组织中分离的b细胞、胶质瘤患者外周血中的b细胞以及刺激转化的tgf-β(+)bregs细胞分别用csfe标记,提取胶质瘤组织内含物,10mg/ml的胶质瘤组织提取物分别刺激三种获得的b细胞,以10mg/mlbsa为阴性对照,5%co237℃孵箱培养3天后流式检测三种b细胞增殖程度,结果表明:91.2%的组织来源b细胞增殖和8.14%的外周血b细胞增殖,约有60.8%的bregs细胞得到增殖,结果显示增殖的b细胞具有胶质瘤特异性,胶质瘤特异性bregs细胞可能存在胶质瘤组织和胶质瘤患者的外周循环系统中5从胶质瘤患者全血中密度梯度离心分离pbmc后,接种75cm细胞培养瓶中培养2h后,将贴壁细胞与非贴壁细胞分开培养,加入不同细胞刺激因子培养7天获得dc细胞和t细胞,再采用磁珠法分离纯化cd8(+)cd25(-)t细胞。将获得的cd8(+)cd25(-)t细胞用csfe标记后,按30万:20万比例与dc细胞混合接种于96孔细胞培养板中,10mg/ml胶质瘤组织提取物,阴性对照加入10mg/mlbsa,然后加入20万诱导bregs细胞、naiveb细胞以及诱导bregs细胞先与胶质瘤提取物培养后刺激3天,不加b细胞为对照。结果显示:,流式细胞结果以csfe标记细胞设门,bsa刺激的cd8+t细胞增殖2.18%,胶