关键词： 过敏性鼻炎   调节性B细胞   鼠模型  

摘要： 目的:探讨调节性B细胞(regulatory B cell,Breg细胞)在过敏性鼻炎(allergic rhinitis,AR)鼠模型鼻黏膜中比例变化及意义。方法:16只BALB/C小鼠随机分为两组,每组8只。AR组使用卵清蛋白来构建AR鼠模型,对照组使用生理盐水替代。收取两组小鼠鼻黏膜组织,采用流式细胞术检测两组小鼠鼻黏膜中Breg细胞的比例。结果:在AR组与对照组小鼠鼻黏膜中均检测到Breg细胞,并且A R组中Breg细胞比例(1.15%±0.20%)低于对照组(2.30%±0.46%),差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:Breg细胞比例下降在AR的发病中起重要作用。

关键词： 脓毒症   调节性B细胞   IL-10   脂多糖  

摘要： 研究背景:脓毒症是指由感染引发的全身炎症反应综合征,本质上是机体对感染性因素的反应。虽然脓毒症由感染引起,但一旦发生,其病情发展遵循自身的病理过程和规律。脓毒症病情凶险,病死率高,目前其发病机制尚未完全阐明,临床上尚无良好的治疗方案。脓毒症作为一种严重的免疫炎症反应,有报道表明,在B细胞缺陷小鼠中,由细菌感染引发的脓毒症小鼠动物模型死亡率显著升高。这提示我们,B细胞有可能通过抑制炎症反应对细菌感染引发的脓毒症起到保护作用。具有抑制免疫炎症反应功能的B细胞被称为调节性B细胞(Regulatory B cell,Breg)。目前,有多个B细胞群体被称为Breg,其中,CD5+CD1dhi Breg亚群作为较早被确定为有免疫抑制功能的细胞群体之一而被广泛研究。Breg在多种自体免疫性疾病、感染和肿瘤等疾病的发生发展过程中起着重要的调节作用,对其研究,将有助于深入阐述多种临床疾病的发病机制及治疗方案。那么,Breg细胞在脓毒症疾病的发展过程中扮演了怎样的角色?然而,迄今Breg与脓毒症的关系未有明确的研究,CD5+CD1dhi Breg亚群与脓毒症的关联未有报导。目的:研究脓毒症小鼠中脾脏免疫抑制性细胞CD5+CD1dhi Breg亚群及其免疫调节功能相关分子、免疫调节功能变化情况,Breg是否对脓毒症具有治疗意义;从而深入阐明脓毒症的发病机制,为临床上脓毒症的治疗提供依据。方法:采用腹腔注射不同剂量脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)或盲肠结扎穿刺(CLP)构建不同严重程度的小鼠脓毒症模型,取其外周血,Elisa法检测血中IFN-γ含量变化;无菌分离脾细胞或脾脏CD19+B细胞,流式细胞术检测CD5+CD1dhi Breg亚群及其相关功能分子CD25、CD86、FasL、IL-10等表达变化情况。通过流式分选脓毒症小鼠CD5+CD1dhi Breg亚群,与CD4+T细胞共培养,检测其抑制CD4+T细胞增殖情况,判断脓毒症小鼠CD5+CD1dhi Breg亚群免疫抑制功能变化。最后,将分选的IL-10表达的CD5+CD1dhiBreg亚群过继性转移至脓毒症小鼠体内,观察其对脓毒症的治疗作用。结果:1.脓毒症小鼠脾脏CD5+CD1dhi Breg亚群比例降低;***诱发的脓毒症小鼠脾脏细胞CD5+CD1dhi Breg亚群CD25、CD86、FasL表达升高,提示其处于活化状态,参与到了机体的免疫反应中;3.重度脓毒症小鼠脾脏CD5+CD1dhi Breg亚群IL-10分泌降低,轻度脓毒症小鼠脾脏CD5+CD1dhi Breg亚群IL-10分泌升高,提示重度脓毒症小鼠可能因为CD5+CD1dhi Breg亚群分泌的IL-10减少引发免疫抑制功能缺陷;4.重度脓毒症小鼠脾脏CD5+CD1dhi Breg亚群免疫抑制功能减弱;5.过继性转移CD5+CD1dhi Breg亚群后脓毒症小鼠死亡时间延迟结论:在小鼠脓毒症中,CD5+CD1dhi Breg亚群数目减少;IL-10分泌的CD5+CD1dhi Breg在重度的脓毒症模型中出现了降低;并出现了免疫抑制功能的缺陷,该缺陷可能与其Breg激活后IL-10分泌下调有关;活化后分泌IL-10的CD5+CD1dhi Breg亚群对重度脓毒症小鼠具有保护作用,可延长其生存时间。研究表明,该Breg亚群不仅参与脓毒症的发病过程,并且对脓毒症具有治疗作用。

关键词： 实验性自身免疫性脑脊髓炎   耐受性树突状细胞   调节性B细胞   程序性死亡受体   程序性死亡配体  

摘要： 研究背景及目的意义:多发性硬化（multiple sclerosis,MS）是中枢神经系统慢性炎症性自身免疫疾病,以脑和脊髓的轴突破坏及髓鞘脱失为主要病理特点。MS患者临床表现的严重程度不一,重者可致身体残疾,极大程度地降低患者的生活质量。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）是MS基础实验研究常用的动物模型。树突状细胞（dendritic cell,DC）作为专职的抗原提呈细胞,在MS的发病过程中起重要作用。耐受性树突状细胞（tolerogenic dendritic cell,t DC）是一种特殊类型的DC,通过诱导调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）的形成和促进抑炎因子的分泌,对MS具有潜在的治疗价值。程序性死亡受体（programmed death 1,PD1）和程序性死亡配体1（programmed death ligand 1,PDL1）属于B7超家族,通过发挥负性调节的作用在MS的发病过程中起一定的治疗作用。调节性B细胞（regulatory B cell,Breg）是B细胞的一种,可通过分泌抑炎因子在MS的发病过程中起抑制疾病发展的作用。1,25（OH）2D3是一种免疫调节剂,能够有效诱导t DC（VD3-DC）的形成,并将所诱导VD3-DC回输给发病的EAE小鼠后可发挥一定的治疗作用。本实验课题拟在体外先诱导骨髓来源的单核细胞成为DC,后经过具有免疫调节作用的1,25（OH）2D3诱导形成VD3-DC,检测正常DC和VD3-DC表面PDL1的表达,后将正常DC和VD3-DC回输给已发病的EAE小鼠:（1）观察回输治疗后EAE小鼠临床症状的变化;（2）检测脾脏和淋巴结T细胞表面PD1的表达;（3）检测脾脏和淋巴结B细胞中Breg的比例;（4）采用HE和LFB染色观察小鼠脊髓内炎性细胞浸润以及脱髓鞘病变情况。进而探究Breg、PD1、PDL1通过1,25（OH）2D3诱导的VD3-DC在实验性自身免疫性脑脊髓炎中的治疗作用及机制。研究方法:（1）用MOG35-55加完全弗氏佐剂（complete freund’s adjuvant,CFA）的混合乳液,经背部皮下注入C57BL/6小鼠中,于免疫当天和2天后分别经腹腔注射百日咳毒素（pertussis toxin,PTX）建立EAE动物模型;（2）培养基内分别加入白介素-4（interleukin-4,IL-4）和粒细胞巨噬细胞刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）（各10ng/ml）来刺激小鼠股骨和胫骨骨髓来源的单个核细胞诱导DC。诱导DC的同时在其培养基内加入1,25（OH）2D3（10-8M）来诱导形成VD3-DC。然后分别向正常DC、VD3-DC中加入脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激24h,促进其成熟,通过流式细胞术检测DC和VD3-DC表面PDL1的表达;（3）将EAE小鼠分为三组,在DC/VD3-DC诱导的第8天,用MOG抗原孵育4小时后,将MOG抗原洗尽,分别将PBS、DC和VD3-DC经尾静脉回输给EAE小鼠（EAE小鼠诱导第10、13、16天）,观察各组小鼠临床症状变化;（4）在回输治疗发病高峰期,分离经过回输治疗后的EAE小鼠脾脏和淋巴结细胞,通过流式细胞术检测细胞表面PD1的表达及Breg的比例;（5）在回输治疗发病高峰期,分离小鼠脊髓,通过苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）和卢克斯快蓝染色（luxol fast blue,LFB）,观察对比治疗前后EAE小鼠脊髓炎性细胞的浸润和髓鞘脱失情况。研究结果:（1）根据我们前期实验可知,通过相同的实验方法可以成功诱导出EAE小鼠动物模型和VD3-DC。本实验通过流式细胞术检测可知与正常DC相比,VD3-DC表面PDL1的表达增多,且差异具有统计学意义;（2）与PBS对照组相比,DC和VD3-DC回输给EAE小鼠,可有效减轻其临床症状,且VD3-DC的效果更显著;（3）与PBS对照组相比,VD3-DC组和DC组脾脏和淋巴结T细胞表面PD1的表达均增加,且有统计学意义;但VD3-DC组和正常DC组之间PD1的表达差异无统计学意义;（4）与PBS对照组相比,VD3-DC组脾脏B细胞表面Breg（CD19+CD5+CD1d+）的比例显著增加,而正常DC组脾脏B细胞中Breg的比例减少,差异无统计学意义;同时VD3-DC组和正常DC组淋巴结B细胞中Breg的比例均有所增加,但差异无统计学意义;（5）根据HE和LFB染色可知,与PBS对照组相比,DC和VD3-

关键词： 金葡菌肠毒素B   脓毒症   调节性T细胞   炎性因子  

摘要： 研究背景与目的:严重脓毒症是ICU患者的主要的原因,细菌、毒素、病毒等均可诱导脓毒症发病,其中革兰阴性(G-)菌及其内毒素在脓毒症发病中的作用与机制已进行了广泛和深入的研究。然而临床资料表明,革兰阳性(G+)菌也是导致ICU内严重脓毒症的主要致病菌之一,且金黄色葡萄球菌感染的发病率和耐药性有逐年上升趋势。面对ICU金葡菌感染高发、高病死率的趋势,寻求有效的应对手段已然是当务之急。目前Treg细胞在以CLP造成腹腔感染或LPS诱导脓毒症发病机制中的作用已得到充分肯定,而其与G+球菌/金葡菌感染发病的关系几无阐述。因此,研究Treg在金葡菌脓毒症发病中的调控作用并阐明其机制,因此探讨两者的关系及相互影响机制,对临床应用非抗菌素手段调控金葡菌脓毒症有非常积极的意义。我们提出假设:Treg可能通过调控Teff对金葡菌感染免疫发生效应,若能经Treg下调金葡菌感染早期的免疫过度激活,维持免疫稳态,不仅有利于降低脓毒症早期机体损害和病死率,赢得治疗时机,还可能有助于病程中后期发挥Teff功能而清除病原体,降低金葡菌感染的总体病死率。因此,拟以大剂量金葡菌SEB诱导实验动物早期过度的全身性免疫炎症反应,通过增加或阻断动物体内CD4+CD25+Treg的方法,观察Treg对SEB诱导的早期炎症反应强度的影响,并探讨其可能的信号转导调控机制。第一部分金葡菌肠毒素B诱导脓毒症大鼠模型及观察目的通过探索不同剂量SEB引起的早期炎症反应模型,构建一个既能在一定时间内引起严重炎症反应同时并发多器官功能损害又不引起实验动物死亡的剂量,在此基础上,进一步检测该模型外周血炎性介质的变化水平,评估该模型的免疫状态变化,为后续发病机制和治疗途径等研究提供基础。方法1、选择清洁级雄性SD大鼠,体重200～300g,随机分为对照组、低、中、高剂量组各10只,均通过股静脉置管后分别注射生理盐水、SEB15ug/100g、30ug/100g、45ug/100g。2、记录造模后大鼠活动情况、外观变化和48h生存率。3、于6h、12h、24h、48h眼球采血,使用ELISA法测定炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-6表达水平。4、各组死亡或生存达到48小时处死后立即取肺、肝、肾器官镜检观察形态学变化。5、SPSS 20.0软件进行统计分析对于符合正态分布的计量数据表示为均值±标准差;两组细胞因子分泌情况的比较采用独立样本t检验,以P<0.05具有统计学差异,P<0.01为有明显差异。各组间的生存率采用Kaplan-Meier法和Log-Rank法分析并绘制生存曲线图。结果1、一般情况及生存率观察:造模后24h,对照组和低剂量组大鼠活动正常,中-高剂量组表现出典型的脓毒症症状;48h后对照组、低、中、高剂量组生存率分别是100%,100%,50%,20%。2、炎性因子表达:造模后各时间点,对照组TNF-α、IFN-γ、IL-6无明显变化,均低于低、中、高剂量组表达水平。低、中、高剂量组所测各炎性炎症呈进行性升高趋势,24小时达到高峰,随后出现下降趋势。炎性因子的表达与SEB剂量呈正相关。3、重要脏器光镜下改变:对照组和低剂量组,光镜下肺、肝脏和肾脏无明显改变,中-高剂量组大鼠肺、肝脏和肾脏表现出大量炎性细胞浸润、出血、坏死等改变。结论经股静脉注入金葡菌SEB 30μg/100g剂量能够建立全身炎症反应明显、多器官损害、病程稳定、适合早期研究的大鼠脓毒症模型,48h生存率在60%;SEB剂量和炎症反应水平、多器官损害程度正相关。第二部分Treg活性对金葡菌肠毒素B诱导的脓毒症大鼠的影响目的通过增加或阻断动物体内CD4+CD25+Treg的方法是否能逆转金葡菌肠毒素诱导的早期炎症反应强度的影响,以此来证明调节性T细胞在金葡菌诱导的脓毒症早期过度炎症反应中的作用,并探讨其可能的调控机制。方法1、采用免疫磁珠法提取大鼠脾脏CD4+CD25+Treg细胞,检测其活性及流式细胞术行纯度鉴定。2、模型制备:雄性清洁级SD大鼠随机分为SEB组,阻断组(SEB+PC61),Treg组(SEB+Treg),每组10只。各组经股静脉注入金葡菌SEB 30μg/100g剂量,阻断组同时注入100ug PC61,Treg组同时输入纯化CD4+CD25+Treg(1×106/L细胞制备液,1ml)。3、记录造模后大鼠活动情况、外观变化和48h生存率。4、于6h、12h、24h、48h眼球采血,使用ELISA法测定炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-6表达水平。5、各时间点流式细胞仪检测外周血Treg细胞占T淋巴细胞的比例。6、使用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。计量资料先行正态性检验,数据以均数±标准差表示,两组之间的比较采用独立样本t检验,多组间的比较采用单因素方差分析。P<0.05具有统

关键词： 自身免疫性葡萄膜炎   间充质干细胞   辅助性T细胞17   调节性B细胞   疗效评价  

摘要： 目的:　　葡萄膜炎是一种常见的自身免疫性眼病.实验性自身免疫性葡萄膜炎(recurrent experimental autoimmune uveitis,EAU)主要致炎因子为Th17,目前发现调节性B细胞(Regulatory Bcells,Breg)可抑制Th17的分化及活性.间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种具有免疫调节功能的成体干细胞,可调节多种免疫细胞的增殖和功能.本研究通过建立动物模型研究Th17及Breg细胞在诱导大鼠自身免疫性葡萄膜炎过程中的作用,并观察MSCs对EAU的治疗效果.　　方法:　　***培养:将SD大鼠骨髓间充质干细胞分离出来,并进行培养鉴定.　　2.动物模型建立:Lewis大鼠36只,各12只.MSCs干预组:光感受器间维生素A类结合蛋白(Interphotoreceptorbinding protein,IRBP)与弗氏完全佐剂(CFA)等体积混合并充分乳化后,尾静脉(1ml)+双侧大腿肌肉(各0.5ml)注射建立EAU动物模型,同时腹腔注射2mlMSCs悬液进行干预.模型对照组:相同方法建立EAU动物模型,同时腹腔注射2mlPBS进行干预.正常对照组;同部位同体积注射PBS建立模型,同时腹腔注射2mlPBS进行干预.　　3.临床观察:动物模型建立后,从第3天起每日在裂隙灯显微镜下观察大鼠眼部,并按照Caspi临床分级进行评分.　　4.组织病理学观察:正常对照组、MSCs干预组及模型对照组各4只,在动物模型建立后第7、14、21天分别处死,摘除眼球制备视网膜组织切片,并用HE染色后观察,按照Caspi组织学分级法进行评分.　　5.细胞因子检测:将大鼠麻醉后,取外周血,离心取上清,ELISA法检测血清中IL-17、IL-10、TGF-β的表达.　　***17细胞和Breg细胞检测:大鼠过量麻醉后,取外周血裂解后制成细胞悬液,摘除脾脏,研磨后分离细胞,流式细胞仪检测Th17细胞和Breg细胞的比例.　　结果:　　1.成功分离MSCs并用流式细胞仪鉴定.　　2.成功建立EAU动物模型.　　3.与模型对照组相比,MSCs干预组各个时间点大鼠眼部炎症表现均减轻(P<0.05);视网膜组织病理学炎症反应均减轻.(P<0.05).　　4.与模型对照组相比,MSCs干预组在各个时间点血清ELISA检测IL-17含量均降低(P<0.05),IL-10、TGF-β含量均升高(P<0.05).　　5.与模型对照组相比,MSCs干预组在各个时间点流式细胞仪检测Thl7细胞比例均降低(P<0.05),Breg细胞比例均升高(P<0.05).　　结论：　　Th17和Breg细胞的比例与EAU的发生、发展密切相关.MSCs治疗能够降低Th17、升高Breg在淋巴细胞中的比例,从而抑制EAU大鼠体内IL-17的分化及活性,提高IL-10、TGF-β的增殖与活性,抑制EAU炎症反应.

关键词： 原发性干燥综合征   调节性B细胞   白介素-17   抗SSA抗体   抗SSB抗体   疾病活动指数  

摘要： 目的:原发性干燥综合征（primary sj?gren’s syndrome,pSS）是一种以唾液腺高度淋巴细胞浸润,并具有高球蛋白血症为特征的弥漫性结缔组织病。临床表现主要包括口干燥症,干燥性角、结膜炎等外分泌腺受损的症状,同时也常伴有系统损伤,如肺间质纤维化、神经系统病变、肾小管酸中毒等。pSS病因及发病机制未明,其发病可能与感染、环境、遗传及免疫功能紊乱等因素有关。目前B淋巴细胞在自身免疫性疾病发病中的作用日渐受到重视。有研究显示调节性B细胞（regulatory B cell,Breg）及白介素-17（interleukin 17,IL-17）与pSS的发生发展密切相关。本研究通过检测调节性B淋巴细胞(CD19+CD24hiCD38hiBregs)及白介素-17在pSS患者外周血中的表达水平,分析两者与临床、系统受累情况、相关实验室指标、唇腺病理分级及疾病活动度的相关性,来探讨CD19+CD24hiCD38hiBregs及IL-17在pSS发生发展中的作用。方法:1病例选择:选取自2016年3月至2016年11月期间河北省人民医院风湿免疫科初治pSS患者30例作为实验组,均符合欧美共识小组（AECG）2002年修订版干燥综合征国际分类标准,并且排除Ig G4相关疾病（Ig G4 related disease,Ig G4-RD）等其他自身免疫性疾病、恶性肿瘤、获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS）、移植物抗宿主病、病毒性肝炎、抗乙酰胆碱药物、糖皮质激素及免疫抑制剂应用者。选取健康志愿者20例为对照组,性别、年龄与实验组均匹配。2收集入选对象基本信息及临床资料:记录基本信息如性别、年龄、病程,临床症状及体征,实验室指标如白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）、血小板计数（PLT）、血红蛋白计数（Hb）、C反应蛋白（CRP）、血沉（ESR）、类风湿因子（RF）、抗核抗体（ANA）、ENA抗体谱、免疫球蛋白（Ig）、补体C3、C4。3实验方法:采用流式细胞术（FCM）检测实验组及对照组表型为CD19+CD24hi CD38hi的Bregs占CD19+细胞的百分比;酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测两组外周血清中IL-17的表达水平。4唇腺病理分级:无菌条件下取下唇腺活组织并应用福尔马林固定,经石蜡包埋,切片,HE染色。根据Chisholm标准分为0Ⅳ级。5 pSS疾病活动评估:根据2009年欧洲抗风湿病联盟（EULAR）制定的干燥综合征疾病活动度指数（ESSDAI）评估实验组疾病活动度。6数据处理:应用SPSS 21.0.0统计软件处理。计量资料符合正态分布的结果以均数±标准差（Xˉ±SD）表示,具有方差齐性的两组间比较应用独立样本t检验,多组样本间均数比较应用单因素ANOVA方差分析,相关分析应用Spearman相关分析;计量资料非正态分布的结果以中位数（四分位间距）[M（P25,P75）]表示,两组资料比较应用非参数Mann-Whitney U检验,多组间比较应用Kruskal-Wallace检验,相关分析应用Spearman相关系数检验。所有的统计检验均应用双侧检验,P值小于或等于0.05将被认为有统计学意义。结果:1 pSS组及健康对照组外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs及血清IL-17表达水平:pSS组外周血中CD19+CD24hiCD38hiBregs占CD19+B淋巴细胞百分比为（4.18±1.98%）,较健康对照组（1.10±0.63%）显著升高（P<0.001）。血清IL-17的表达水平（17.99±9.88pg/ml）显著高于健康对照组（13.32±5.29pg/ml,P<0.05）;2 pSS患者外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs及血清IL-17的表达水平与系统损伤的关系:根据患者有无系统损伤,将pSS患者分为系统损伤组（20例,66.7%）、非系统损伤组（10例,33.3%）;系统损伤组定义为在pSS诊断基础上,排除其他因素,如药物、感染等,而出现呼吸、消化、血液、神经、泌尿系统等任一系统受累者,非系统损伤组定义为单纯表现为口干和（或）眼干症状的pSS患者。上述分组中pSS患者外周血中CD19+CD24hiCD38hiBregs占CD19+B淋巴细胞百分比分别为4.29±2.27%和3.96±1.33%,血清IL-17的表达分别为19.04±9.93pg/ml及15.50±9.47pg/ml,两组差异均无统计学意义（P>0.05）;3 pSS患者外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs及血清IL-17表达与相关实验室指标的关

关键词： 艾滋病病毒I型感染者/艾滋病患者   调节性B细胞   高效联合抗反转录病毒治疗   发病机制  

摘要： 目的:本研究旨在观察调节性B细胞在HIV-1/AIDS患者外周血中的变化,探讨其在HIV-1/AIDS疾病中的发病机制和疾病发展进程中的作用。研究方法:本项研究以云南省传染病专科医院住院部和门诊部的HIV-1/AIDS患者为实验组,以医疗卫生工作者和健康体检人群为对照组。选择121例未经过抗病毒治疗的HIV-1/AIDS患者,分成两组,其中无症状感染者82人、艾滋病患者39例,接受HAART治疗并长期随访者30例(在121例HIV-1/AIDS患者中选择)。用流式细胞术(FCM)检测其外周血中CD1d hiCD5+CD19+B细胞的比例、CD4+T淋巴细胞数量、CD8+T淋巴细胞数量、CD4细胞/CD8细胞的比值,并与同期选择的36例健康对照者作比较。通过研究HIV-1/AIDS患者和健康对照者横断面队列外周血中T淋巴细胞数量和调节性B细胞比例变化,以及其中的30例HIV-1/AIDS患者在接受HAART前、后不同时期T淋巴细胞数量和Bergs比例的表达水平变化,并且观察30例HIV-1/AIDS患者接受HAART长期随访过程中艾滋病的纵向进展和抗病毒治疗疗效的关系,统计分析组内各变量间的相关性。结果:HIV-1/AIDS患者外周血中CD4细胞数量显著低于健康对照组(P<0.001),AIDS病人的CD4细胞数量显著低于HIV-1感染组(P<0.001)。HIV-1/AIDS患者外周血中CD8细胞数量显著低于健康对照组(P<0.001),而AIDS病人的CD8细胞数量与HIV-1感染者相比无显著差异(P=0.709)。HIV-1/AIDS患者外周血中CD4细胞/CD8细胞比值显著低于健康对照组(P<0.001),AIDS病人的CD4细胞/CD8细胞比值显著低于HIV-1感染者(P<0.001)。HIV-1/AIDS患者外周血中CD1d hiCD5+CD19+B细胞的比例显著高于健康对照组(P<0.01),AIDS患者的外周血中的CD1d hiCD5+CD19+B细胞的比例显著高于HIV-1感染者(P<0.001)。并且HIV-1/AIDS患者外周血中CD1d hiCD5+CD19+B细胞的比例与CD4细胞数量(r=-0.732,r2=0.536,P<0.001)和CD8细胞数量(r=-0.253,r2=0.064,P=0.011)均呈负相关关系,或者与CD4细胞/CD8细胞的比值(r=-0.643,r2=0.414,P<0.001)呈负相关关系。30例接受HAART患者在治疗前、治疗后的2周、1个月、2个月、3个月、6个月CD1d hiCD5+CD19+B细胞的比例均与同时期的CD4细胞数量、CD8细胞数量呈负相关关系,并且在HAART治疗后CD4细胞均值有上升趋势,CD1d hiCD5+CD19+B细胞比例均值有下降趋势。结论:HIV-1/AIDS患者外周血中CD1d hiCD5+CD19+B细胞显著升高,并随着艾滋病的进展而明显增加,经过抗病毒治疗后下降。CD1d hiCD5+CD19+B细胞可能在艾滋病的免疫衰竭中发挥作用,促进了艾滋病的发展进程;针对性降低HIV-1/AIDS患者的CD1d hiCD5+CD19+B细胞比例可能有利于抑制艾滋病的发展进程。

关键词： 调节性B细胞   慢性HBV感染   IL-10   Toll样受体  

摘要： 研究背景:慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是世界范围内流行最广的慢性病毒感染性疾病之一,严重危害人民健康。目前慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B,CHB）最主要的治疗方法是抗病毒治疗,但是现有的抗病毒治疗策略均不能彻底治愈慢性乙型病毒性肝炎。HBV感染慢性化的主要原因是由于宿主的细胞免疫功能受损,但其确切机制不明。越来越多的证据显示B细胞参与了HBV感染宿主的免疫调控,新近研究发现其中调节性B细胞（regulatory B cells,Breg）可能起到重要的免疫负性调控作用。既往有研究报道Breg细胞可通过Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）参与慢性HBV感染的病理过程。在本论文中,我们系统观察不同免疫状态的慢性HBV感染者外周血Breg细胞比例及其表面TLRs表达的变化规律,并结合临床特征明确上述免疫学指标变化的临床意义,并探讨相关的病原相关分子模式（Pathogen Associated Molecular Pattern,PAMP）对Breg细胞克隆扩增和功能的影响,阐明Breg细胞在慢性HBV感染中对T细胞的负性调控作用,从而有助于完善慢性HBV感染免疫受损机制,同时为寻找免疫治疗新靶标提供依据。研究方法:纳入南京大学医学院附属南京鼓楼医院感染科肝炎门诊2013年11月至2016年7月就诊的不同免疫状态的慢性HBV感染者166例,其中免疫耐受期（immune tolerant phase,IT）患者 43 例,免疫活化期（immune reactive phase,IA）患者 71 例,非活动HBV携带状态（inactive HBV carrier state,IC）患者52例,并纳入50例健康个体作为对照组（healthy controls,HC）,流式细胞术检测其外周血Breg细胞（CD24hiCD38hi B 细胞）比例,同时检测 Breg 细胞 TLR2,TLR4,TLR6,TLR9,IL-10和IL-35的表达情况。收集部分慢性HBV感染者及健康个体血清,Luminex技术检测血清IL-10水平,同时采用ELISA方法检测血清B细胞活化因子（B cell activating factor,BAFF）水平。分离健康个体及慢性HBV感染者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）,以 HBsAg、HBcAg 刺激培养后采用流式细胞术检测Breg细胞比例变化并采用ELISA方法检测培养上清IL-10水平变化,以明确HBV抗原对Breg细胞克隆扩增和功能的影响。磁珠分选出健康个体B细胞及T细胞,分别刺激活化后采用流式细胞术分选出Breg细胞,构建Breg细胞和T细胞共同培养体系,采用流式细胞术检测T细胞亚群变化以及T细胞PD-1、CD69表达,采用ELISA方法检测T细胞分泌细胞因子情况,以明确Breg细胞对T细胞的影响。结果:（1）166例慢性HBV感染者中男性104例,女性62例,平均年龄为31.40±8.07岁,50例健康对照者中男性30例,女性20例,平均年龄为32.20±9.48岁。IA组ALT和AST水平均显著高于IT、IC和HC组。（2）CHB患者外周血B细胞比例显著高于HC组,且主要以IA组升高为主。CHB患者外周血Breg细胞比例显著高于HC组,且IA组Breg细胞比例高于IT和HC组,同时IC组Breg细胞比例也高于HC组。（3）CHB患者B细胞及Breg细胞TLR9的表达均较HC组低,而CHB患者Breg细胞TLR2的表达较HC组高。但TLR4,TLR6,IL-10和IL-35的表达在CHB患者和HC组之间无差别。（4）CHB患者血清IL-10水平较HC组高,且主要以IA组升高为主,并且和ALT、AST水平呈显著正相关。CHB患者血清BAFF水平较HC组低,且主要以IT组为主,并且和ALT、AST水平呈显著负相关。（5）CHB患者外周血Breg细胞比例与ALT、AST水平呈正相关,而与HBV DNA、HBsAg、HBeAg等水平无显著相关性。（6）HBcAg能诱导CHB患者Breg细胞增加,且产生IL-10增加,而对健康个体则无此作用。CHB患者和HC均无法被HBsAg诱导产生Breg细胞。（7）Breg细胞能通过上调CD4+T细胞表面PD-1的表达而抑制CD4+T细胞,且能抑制 IL-2、IFN-丫、IL-10、IL-8 和颗粒酶 B（Granzyme B,GrB）等细胞因子的产生。结论:（1）CHB患者外周血Breg细胞比例及IL-10分泌水平较HC高,且不同免疫状态间有差别,Breg细胞可能作为CHB患者进入免疫活化期的标志。Breg细胞TLR

关键词： 原发性免疫缺陷病   调节性B细胞   非同源末端连接   DNA连接酶IV  

摘要： 第一部分 DOCK8蛋白缺陷对调节性B细胞功能影响及机制研究　　背景： DOCK8免疫缺陷病（Dedicator of cytokinesis 8 deficiency）是一类以反复感染、血清 IgE 水平显著升高和嗜酸性粒细胞增多为特征的原发性免疫缺陷病;其患者具有明显的过敏症状和自身免疫性疾病表现。DOCK8 蛋白为一种细胞骨架调控分子可激活 Rho-GTP 酶从而参与淋巴细胞发育、迁移及活化等多种细胞功能。调节性 B 细胞（Regulatory B Cell;Breg）是一群可以负性调控T细胞免疫反应的B细胞;主要通过分泌IL-10在多种自身免疫病和过敏及炎症中发挥着缓解疾病的作用。本研究以DOCK8缺陷病患者及DOCK8KO小鼠为模型;拟探究DOCK8缺陷对Breg细胞发育及功能的影响。　　方法：利用流式细胞术检测 DOCK8 缺陷病患者外周血及DOCK8KO小鼠脾脏中Breg细胞的比例和数量。通过 DOCK8KO/WT骨髓嵌合体小鼠模型验证DOCK8蛋白缺陷时Breg缺陷是否固有存在。利用DOCK8KO小鼠脾脏CD4+ na?ve T细胞过继移植到CD4KO小鼠实验;明确DOCK8-/-CD4+T细胞是否影响Breg数量。再对DOCK8KO小鼠进行 IL-21替代治疗并观察其对Breg的影响。　　结果： 3名DOCK8缺陷病患儿外周血中Breg细胞的数量;与同龄正常对照相比明显下降（对照：2.271±0.1514%;n=10;DOCK8 患者：0.4240±0.2987%;n=3;P=0.0001）。DOCK8KO小鼠脾细胞Breg的数量也较WT小鼠降低;且OVA致敏后其下降更为明显（WT：1.477 ±0.1338%;n=3;KO：0.7133±0.1955%;n=3;P=0.03。WT-OVA：1.913±0.04702%;n=3;KO-OVA：0.09593±0.05788%;n=3;P<0.0001）。DOCK8KO/WT 骨髓嵌合体小鼠模型分析结果显示DOCK8-/-Breg数量下降（比例：WT：1.577±0.1618%;n=3;DOCK8KO：0.4267±0.1120%;n=3;P=0.0043;绝对数：WT：273047 ± 51773;n=3;DOCK8KO：45168±9175;n=3;P= 0.0123）;而DOCK8KO/μMT（B细胞缺陷小鼠） 骨髓嵌合体小鼠模型分析结果显示 DOCK8-/-Breg 数量正常（比例：WT：1.173±0.2849%;n=3;DOCK8KO：1.853±0.3032%;n=3;P=0.1775;绝对数：WT：509810±156319;n=3;DOCK8KO：590132 ±241800;n=3;P=0.7941）。将DOCK8KO小鼠或WT小鼠的CD4+na?ve T细胞过继移植到CD4+T细胞缺失（CD4KO）的小鼠中;经OVA或KLH免疫后检测;结果发现接受DOCK8-/-CD4+na?ve T细胞的CD4KO小鼠脾脏细胞Breg数量明显降低（WT-OVA：1.572±0.2849%;n=4;DOCK8KO-OVA：0.654±0.3523%;n=4;P=0.037;WT-KLH：1.260±0.3728%;n=4;DOCK8KO-KLH：0.2005±0.06033%;n=4;P=0.0309）。另一方面;通过给DOCK8KO小鼠补充外源性IL-21;其脾脏细胞Breg数量可恢复至正常。对于LPS诱导CD5+CD1dhi B细胞中的STAT3磷酸化水平;DOCK8KO小鼠较WT下降;而对于IL-21诱导CD5+CD1dhi B细胞中的STAT3磷酸化水平;DOCK8KO小鼠较WT无明显差异。　　结论：DOCK8 蛋白缺陷时 Breg 细胞数量及功能存在固有缺陷;且该缺陷是由于DOCK8蛋白缺失引起CD4+T分泌IL-21功能降低所导致;而外源性补充IL-21可恢复Breg数量至正常。推测其机制是由于DOCK8KO小鼠中LPS诱导STAT3磷酸化缺陷导致LPS诱导Breg分泌IL-10障碍;而IL-21可以通过诱导STAT3磷酸化从而恢复Breg分泌IL-10功能。　　第二部分 DNA连接酶IV综合征患儿临床、免疫学特征及基因突变分析　　背景：DNA 连接酶 IV 缺陷病是一种罕见的常染色体隐性遗传的原发性免疫缺陷病;由LIG4基因突变导致。临床表现为辐射敏感;生长发育迟缓;小头畸形;联合免疫缺陷;自身免疫性疾病和肿瘤等。国内外现有不到30例病例报道;尚无回复突变及其临床转归报道。该病的临床特点、分子和免疫学特征仍未完全阐明。　　方法：本研究纳入 7 名经 Sanger 测序或二代测序确诊具有 LIG4基因突变的病人;并对其临床资料进行分析。对一例疑

关键词： 调节性B细胞   B10   IL-10   1型糖尿病  

摘要： 第一部分人外周血B10细胞的表型及功能鉴定目的:鉴定人外周血B10细胞的表型及功能。方法:分离健康志愿者外周血单个核细胞,流式细胞术检测IL-10B淋巴细胞与IL-10-B淋巴细胞的表面标志,比较IL-10B与IL-10-B淋巴细胞表面CD分子的平均荧光强度,并比较不同B淋巴细胞亚群IL-10的分泌水平。流式细胞术分选B10细胞与CD4CD25-T细胞共培养,观察B10细胞对CD4细胞分泌IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-17及表达Foxp3的影响。采用中和抗体阻断实验探索B10细胞作用的可能机制。结果:(1)IL-10B淋巴细胞较IL-10-B淋巴细胞高表达CD24及CD38,IL-10B淋巴细胞表面CD24和CD38的平均荧光强度明显高于IL-10-B淋巴细胞,差异有统计学意义(P<0.01),CD19CD24hiCD38hiB淋巴细胞高分泌IL-10;(2)健康人外周血B10细胞能明显抑制CD4T细胞分泌IFN-γ(P<0.01)、TNF-α(P<0.01)和 IL-17(P<0.05),促进 CD4T 细胞分泌 IL-4(P<0.01)及表达Foxp3(P<0.05),结果具有统计学意义;(3)在B10细胞与CD4T细胞共培养体系中加入IL-10/IL-10R中和抗体后CD4T细胞分泌IFN-γ(P<0.01)、TNF-α(P<0.001)和 IL-17(P<0.05)水平上升,分泌 IL-4(P<0.05)及表达Foxp3(P<0.05)水平下降,结果具有统计学意义。而在加入CD80和CD86中和抗体后,CD4T细胞分泌IFN-γ(P<0.05)、TNF-α(P<0.05)水平上升,而分泌IL-17、IL-4及表达Foxp3水平未见明显改变(P>0.05)。结论:外周血B10细胞的表型为CD19CD24hiCD38hi;健康人外周血B10细胞具有免疫调节功能,可调节CD4T细胞各亚群平衡;B10细胞主要通过分泌细胞因子IL-10发挥免疫调节功能。第二部分T1D患者外周血B10细胞数量的检测与分析目的:检测和分析TID患者外周血B10细胞的数量变化。方法:本研究共入选受试者136例,其中T1D患者62例、健康对照74例。收集受试者外周血,分离单个核细胞,流式细胞术检测比较T1D患者和健康对照外周血各亚群T淋巴细胞及B10细胞的比例,分析T1D患者外周血B10细胞与T淋巴细胞亚群平衡的相关性,并分析T1D患者外周血B10细胞与初诊年龄、年龄、病程、性别及糖化血红蛋白水平的相关性。结果:(1)与健康对照相比,T1D患者外周血CD4T淋巴细胞比例较高,且其分泌IFN-γ、TNF-α及IL-17的比例增高,差异具有统计学意义(P<0.05),而分泌IL-4的比例减少,差异具有显著统计学意义(P<0.001);(2)与健康对照相比,T1D患者外周血B10细胞占B淋巴细胞的比例降低,差异具有统计学意义(P<0.05);(3)T1D患者外周血B10细胞数量与CD4T细胞数量呈负相关(P<0.05),且与其分泌IFN-γ及TNF-α的水平呈负相关(P<0.05),与CD4CD25Foxp3T细胞数量呈明显正相关(P<0.01);(4)T1D患者外周血B10细胞与年龄、初诊年龄、病程及性别均未见明显相关(P>0.05),与检测时糖化血红蛋白水平呈负相关(P<0.05)。结论:T1D患者外周血存在着T淋巴细胞亚群比例的失衡:CD4T淋巴细胞比例的增高,且CD4T淋巴细胞分泌致病性细胞因子比例增高,分泌保护性细胞因子比例降低;T1D患者外周血存在着B10细胞数量的减少;T1D患者外周血B10细胞数量与分泌致病性细胞因子的CD4T淋巴细胞数量呈反比,与保护性Tregs数量呈正比,与HbA1c呈反比,提示B10细胞数量的变化可能参与了 T1D的发病。第三部分T1D患者外周血B10细胞功能的初探目的:观察T1D患者外周血B10细胞免疫调节功能的变化,探索B10细胞参与T1D发病的可能机制。方法:分离T1D患者外周血单个核细胞,流式细胞术反向剔除B10细胞,观察对CD4T细胞分泌IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-17及表达Foxp3的影响。检测T1D患者外周血B10细胞IL-10的分泌水平。结果:(1)与健康对照组相比,T1D患者外周血单个核细胞反向剔除B10细胞后CD4T细胞分泌IFN-y、TNF-α、IL-17有上升趋势,表达Foxp3有下降趋势,但均未见明显统计学差异(P>0.05),但CD4T细胞分泌IL-4仍有下降趋势,且具有统计学意义(P<0.05);(3)与健康对照组相比,T1D患者外周血B10细胞IL-10分泌水平明显降低,差异具有显著统计学意义(P<0.001)。结论:T1D患者外周血B10细胞存在免疫调节功能缺陷,可