关键词： Foxd3   白细胞介素-10   调节性B细胞   红斑狼疮小鼠  

摘要： IL-10+调节性B细胞（Breg）通过分泌白介素-10（IL-10）在抑制过度炎性反应方面起到重要作用。然而调节性B细胞因在体内含量少,没有特异性表面标记,没有特异性转录因子,和分化发育机制不清楚等限制其将来临床应用。为了进一步深入研究调节性B细胞的分化发育机制,本研究首先关注了一个关键的科学问题:哪些转录因子能有效地调控调节性B细胞关键的标志性分子—IL-10的表达?目的:分析IL-10启动子上转录因子结合位点,检测Foxd3（经预测是结合在IL-10启动子上得分最高和结合位点最多的一个转录因子）在调节性B细胞中与IL-10分泌的相关性,阐明“Foxd3在调节性B细胞分化、发育、扩增及功能中的作用及机制”,并为靶向Foxd3信号通路促使调节性B细胞扩增及其对自身免疫病治疗提供理论及实验依据。方法:（1）通过两个网站为基础的预测软件,对IL-10启动子上转录因子结合位点进行分析;（2）应用染色质免疫共沉淀-PCR技术验证Foxd3是否能够直接结合在IL-10启动子上;（3）应用基因突变技术进一步证实Foxd3与IL-10启动子结合的具体相互作用位点;（4）通过双荧光素酶报告系统分析Foxd3是否调节IL-10启动子的活性;（5）应用实时定量PCR和免疫印迹技术检测LPS活化的B细胞中Foxd3的mRNA水平和蛋白水平表达;（6）应用Foxd3特异性shRNA敲低B细胞中Foxd3的表达,检测Foxd3表达降低是否影响IL-10的表达;（7）通过流式细胞术、酶联免疫吸附实验和免疫印迹技术,检测系统性红斑狼疮小鼠B细胞中Foxd3和IL-10表达的相关性。结果:（1）对小鼠IL-10启动子上转录因子结合位点进行分析,发现Foxd3是与IL-10启动子结合最强（得分最高）和最多（结合位点最多）的转录因子;（2）染色质免疫共沉淀-PCR技术鉴定出Foxd3能结合在IL-10启动子上游-1400bp位置;（3）通过构建截短型IL-10启动子,证明Foxd3通过与IL-10启动子结合位点p4（-1413）结合;通过构建截短型Foxd3蛋白,证实Foxd3通过一个N末端结构域结合在IL-10启动子上;（4）双荧光素酶报告系统分析显示,Foxd3能有效地抑制IL-10启动子的功能;（5）实时定量PCR和免疫印迹技术证实LPS活化的B细胞高表达Foxd3 mRNA和蛋白,并且Foxd3的表达随着LPS的刺激呈时间依赖性增加;（6）实时定量PCR、免疫印迹技术、流式细胞术和酶联免疫吸附实验检测结果显示Foxd3低表达的IL-10+调节性B细胞中IL-10的表达升高;（7）流式细胞术、酶联免疫吸附实验和免疫印迹技术结果表明,系统性红斑狼疮小鼠B细胞中Foxd3表达量升高而IL-10+调节性B细胞降低。结论:本研究表明无论是在体内还是体外,活化的B细胞上调Foxd3的表达。Foxd3通过直接结合IL-10的启动子,限制IL-10启动子的激活,进而抑制IL-10+调节性B细胞的产生。自身免疫病小鼠B细胞高表达Foxd3进而降低调节性B细胞的产生。这样,转录因子Foxd3通过抑制B细胞中白介素-10的表达抑制调节性B细胞的产生。这项研究不仅阐明了Foxd3抑制调节性B细胞产生的机制,而且为以Foxd3为潜在靶点诱导调节性B细胞产生来治疗自身免疫病的新方法奠定前期基础。因此,这项研究既丰富了调节性B细胞分化发育的基本理论又为调节性B细胞的可能应用奠定了坚实基础。

关键词： IL-28B   宫颈癌   Treg   移植瘤   Ppic9k  

摘要： 目的:1.构建小鼠U14宫颈癌皮下移植瘤模型,评价腺病毒介导的白介素28B联合3-溴丙酮酸对小鼠宫颈癌移植瘤的影响及其抗肿瘤作用的研究。2.应用克隆技术将IL-28B的基因序列构建于真核表达载体上。方法:1.（1）培养小鼠U14宫颈癌细胞及HEK293细胞;（2）利用HEK293细胞对Ad-IL-28B及Ad-EGFP扩增;采用CPE法测定Ad-IL-28B及Ad-EGFP的滴度;（3）建立Babl/C小鼠U14的宫颈癌的腹水模型,抽取腹水进行皮下移植瘤的种植;（4）待移植瘤直径达3mm应用随机数字表对实验小鼠进行完全随机分配成5组,包括IL-2、Ad-mIL-28B、3-溴丙酮酸、3-溴丙酮酸+Ad-mIL-28B、Ad-EGFP及PBS组,观察移植瘤的大小变化,并计算其抑瘤率;（5）20天后处死,分离实验小鼠的脾脏,将各组小鼠的脾脏进行研磨,通过流式细胞术检测脾脏中的细胞因子CD4+CD25+Fox P3+Tregs的变化情况。2.通过分子克隆技术,构建真核表达蛋白Ppic9k-IL-28B,使其在BMMY培养基中稳定表达并优化蛋白表达条件。结果:1.腺病毒介导的白介素28B联合3-溴丙酮酸对小鼠宫颈癌移植瘤的治疗作用。（1）采用CPE法测定Ad-mIL-28B以及Ad-EGFP的滴度均为108PFU/100ul。（2）成功建立了实验小鼠的腹水模型及皮下移植瘤模型。（3）Ad-mIL-28、IL-2、3-溴丙酮酸、3-溴丙酮酸+Ad-mIL-28B组处理后的实验小鼠的脾脏中的CD4+CD25+FoxP3+Tregs在淋巴细胞中所占比例分别为7.66%、5.69%、6.63%、2.64%,三溴丙酮酸+Ad-mIL-28B组与PBS组相比明显减少。（4）Ad-mIL-28、IL-2、3-溴丙酮酸、3-溴丙酮酸+Ad-mIL-28B组的肿瘤抑瘤率分别为59.18±16.89、62.57±16.28、75.28±3.37、79.23±3.82,3-溴丙酮酸+Ad-mIL-28B组小鼠的抑瘤率明显高于PBS组。2.（1）成功构建了重组质粒Ppic9k-IL-28B。（2）建立了重组质粒Ppic9k-IL-28B的表达方法。结论:1.腺病毒介导的白介素28B联合3-溴丙酮酸对Treg细胞因子有下调的作用。腺病毒介导的白介素28B联合3-溴丙酮酸对小鼠移植瘤有抑制作用。2.将IL-28B导入Ppic9k表达载体后,毕赤酵母GS115表达菌接受信号肽,IL-28B蛋白能正常的折叠和加工,正确的进行表达。成功构建出Ppic9k-IL-28B,并能在稳定的条件下将Ppic9k-IL-28B蛋白稳定表达。

关键词： 视神经脊髓炎谱系疾病   调节性B细胞   系统性自身抗体  

摘要： 【目的】视神经脊髓炎谱系疾病(neuromyelitis optica spectrum disorders,NMOSDs),是一组慢性中枢神经系统免疫性疾病,以视神经与脊髓受累为主。这组疾病的流行病学特点为全球分布,青中年女性好发,有较高的致残率和一定的致死率。随着水通道蛋白4(AQP4)抗体及其致病特点的发现,目前认为体液免疫机制介导的中枢神经系统星形胶质细胞脱髓鞘是主要的病理改变。经典免疫学认为活化的B细胞的主要功能是分泌产生抗体以及作为抗原提呈细胞(APC)激活效应性T细胞。最先在实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)的小鼠模型中发现了B细胞亚群具有免疫调节功能。具有免疫调节功能的这群细胞被命名为调节性B细胞(regulatory B cells,Bregs),深入研究发现Bregs的负性免疫调节作用与其IL10因子的分泌有关,并能改变Th1/Th2细胞平衡,在自身免疫性疾病的发生发展中起重要作用。目前对于调节性B细胞在神经系统疾病中的研究尚少,本研究通过比较分析视神经脊髓炎谱系疾病患者与健康对照外周血调节性B细胞的百分数、相关细胞因子水平,揭示了调节性B细胞在视神经脊髓炎谱系疾病发生、发展中的重要作用。【方法】本研究选取2015年9月至2016年9月之间就诊于厦门大学附属第一医院神经内科的NMOSDs患者26例,并同期选取年龄性别匹配的健康对照27例。所有患者按2015年最新版NMOSDs诊断标准经两位神经内科医师诊断,其中包括两例视神经炎以及六例复发性长节段横贯性脊髓炎。所有对象在采血前三个月内均未使用大剂量静脉激素冲击、环磷酰胺、硫唑嘌呤、单克隆抗体等免疫抑制剂治疗。收集病例组与对照组血液样本后以流式细胞术检测病例组与对照组外周血CD19+CD24hiCD38hi细胞百分率,并以酶联免疫吸附法(ELISA)检测病例组与对照组血浆中水通道蛋白4(AQP4)抗体、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)抗体水平以及细胞因子IL6、IL10水平。通过比较初步探讨调节性B细胞在视神经脊髓炎谱系疾病中的功能与作用。【结果】NMOSDs组患者外周血CD19+CD24hiCD38hi细胞占CD19+细胞百分率(0.648±0.358)较健康对照组(0.878±0.267)明显下降(P=0.0099);NMOSDs组患者水通道蛋白4抗体浓度(57.80±16.15 ng/mL)较健康对照组(26.21±5.557ng/mL)明显升高(P=0.036);NMOSDs组患者血浆IL10细胞因子水平(1.88±0.51)较健康对照组(2.40±0.80)明显下降(P=0.009);NMOSDs组患者血浆IL6细胞因子水平(7.550±0.7133)较健康对照组(5.433±0.6779)明显升高(P=0.0363);患者组外周血CD19+CD24hiCD38hi百分数与血浆IL10细胞因子水平存在相关性(P=0.0213,r2=0.2020)。伴自身抗体谱异常患者与不伴自身抗体谱异常的患者比较,血浆IL6因子水平升高(P=0.0165),外周血CD19+CD24hiCD38hi细胞占CD19+细胞百分率、血浆IL10因子水平的差异均无统计学意义(P>0.05)。血清AQP4抗体阳性NMOSDs患者与血清AQP4抗体阴性患者在外周血CD19+CD24hiCD38hi Bregs细胞百分率、血浆IL10因子水平、血浆IL6因子水平上的差异均无统计学意义(P>0.05)。【结论】视神经脊髓炎谱系疾病患者较健康对照存在外周血CD19+CD24hiCD38hi调节性B细胞数量下降,IL10细胞因子水平下降,IL6细胞因子水平升高,提示体液免疫平衡紊乱是视神经脊髓炎谱系疾病的主要发病机制之一,外周血调节性B细胞水平可能可以作为监测疾病复发、指导治疗的生物标记物。

关键词： 多发性硬化   B淋巴细胞   调节性B细胞   过渡型B细胞   浆母细胞  

摘要： 目的通过检测多发性硬化患者与正常对照组调节性B细胞等相关B淋巴细胞占总B淋巴细胞百分率差异,并且分析患者不同临床严重度与调节性B细胞的相关性,探讨各B淋巴细胞亚群在多发性硬化中的潜在作用。方法收集从2016年7月到2017年3月入蚌埠医学院第一附属医院神经内科住院的多发性硬化患者(n=12,男8例,女4例,年龄41.42±4.53岁)及同期门诊体检的无神经系统或免疫系统疾病的健康者(n=12,性别、年龄均与多发性硬化组匹配)外周静脉血样本,并对所有多发性硬化患者进行EDSS伤残评分。采用流式细胞仪检测患者及对照组外周静脉血中CD19+CD24hi CD38hi细胞、CD19+CD27-CD38hi细胞、CD19+CD27hi CD38hi细胞占B淋巴细胞总数的百分率,酶联免疫吸附测定患者及对照组外周静脉血中IL-10水平。分析比较两组的B淋巴细胞亚群差异及MS组CD19+CD24hi CD38hi细胞比例与EDSS是否具有线性相关。结果多发性硬化患者外周血调节性B细胞(CD19+CD24hi CD38hi)及过渡型B细胞(CD19+CD27-CD38hi)占总B淋巴细胞的百分率及IL-10水平与对照组之间差异有统计学意义(P<0.05),多发性硬化患者外周血调节性B细胞、过渡型B细胞及IL-10水平均降低。多发性硬化患者浆母细胞(CD19+CD27hi CD38hi)占总B淋巴细胞的百分率与对照组相比无统计学意义(P>0.05)。临床严重性EDSS评分不同的多发性硬化患者与其调节性B细胞表达率无统计学差异(P>0.05)。结论MS患者发病期调节性B细胞及过渡型B细胞表达降低伴随IL-10减少,B淋巴细胞参与多发性硬化的发病。调节性B细胞表达降低与临床严重度可能无关。

关键词： 芒果甙   调节性B细胞   白细胞介素-10   炎症因子   抗氧化通路   动物模型   移植物抗宿主病  

摘要： 目的：在体外实验中研究芒果甙（MA）对小鼠脾脏单个核细胞（MNCs）中的调节性B细胞(Bregs)、调节性T细胞(Tregs)、炎症因子、Nrf2抗氧化通路水平的影响，以及MA对小鼠脾MNCs的细胞毒性作用，初步探讨芒果甙抗慢性移植物抗宿主病（cGVHD）的作用机制。　　方法：用Ficoll密度梯度离心法分离小鼠脾脏的MNCs，用MA进行干预，分组如下：（1）对照组：用等浓度溶剂DMSO培养基培养;（2）实验组：不同浓度MA处理MNCs（50uM、100uM、150uM、200uM）。用流式细胞学检测MA干预后的细胞中Bregs、Tregs的水平及CD4+/CD8+T细胞比例。用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测细胞培养上清中因子IL-10、TGF-β以及炎症因子IL-2、IFN-γ水平。利用实时定量逆转录PCR技术检测细胞内Nrf2通路相关分子以及炎症因子IL-2、IFN-γ的mRNA水平改变。以Western blot检测MA干预后细胞内Nrf2通路相关分子的蛋白水平变化。用MTT比色法检测MA干预后细胞的增殖活性。利用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测MA干预后细胞的凋亡情况。　　结果：　　（1）MA呈剂量依赖性和时间依赖性促进Bregs水平增高，以72h为例，与对照组统计值1.02±0.25%相比，各实验组组Bregs水平统计数值依次为50μM MA组1.83±0.22%（P=0.0406），100μM MA组1.87±0.23%（P=0.0457），150μM MA组2.20±0.13%（P=0.0017），200μM MA组2.53±0.19%（P=0.0012），然而两组间Tregs水平无显著性差异（P=0.8900）;（2）MA提高CD4+/CD8+比例，在50uM MA及200uM MA组均较对照组增高（P=0.0182，P=0.0321）;（3）Elisa结果显示，MA促进细胞因子IL-10的分泌，以50uM、100uM、150uM MA组最为显著，其数值依次是444.2±60.64pg/ml、494.3±71.41pg/ml、501.3±64.75pg/ml，与对照组382.4±40.71pg/ml相比均有所增高。(P50=0.0103、P100=0.0209、P150=0.0086）。但两组细胞中 TGF-β的分泌水平无统计学差异（P=0.4787）;（4）MA减低炎症因子IL-2、IFN-γ分泌及转录水平。与对照组相比，以200uM MA组最为明显，降低IL-2及IFN-γ分泌水平（P<0.001，P=0.0221）和转录水平（P=0.0422，P=0.0178）;（5）MA激活Nrf2抗氧化应激通路。MA实验组明显提高此通路下游因子Nrf2、NQO1的转录水平以及蛋白水平，而降低其下游负调控因子Keap1转录和蛋白表达水平。与对照组相比，以200uM MA实验组最明显，Nrf2和NQO1的mRNA水平分别增高了2.81倍（P<0.001）及2.44倍（P=0.0360），蛋白水平分别增高了3.39倍(P=0.0020）及7.1倍(p=0.0191）;而Keap1 mRNA水平降低至0.65倍（P=0.0278），蛋白水平降至0.2倍（P<0.001）。　　（6）MTT结果显示，MA呈剂量依赖性促进MNCs增殖，以48h最为明显，200uM MA组比对照组明显增高（P=0.0017）;（7）凋亡检测，MA实验组与对照组相比，细胞凋亡率有所减低，以150uM MA实验组最为显著（P=0.0079）。　　结论：本实验研究初次证实MA可在体外实验中提高小鼠脾脏的Bregs水平及IL-10水平，MA可能籍此增强免疫抑制活性。MA不影响Tregs的水平。MA尚可抑制炎症因子IL-2、IFN-γ的转录及表达。MA也能在体外提高小鼠脾MNCs的Nrf2、此通路下游抗氧化酶NQO1的基因转录以及蛋白表达，并降低Keap1的转录及表达，因此MA可增强小鼠脾MNCs的Nrf2抗氧化通路的活性。MA可能通过上调Bregs参与免疫调控，抑制促炎细胞因子表达和分泌，并激活Nrf2通路通路防御免疫炎症损伤。MA可促进小鼠脾MNCs的增殖、抑制其凋亡，对此细胞具有保护作用而非细胞毒作用。MA可能成为有效、安全的免疫调控剂，可望用于防治cGVHD。MA的免疫调控机制及体内活性尚待进一步深入研究。

关键词： 自身免疫性葡萄膜炎   间充质干细胞   辅助性T细胞17   调节性B细胞   疗效评价  

摘要： 目的:　　葡萄膜炎是一种常见的自身免疫性眼病.实验性自身免疫性葡萄膜炎(recurrent experimental autoimmune uveitis,EAU)主要致炎因子为Th17,目前发现调节性B细胞(Regulatory Bcells,Breg)可抑制Th17的分化及活性.间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种具有免疫调节功能的成体干细胞,可调节多种免疫细胞的增殖和功能.本研究通过建立动物模型研究Th17及Breg细胞在诱导大鼠自身免疫性葡萄膜炎过程中的作用,并观察MSCs对EAU的治疗效果.　　方法:　　***培养:将SD大鼠骨髓间充质干细胞分离出来,并进行培养鉴定.　　2.动物模型建立:Lewis大鼠36只,各12只.MSCs干预组:光感受器间维生素A类结合蛋白(Interphotoreceptorbinding protein,IRBP)与弗氏完全佐剂(CFA)等体积混合并充分乳化后,尾静脉(1ml)+双侧大腿肌肉(各0.5ml)注射建立EAU动物模型,同时腹腔注射2mlMSCs悬液进行干预.模型对照组:相同方法建立EAU动物模型,同时腹腔注射2mlPBS进行干预.正常对照组;同部位同体积注射PBS建立模型,同时腹腔注射2mlPBS进行干预.　　3.临床观察:动物模型建立后,从第3天起每日在裂隙灯显微镜下观察大鼠眼部,并按照Caspi临床分级进行评分.　　4.组织病理学观察:正常对照组、MSCs干预组及模型对照组各4只,在动物模型建立后第7、14、21天分别处死,摘除眼球制备视网膜组织切片,并用HE染色后观察,按照Caspi组织学分级法进行评分.　　5.细胞因子检测:将大鼠麻醉后,取外周血,离心取上清,ELISA法检测血清中IL-17、IL-10、TGF-β的表达.　　***17细胞和Breg细胞检测:大鼠过量麻醉后,取外周血裂解后制成细胞悬液,摘除脾脏,研磨后分离细胞,流式细胞仪检测Th17细胞和Breg细胞的比例.　　结果:　　1.成功分离MSCs并用流式细胞仪鉴定.　　2.成功建立EAU动物模型.　　3.与模型对照组相比,MSCs干预组各个时间点大鼠眼部炎症表现均减轻(P<0.05);视网膜组织病理学炎症反应均减轻.(P<0.05).　　4.与模型对照组相比,MSCs干预组在各个时间点血清ELISA检测IL-17含量均降低(P<0.05),IL-10、TGF-β含量均升高(P<0.05).　　5.与模型对照组相比,MSCs干预组在各个时间点流式细胞仪检测Thl7细胞比例均降低(P<0.05),Breg细胞比例均升高(P<0.05).　　结论：　　Th17和Breg细胞的比例与EAU的发生、发展密切相关.MSCs治疗能够降低Th17、升高Breg在淋巴细胞中的比例,从而抑制EAU大鼠体内IL-17的分化及活性,提高IL-10、TGF-β的增殖与活性,抑制EAU炎症反应.

关键词： 红斑狼疮   自身免疫病   Foxd3基因   转录因子   白细胞介素-10   调节性B细胞   分化发育  

摘要： IL-10+调节性B细胞（Breg）通过分泌白介素-10（IL-10）在抑制过度炎性反应方面起到重要作用。然而调节性B细胞因在体内含量少，没有特异性表面标记，没有特异性转录因子，和分化发育机制不清楚等限制其将来临床应用。为了进一步深入研究调节性B细胞的分化发育机制，本研究首先关注了一个关键的科学问题：哪些转录因子能有效地调控调节性B细胞关键的标志性分子—IL-10的表达？　　目的：分析IL-10启动子上转录因子结合位点，检测Foxd3（经预测是结合在IL-10启动子上得分最高和结合位点最多的一个转录因子）在调节性B细胞中与IL-10分泌的相关性，阐明“Foxd3在调节性B细胞分化、发育、扩增及功能中的作用及机制”，并为靶向Foxd3信号通路促使调节性B细胞扩增及其对自身免疫病治疗提供理论及实验依据。　　方法：　　（1）通过两个网站为基础的预测软件，对IL-10启动子上转录因子结合位点进行分析;（2）应用染色质免疫共沉淀-PCR技术验证Foxd3是否能够直接结合在IL-10启动子上;（3）应用基因突变技术进一步证实Foxd3与IL-10启动子结合的具体相互作用位点;（4）通过双荧光素酶报告系统分析Foxd3是否调节IL-10启动子的活性;（5）应用实时定量PCR和免疫印迹技术检测LPS活化的B细胞中Foxd3的mRNA水平和蛋白水平表达;（6）应用Foxd3特异性shRNA敲低B细胞中Foxd3的表达，检测Foxd3表达降低是否影响IL-10的表达;（7）通过流式细胞术、酶联免疫吸附实验和免疫印迹技术，检测系统性红斑狼疮小鼠B细胞中Foxd3和IL-10表达的相关性。　　结果：　　（1）对小鼠IL-10启动子上转录因子结合位点进行分析，发现Foxd3是与IL-10启动子结合最强（得分最高）和最多（结合位点最多）的转录因子;（2）染色质免疫共沉淀-PCR技术鉴定出Foxd3能结合在IL-10启动子上游-1400bp位置;（3）通过构建截短型IL-10启动子，证明Foxd3通过与IL-10启动子结合位点p4（-1413）结合;通过构建截短型Foxd3蛋白，证实Foxd3通过一个N末端结构域结合在IL-10启动子上;（4）双荧光素酶报告系统分析显示，Foxd3能有效地抑制IL-10启动子的功能;（5）实时定量PCR和免疫印迹技术证实LPS活化的B细胞高表达Foxd3 mRNA和蛋白，并且Foxd3的表达随着LPS的刺激呈时间依赖性增加;（6）实时定量PCR、免疫印迹技术、流式细胞术和酶联免疫吸附实验检测结果显示Foxd3低表达的IL-10+调节性B细胞中IL-10的表达升高;（7）流式细胞术、酶联免疫吸附实验和免疫印迹技术结果表明，系统性红斑狼疮小鼠B细胞中Foxd3表达量升高而IL-10+调节性B细胞降低。　　结论：本研究表明无论是在体内还是体外，活化的B细胞上调Foxd3的表达。Foxd3通过直接结合IL-10的启动子，限制IL-10启动子的激活，进而抑制IL-10+调节性B细胞的产生。自身免疫病小鼠B细胞高表达Foxd3进而降低调节性B细胞的产生。这样，转录因子Foxd3通过抑制B细胞中白介素-10的表达抑制调节性B细胞的产生。　　这项研究不仅阐明了Foxd3抑制调节性B细胞产生的机制，而且为以Foxd3为潜在靶点诱导调节性B细胞产生来治疗自身免疫病的新方法奠定前期基础。因此，这项研究既丰富了调节性B细胞分化发育的基本理论又为调节性B细胞的可能应用奠定了坚实基础。

关键词： 原发性干燥综合征   调节性B细胞   白介素-17   抗SSA抗体   抗SSB抗体   疾病活动指数  

摘要： 目的:原发性干燥综合征（primary sj?gren’s syndrome,pSS）是一种以唾液腺高度淋巴细胞浸润,并具有高球蛋白血症为特征的弥漫性结缔组织病。临床表现主要包括口干燥症,干燥性角、结膜炎等外分泌腺受损的症状,同时也常伴有系统损伤,如肺间质纤维化、神经系统病变、肾小管酸中毒等。pSS病因及发病机制未明,其发病可能与感染、环境、遗传及免疫功能紊乱等因素有关。目前B淋巴细胞在自身免疫性疾病发病中的作用日渐受到重视。有研究显示调节性B细胞（regulatory B cell,Breg）及白介素-17（interleukin 17,IL-17）与pSS的发生发展密切相关。本研究通过检测调节性B淋巴细胞(CD19+CD24hiCD38hiBregs)及白介素-17在pSS患者外周血中的表达水平,分析两者与临床、系统受累情况、相关实验室指标、唇腺病理分级及疾病活动度的相关性,来探讨CD19+CD24hiCD38hiBregs及IL-17在pSS发生发展中的作用。方法:1病例选择:选取自2016年3月至2016年11月期间河北省人民医院风湿免疫科初治pSS患者30例作为实验组,均符合欧美共识小组（AECG）2002年修订版干燥综合征国际分类标准,并且排除Ig G4相关疾病（Ig G4 related disease,Ig G4-RD）等其他自身免疫性疾病、恶性肿瘤、获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS）、移植物抗宿主病、病毒性肝炎、抗乙酰胆碱药物、糖皮质激素及免疫抑制剂应用者。选取健康志愿者20例为对照组,性别、年龄与实验组均匹配。2收集入选对象基本信息及临床资料:记录基本信息如性别、年龄、病程,临床症状及体征,实验室指标如白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）、血小板计数（PLT）、血红蛋白计数（Hb）、C反应蛋白（CRP）、血沉（ESR）、类风湿因子（RF）、抗核抗体（ANA）、ENA抗体谱、免疫球蛋白（Ig）、补体C3、C4。3实验方法:采用流式细胞术（FCM）检测实验组及对照组表型为CD19+CD24hi CD38hi的Bregs占CD19+细胞的百分比;酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测两组外周血清中IL-17的表达水平。4唇腺病理分级:无菌条件下取下唇腺活组织并应用福尔马林固定,经石蜡包埋,切片,HE染色。根据Chisholm标准分为0Ⅳ级。5 pSS疾病活动评估:根据2009年欧洲抗风湿病联盟（EULAR）制定的干燥综合征疾病活动度指数（ESSDAI）评估实验组疾病活动度。6数据处理:应用SPSS 21.0.0统计软件处理。计量资料符合正态分布的结果以均数±标准差（Xˉ±SD）表示,具有方差齐性的两组间比较应用独立样本t检验,多组样本间均数比较应用单因素ANOVA方差分析,相关分析应用Spearman相关分析;计量资料非正态分布的结果以中位数（四分位间距）[M（P25,P75）]表示,两组资料比较应用非参数Mann-Whitney U检验,多组间比较应用Kruskal-Wallace检验,相关分析应用Spearman相关系数检验。所有的统计检验均应用双侧检验,P值小于或等于0.05将被认为有统计学意义。结果:1 pSS组及健康对照组外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs及血清IL-17表达水平:pSS组外周血中CD19+CD24hiCD38hiBregs占CD19+B淋巴细胞百分比为（4.18±1.98%）,较健康对照组（1.10±0.63%）显著升高（P<0.001）。血清IL-17的表达水平（17.99±9.88pg/ml）显著高于健康对照组（13.32±5.29pg/ml,P<0.05）;2 pSS患者外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs及血清IL-17的表达水平与系统损伤的关系:根据患者有无系统损伤,将pSS患者分为系统损伤组（20例,66.7%）、非系统损伤组（10例,33.3%）;系统损伤组定义为在pSS诊断基础上,排除其他因素,如药物、感染等,而出现呼吸、消化、血液、神经、泌尿系统等任一系统受累者,非系统损伤组定义为单纯表现为口干和（或）眼干症状的pSS患者。上述分组中pSS患者外周血中CD19+CD24hiCD38hiBregs占CD19+B淋巴细胞百分比分别为4.29±2.27%和3.96±1.33%,血清IL-17的表达分别为19.04±9.93pg/ml及15.50±9.47pg/ml,两组差异均无统计学意义（P>0.05）;3 pSS患者外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs及血清IL-17表达与相关实验室指标的关

关键词： 调节性T细胞   急性髓系白血病   调节性B细胞   肿瘤免疫白血病   淋巴细胞   急性   费城染色体   伊马替尼   治疗结果  

摘要： 目的:研究AML患者Tregs的数量、趋化及其对免疫细胞的抑制功能,并探讨导致AML患者Tregs异常可能的上游因素,阐明其在AML免疫逃逸机制中的作用,为提高AML临床疗效寻找新的治疗方向。方法:①流式细胞术检测初诊AML患者和正常对照骨髓液单个核细胞中Tregs比例及Tregs表面PD1、CTLA4、GITR的表达;②transwell实验检测Tregs迁移至骨髓的趋化功能;③流式细胞术检测Tregs细胞表面CXCR4、CXCR7表达,ELISA方法检测骨髓和血浆中SDF-1α水平;④Tregs分别与CD4+T细胞和CD8+T细胞共培养、交叉共培养比较AML与正常Tregs对免疫细胞的抑制能力;⑤Bregs与CD4+CD25-T细胞共培养、交叉共培养比较AML与正常Bregs诱导CD4+CD25-T细胞向Tregs转化的能力。结果:①初诊急性髓系白血病患者外周血和骨髓液中Tregs比例增多;②AML患者外周血Tregs趋化至骨髓的能力增强;③AML患者外周血Tregs趋化至骨髓的能力增强源于CXCR4表达升高;④AML患者Tregs抑制CD4+ T细胞增殖促进CD4+ T细胞凋亡的能力增强并影响其INF-γ分泌;⑤AML患者Bregs诱导CD4+CD25-T细胞向 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 转化。结论:AML患者Tregs数量增多,迁移至骨髓能力增强,并影响CD4+T细胞增殖、凋亡、细胞因子分泌等功能,而AML患者Bregs促进CD4+ CD25-T细胞向CD4+CD25+Foxp3+ Tregs的转化,从而放大Tregs的免疫抑制效应,为AML基于Tregs的免疫抑制治疗提供理论依据。目的:探讨真实世界中伊马替尼(IM)联合化疗治疗BCR-ABL阳性急性淋巴细胞白血病(ALL)的疗效及相关预后因素。方法:2003年4月至2015年8月中国医学科学院血液病医院收治的209例治疗中包含IM的BCR-ABL阳性ALL患者纳入研究,106例患者接受造血干细胞移植(HSCT)。对患者的疗效和预后影响因素进行分析。结果:初诊患者诱导完全缓解(CR)率为97.9%。初诊时WBC≥100×109/L是总生存(OS)的不良预后因素(P=0.043)。未接受HSCT、诱导治疗4周内未达CR和治疗过程中未达到分子生物学完全缓解(CMR)是OS(P值分别为<0.001、0.009和<0.001)和无复发生存(RFS)(P值均<0.001)的不良预后因素。接受异基因HSCT和自体HSCT的患者,其OS和RFS的差异无统计学意义。首次诱导治疗时联用IM与否对OS无明显影响,但是联用IM的患者较未联用IM的患者显示出更高的5年RFS率(37.0%对24.0%,P =0.005)。在治疗过程中持续规律服用酪氨酸激酶抑制剂(TKI,40例患者由于复发/转录本水平下降不理想/出现突变换用其他TKI)的患者生存情况最佳,其次为骨髓抑制期间断停用TKI的患者,不规律服用TKI的患者生存情况最差,三组5年OS率分别为46.0%、28.0%、17.0%(P=0.004),5年RFS率分别为 38.0%、28.0%、17.0%(P<0.001)。结论:TKI联合化疗获得CMR,序贯以HSCT可改善BCR-ABL阳性ALL患者预后,持续规律地联用TKI有助于BCR-ABL阳性ALL患者疗效的提高。

关键词： 调节性B细胞   原发性干燥综合征   IL-10   TGF-β   Foxp3  

摘要： 原发性干燥综合征(p SS)是一种主要侵犯唾液腺和泪腺等外分泌腺,并累及多个系统的慢性自身免疫性疾病。B细胞异常改变是p SS的主要特征之一,其他特征还包括B细胞过表达、外周血产生大量异常的自身抗体、出现高丙种球蛋白血症、B细胞亚群异常,选择性浸润外分泌腺等组织、形成异位淋巴样组织。调节性B细胞是B淋巴细胞中具有负向免疫调节功能的亚群。调节性B细胞主要通过分泌细胞因子如:IL-10、TGF-β、Foxp3等及与T细胞直接接触等参与固有及适应性免疫应答,抑制炎症反应。调节性B细胞在原发性干燥综合征表达及功能异常可导致原发性干燥综合征的发病。