关键词： 艾拉莫德   调节性B细胞   白细胞介素-10(IL-10)   转化生长因子-β(TGF-β)  

摘要： 目的:通过艾拉莫德治疗大鼠胶原诱导性关节炎(CIA),研究对白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子(TGF-β)、Foxp3、Bcl-6的影响变化情况。方法:6-8周龄健康清洁级雌性Wistar大鼠30只,体质量(180-220)g,随机分成空白对照组、模型对照组、艾拉莫德组,每组10只大鼠进行实验。模型对照组、艾拉莫德组均给予牛Ⅱ型胶原(CⅡ)与完全弗氏佐剂(CFA)0.3ml/只诱导成CIA模型,治疗28天后,观察CIA大鼠体重变化情况;通过HE染色观察滑膜组织病理变化情况;利用ELISA法检测血清中IL-10、TGF-β含量;通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法检测滑膜组织中IL-10mRNA、TGF-βmRNA及脾脏中Foxp3mRNA、Bcl-6mRNA的表达水平。结果:⑴经治疗后,艾拉莫德组大鼠体重明显增加,性情变温顺;模型对照组大鼠体重增加缓慢,性情焦躁;⑵关节滑膜经HE染色后,艾拉莫德组见关节滑膜细胞层为4层(正常时为1-3层),未见明显增生及炎性细胞浸润;模型对照组关节滑膜细胞层增加到10层,可见明显增生及大量炎性细胞浸润。⑶血清IL-10含量:艾拉莫德组与模型对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。⑷血清TGF-β含量:艾拉莫德组与模型对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。⑸关节滑膜IL-10mRNA表达水平:艾拉莫德组与模型对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);⑹关节滑膜TGF-βmRNA表达水平:艾拉莫德组与模型对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);⑺脾脏中Foxp3mRNA表达水平:艾拉莫德组与模型对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);⑻脾脏中Bcl-6mRNA表达水平:艾拉莫德组与模型对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:⑴经艾拉莫德治疗后,大鼠体重呈明显增长趋势,性情变温顺;⑵经艾拉莫德治疗后,血清、关节滑膜中IL-10、TGF-β的表达及脾脏中Foxp3、Bcl-6的表达未见明显变化。⑶经艾拉莫德治疗后,Breg是否通过其他细胞因子或信号通路影响类风湿关节炎的发生发展有待进一步验证。

关键词： Nogo-B   急性肺损伤   炎症修复   Treg细胞   增殖  

摘要： 研究背景:急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory dirstress syndrome,ARDS)是临床表现为双肺弥漫性浸润、进行性下降的顽固性低氧血症的临床综合征,其肺部病理表现为肺组织被大量炎症细胞浸润、肺泡塌陷、肺间隔增宽及肺泡内透明膜形成。急性肺损伤(acute lung injury,ALI)以往被认为是ARDS的特定表现,在2012年柏林标准中将其归入ARDS中。但是在动物模型中模拟的ARDS过程,仍被被称为ALI。脓毒症是ARDS的最常见病因,其发生与细菌细胞壁脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)密切相关,因而LPS常用于诱导ARDS的动物模型。ARDS属临床急危重症,其年发病率为75/100,000人次,病死率波动在35%至46%之间。尽管历经半个世纪的研究,ARDS的发病机制仍不甚明了,人们尝试了多种药物及辅助治疗手段治疗ARDS,其中被证明有效的治疗手段寥寥无几,而药物治疗和分子治疗无一能改善ARDS的死亡率。ARDS的主要治疗方法仍为机械通气呼吸支持治疗。临床的现实迫使我们对ARDS的发病机制及病理生理过程进入深入细致的研究,从中发掘潜在治疗靶点及新的治疗方法,以期攻克疾病。本质上,ARDS的发病机制是机体在遭受重大致病因素打击后,剧烈炎症级联反应导致的广泛肺损伤。因此ARDS后的炎症修复与患者预后密切相关。Treg细胞被证实能够促进ARDS炎症的修复,在炎症修复期有着重要的功能,肺内Treg细胞数量与增殖速度直接影响患者预后。同时,Nogo-B,网状蛋白4的剪接体,广泛表达于肺组织,已被证实在多种组织损伤后,如肝硬化、爆发性肝炎等的组织修复、炎症控制等方面有着重要功能,并参与调控细胞增殖。但是,Nogo-B在ARDS炎症后组织修复的作用,以及Nogo-B与Treg细胞间的作用关系尚无研究。本研究将探究LPS诱导的ALI小鼠模型炎症修复过程中,Nogo-B扮演着什么角色,是否并且如何参与到炎症修复过程。据我们所知,该内容尚无人报道。目的:明确Nogo-B在ALI小鼠模型炎症修复期的作用,明确Nogo-B在Treg细胞急性肺损伤保护过程中的地位,以期能寻找ARDS炎症修复期的关键蛋白靶点,为A RDS的救治寻找新的思路。方法:本研究通过LPS气管滴注的方法构建ALI小鼠模型,采用迪夫快速染色法对BA L细胞BAL进行分类计数,HE染色观察肺部病理变化,获得ALI小鼠模型从发病第1天至第10天的病理生理发展特点与自然病程。通过流式细胞术检测BAL中Treg的数量,明确ALI小鼠模型中BAL Treg细胞数量与炎症修复各阶段间的关系。同时,我们应用实时定量PCR技术检测急性炎症期和炎症修复期ALI小鼠肺组织及BAL细胞N ogo-B的表达水平,并通过免疫荧光证实Nogo-B在Treg细胞中的表达,以期证实Nog o-B在ALI小鼠模型炎症修复期中表达及Treg细胞中的表达变化。其次,我们采用CRISPR/Cas9技术构建Nogo-B基因敲除小鼠。分别使用Nogo-B基因敲除小鼠和野生型小鼠复制ALI模型,描绘两组ALI模型小鼠的体重变化。采用迪夫染色对BAL细胞进行分类计数、HE染色观察肺部病理组织改变,以观察两组A LI小鼠的炎症修复期肺部损伤修复进程的差异,进一步明确Noog-B对ALI炎症修复的影响。通过流式细胞术检测两组ALI小鼠BAL中Treg细胞数量变化情况,采用ELI SA检测两组ALI小鼠BAL及血清中IL-10、TGFβ及IL-2水平的变化情况。以期观察两组小鼠ALI炎症修复期Treg细胞及抗炎因子。再次,我们采用腺病毒在体转染的方法,给与Nogo-B敲除小鼠和野生型小鼠肺部过表达Nogo-B,并通过实时定量PCR及免疫荧光的方法验证在体转染的效果。复制ALI小鼠模型,通过细胞分类计数方法计算不同Nogo-B表达小鼠ALI模型中炎症修复期中性粒细胞数量,通过肺组织HE染色观察不同Nogo-B表达小鼠肺部病理损伤程度,以期明确Nogo-B过表达对ALI小鼠模型的炎症修复进程的影响。使用流式细胞术检测不同Nogo-B表达小鼠BAL中Treg细胞数量,以期明确Nogo-B对ALI炎症修复期肺部Treg细胞数量的作用。而后,为明确Nogo-B在Treg对急性肺损伤的保护作用中的地位,我们使用过继回输方法,给Rag-/-小鼠ALI模型分别静脉回输Nogo-/-Treg细胞及WT Treg细胞,观察各组ALI小鼠肺部病理损伤程度,BAL中性粒细胞数量,使用BCA蛋白定量测量各组ALI小鼠BAL中蛋白含量。为明确不同Nogo-B表达的Treg细胞肺部募集水平的差异,我们使用流式细胞术检测以上各组ALI小鼠BAL中Treg细胞的数量。最后,为明确Nogo-B影响ALI小鼠模型

关键词： 调节性B细胞   辅助性T细胞17   IL-10   IL-17   非小细胞肺癌  

摘要： 目的:通过检测非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)患者不同临床分期、化疗前后以及健康对照人群外周血中调节性B细胞(regulatory B cell,Breg)、辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)的表达水平,分析Breg、Th17细胞与临床分期、化疗的关系,探讨Breg、Th17细胞在NSCLC疾病发展中作用。通过检测NSCLC患者以及健康对照人群外周血中IL-10、IL-17的表达水平,分析Breg细胞与IL-10、Th17细胞与IL-17的相关性,探讨Breg、Th17细胞在非小细胞肺癌发生发展中的作用机制。方法:纳入66例非小细胞肺癌患者为NSCLC组,20例健康志愿者为健康对照组。66例非小细胞肺癌患者中,Ⅰ-Ⅱ期12人,Ⅲ期26人,IV期28人,50例患者进行标准化疗两周。用CD19+CD24+CD27+定义Breg,CD4+IL-17+定义Th17。应用流式细胞技术检测研究对象外周血中CD19+CD24+CD27+Breg占CD19+B淋巴细胞的比例、CD4+IL-17+Th17占CD4+T淋巴细胞的比例,分析Breg、Th17与肺癌临床分期以及化疗的关系。通过酶联免疫吸附(ELISA)方法检测研究对象外周血细胞因子IL-17、IL-10的表达水平,分析Breg细胞与IL-10、Th17细胞与IL-17的相关性,探讨Breg、Th17细胞在非小细胞肺癌发生发展中的作用及其调节机制。采用SPSS20.0统计学软件对实验数据进行分析。结果:***组外周血中CD19+CD24+CD27+Breg细胞占CD19+B细胞的比例高于健康对照组(16.66±7.98%VS 4.41±2.56%),差异有统计学意义(P<0.05)。NSCLC组外周血中CD4+IL-17+Th17细胞占CD4+T细胞的比例高于健康对照组(1.92±1.80%VS 0.86±0.62%),差异有统计学意义(P<0.05)。***组患者按TNM分期,Ⅰ-Ⅱ期12人,Ⅲ期26人,IV期28人,不同临床分期患者外周血中CD19+CD24+CD27+Breg细胞占CD19+B细胞的比例在统计学上有差异(P>0.05),且临床分期越高,Breg细胞的表达水平越高(8.36±3.58%VS 14.97±4.98%VS21.80±7.83%)。不同分期患者外周血中CD4+IL-17+Th17细胞占CD4+T细胞的比例在统计学上有差异(P>0.05),且临床分期越高,Th17细胞的表达水平越高(0.45±0.21%VS 1.65±0.56%VS 2.80±2.38%)。***组中有50例患者选择进行常规化疗,化疗2周期后,化疗患者外周血中Breg占CD19+B细胞的比例较化疗前降低(18.13±7.71%VS 12.56±5.52%),差异有统计学意义(P<0.05),Th17细胞占CD4+T细胞比例较化疗前降低(2.39±1.84%VS 1.46±1.03%),差异有统计学意义(P<0.05)。***患者外周血中Breg与Th17的表达水平呈正相关,相关系数为0.941,差异有统计学意义(P<0.05)。***患者外周血中IL-10的表达水平高于健康对照组(198.44±46.32%VS 116.42±35.34%),差异有统计学意义(P<0.05),NSCLC患者外周血中IL-17的表达水平高于健康对照组(34.22±10.21%VS 26.18±8.71%),差异有统计学意义(P<0.05)。***患者外周血中Breg细胞与IL-10的表达水平呈正相关,相关系数为0.755,差异有统计学意义(P<0.05)。Th17细胞与IL-17的表达水平呈正相关,相关系数为0.355,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:***/Th17细胞促进非小细胞肺癌的发生、发展。***患者外周血中Breg与Th17细胞的表达水平呈正相关,表明两者可能协同发挥促肿瘤作用。***/Th17细胞可能通过调节细胞因子参与肺癌的发生、发展。

关键词： Gαq   调节性B细胞   白细胞介素-10  

摘要： 研究背景:调节性B细胞(Bregs)是一种B细胞亚群,近年来其免疫抑制功能越来越吸引众学者的研究兴趣。在包括炎症、肿瘤、自身免疫性疾病等很多疾病的小鼠模型研究中,调节性B细胞通过不同机制发挥其免疫抑制作用。此外,在人类自身免疫性疾病观察研究中发现调节性B细胞的改变与一些自身免疫病的疾病进展有关。研究证明调节性B细胞主要通过产生白细胞介素-10(IL-10)发挥抑制免疫应答的作用。Gαq是GNAQ基因编码的异源三聚体G蛋白(G protein)的α亚单位,它广泛表达于哺乳动物细胞中。近40%的G蛋白偶联受体(GPCRs)依赖于Gq家族成员来转导胞外信号。研究证明Gαq在免疫系统中发挥重要作用,对很多免疫细胞具有调控作用。然而Gαq是否对调节性B细胞的免疫调节有调控作用还没有研究明确。研究目的:利用Gnnq基因敲除小鼠研究Gαq对调节性B细胞分化和功能的调控及其可能的分子机制。研究方法:1)通过流式细胞术检测Gnaq基因敲除小鼠和野生型小鼠脾脏中脂多糖(LPS)刺激前后CD19+IL-10+调节性B细胞的比例。通过酶联免疫吸附测定检测两组培养上清中 IL-10的含量。2)分选出Gnaq基因敲除小鼠和野生型小鼠脾脏中的调节性B细胞,分别与野生型小鼠脾脏Naive CD4+ T细胞共培养,通过流式细胞术检测两组CD4+ T细胞增殖,及其分化为调节性T细胞的比例。3)用参与调控IL-10表达的主要信号通路上的信号分子的特异性抑制剂预先处理Gnaq基因敲除小鼠和野生型小鼠脾脏中的B细胞,随后LPS诱导后流式细胞术检测两组CD19+IL-10+调节性B细胞的比例。蛋白质免疫印记法验证两组B细胞在LPS刺激后相关信号分子的磷酸化水平。4)收集类风湿关节炎(RA)患者外周血,分析这些患者外周血单个核细胞(PBMCs)中CD19+CD24hiCD38hi调节性B细胞的比例和Gαq mRNA水平的相关性。研究结果:1)在Gnaq基因敲除小鼠中,经LPS诱导后CD19+IL-10+调节性B细胞的分化被抑制。2)Gnaq基因敲除小鼠脾脏调节性B细胞抑制CD4+ T细胞增殖和促进CD4+T细胞分化为调节性T细胞的能力受损。3)PI3K、Erk1/2 MAPK和p38 MAPK信号通路分子可能参与了Gαq对调节性B细胞分化的调控。4)类风湿关节炎患者外周血单个核细胞中CD19+CD24hiCD38hi调节性B细胞比例及Gαq mRNA水平降低,并且两者有显著的相关性。研究结论:本实验发现Gαq对调节性B细胞的分化及免疫抑制功能有调控作用,PI3K、Erk1/2 MAPK和p38 MAPK信号通路可能参与了 Gαq对调节性B细胞分化的调控。

关键词： 慢性阻塞性肺疾病   调节性B细胞   辅助性T细胞17   程序性细胞死亡蛋白1   程序性细胞死亡蛋白配体  

摘要： 该实验研究分为动物造模实验和临床人体实验两大部分来完成，来初步研究调节性B细胞(RegulatoryBcells，简称Breg细胞)、辅助性T细胞17(HelperTcell17，简称Th17)、调节性T细胞(RegulatoryTcells，简称Treg)及其分泌的细胞因子，程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)及其配体程序性细胞死亡蛋白配体(PD-L1)信号通路在慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺，ChronicObstructivePulmonaryDisease，COPD)发病的变化。探讨Bregs在COPD中的免疫调节作用。通过分析Breg、Treg/TH17体内的分布变化特点，分析两种调节性淋巴细胞之间作用关系，探讨Tregs、Bregs缺乏导致免疫失衡的原因，为COPD的发病提供新的思路及理论支持。　　目的：　　1.通过免疫组化检测慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)模型组及健康对照组小鼠肺组织中叉头状转录因子p3(forkheadtranscriptionfactorp3,Foxp3+)蛋白、白介素(IL)-10+及白介素(IL)-17+的表达水平，来初步评估Breg、Treg/Th17在COPD急性加重期的肺组织炎症变化中的数量趋势。　　2.通过对小鼠模型及人体标本，来检测AECOPD及健康对照外周血Breg、Treg和Th17细胞的数量变化水平，初步评估Breg、Treg/Th17在COPD急性加重期的作用。　　3.通过对小鼠模型及人体标本，来检测AECOPD及健康对照外周血IL-17，IL-10和IL-35的细胞因子的量，探讨IL-17、IL-10、IL-35变化在COPD疾病状态中的意义，并进一步分析他们与Breg、Treg/Th17之间的相关性，分析与稳定期临床指标之间的相关性。　　4.通过对小鼠模型及人体标本，来检测AECOPD及健康对照外周血Breg、Treg/Th17细胞表面上PD-1/PD-L1的表达水平，探讨PD-1/PD-L1信号通路参与在COPD患者可能的免疫调节机制，Breg、Treg/TH17与PD-1/PD-L1介导的负性免疫调节机制在COPD发病机制中的可能作用。　　5.通过检测AECOPD及健康对照外周血中血清中活性氧(ROS )、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)表达变化，分析与血液中Breg、Treg/Th17细胞数目，细胞因子水平的可能关系，旨在探索COPD过程中免疫调节失衡、氧化应激和炎症之间相互作用的可能，为进一步深入研究提供思路。。　　方法：　　1.动物实验部分：健康雄性小鼠30只，随机表法将动物分为以下两组，对照组、AECOPD模型组。应用被动香烟熏吸加气管内注入脂多糖(LPS)法建立COPD模型，小鼠被动吸烟，共8周。模型组动物于第1天和第14天经静脉留置针经鼻孔到气管内注入脂多糖，观察AECOPD小鼠模型典型的气道病理病理形态学改变;流式细胞技术检测Breg、Treg、Th17细胞数目的变化;流式细胞技术检测Breg、Treg/Th17细胞上PD-1/PD-L1的表达水平;免疫组化分析肺组织中Foxp3+、IL-10+及IL-17+阳性细胞表达水平;通过相关性分析，包括肺与外周血Breg、Treg/Th17细胞数目的相关性，PD-1/PD-L1的表达相关性。　　2.人体实验第一部分：纳入45例COPD急性加重期的患者为AECOPD组(男性30例，女性15例);30例健康志愿者(Healthy Controls,HC)为健康对照组，男例20，女10例，肺功能检查结果正常。AECOPD入选标准:曾行肺功能检查确诊的COPD患者，因COPD急性发作入院，所有入组的COPD诊断标准均参考2013年修订版的COPD诊治指南。应用流式细胞技术分析两组研究对象外周血Breg、Treg/Th17细胞比例水平;应用流式细胞技术分析观察Breg、Treg/Th17细胞上PD-1/PD-L1的表达水平;通过ELISA方法检测AECOPD、正常对照组患者血清中IL-10、IL-35、IL-17的水平。通过ELISA方法检测AECOPD、正常对照组患者血清中ROS、MDA的水平。通过比色法检测患者血清中SOD的水平。通过相关性分析，包括Breg、Treg/Th17细胞比例，IL-17，IL-10和IL-35的表达水平，SOD、ROS、MDA的水平之间的相关性。　　3.人体实验第二部分：共75例稳定期COPD患者(男47例，女28例)，健康对照30例(15名男性和15名女性)被纳入本研究，所有入组的COPD诊断标准均参考COPD诊治指南，稳定期COPD标准：患者病情基本恢复到急性加重前的状态，呼吸道症状相对稳定。通过酶联免疫吸附测定法测定血清IL-17，IL-10和IL-35的表达水平。慢

关键词： 变应性鼻炎   CD23   IL-10   调节性B细胞  

摘要： 背景和目的变应性鼻炎（allergic rhinitis,AR）又称过敏性鼻炎（hypersensitive rhinitis）,是鼻科常见病之一,是由抗原提呈细胞引起的过敏原摄取,由IgE介导的,T细胞向Th2的极化所引起的I型变态反应性疾病,并与变应性哮喘具有密切联系。近年来,AR在大多数国家和地区发病率显著上升,据统计全球平均发病率为10%40%,我国平均发病率为11%,,疾病负担日益加重,已成为全球性的健康问题。IgE具有2种不同的受体,即高亲和力受体FcεRI和低亲和力受体CD23（FcεRII）。CD23可在B细胞、单核细胞、T细胞、树突状细胞、血小板等细胞表面表达,主要有细胞膜表面和可溶状态两种存在形式。越来越多的证据表明,CD23在通过IgE促进的抗原呈递在控制变应原特异性T细胞的活化中起重要作用,最新研究发现B细胞上的CD23的表面密度决定了通过IgE促进的变应原呈递,进而导致过敏原特异性T细胞的激活。调节性B细胞（Breg cells,Bregs）是能够产生IL-10并发挥负向免疫调节作用的B细胞群。近年来发现了Bregs的其它免疫学功能,包括抗原提呈、分泌多种细胞因子等。在实验性免疫性脑脊髓膜炎、胶原诱导的关节炎、慢性结肠炎以及多发性硬化等疾病的动物模型中都已证实Bregs具有负向免疫调节作用。在变应性疾病中,Bregs可以通过分泌IL-10、转化生长因子β（TGF-β）等细胞因子的方式促进调节性T细胞（Treg cells,Tregs）的分化或是直接抑制免疫性T细胞的增殖。T型辅助性细胞分为1型（Th1）和2型（Th2）,是适应性免疫系统的主要反应,其分泌的细胞因子、效应细胞、免疫蛋白不同。在Th1为主反应的期间,T型辅助细胞主要分泌IL-2、IFN-γ;在Th2为主反应的期间,T型辅助细胞主要分泌IL-4、IL-5和IL-13;肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞为主要的效应细胞;并能产生IgE。而变应性鼻炎即为Th2反应为主的变态反应。本研究旨在阐明B细胞上的CD23的表达,与调节性B细胞分泌IL-10水平以及后续T细胞的活化在变应性鼻炎发生发展中的作用。实验方法第一阶段动物试验阶段,取48只SPF级雌性的SD大鼠,采用随机的原则分为空白对照组（A组）、变应性鼻炎组（B组）、鼻腔滴入组（C1组）,皮下注射组（C2组）,每组12只。第1、5、14、21天,正常对照组采用氢氧化铝佐剂腹腔注射作为阴性对照,变应性鼻炎组、抗体干预组（C1和C2）用氢氧化铝联合卵清蛋白腹腔注射进行基础及强化致敏后,第22-35天,空白对照组用生理盐水滴鼻作为阴性对照,变应性鼻炎组、抗体干预组均采用10%的卵清蛋白生理盐水溶液滴鼻,1次/天;抗体干预组在卵清蛋白生理盐水溶液滴鼻激发前30分钟,鼻腔滴入组给予抗CD23抗体滴鼻处理,1次/天;皮下注射组给予抗CD23抗体大鼠右腿股部皮下注射处理,1次/天。末次激发完成后,观察记录各组大鼠在规定时间内（30min）的鼻部症状,记录完成后对空白对照组给予生理盐水加1%的伊文思蓝（Evens蓝）混合液0.1ml背部皮内注射作为阴性对照,变应性鼻炎组、抗体干预组,给予含有1mg卵清蛋白加1%的伊文思蓝（Evens蓝）混合液0.1ml皮内注射,记录局部皮肤硬结及染料扩散情况,水合氯醛麻醉后进行腹主动脉取血,最后用颈椎脱臼法处死大鼠。HE染色观察鼻黏膜组织学变化及嗜酸性粒细胞浸润情况,免疫荧光检测CD23、CD19、IL-10在四组大鼠鼻腔黏膜中的表达量。酶联免疫吸附试验ELISA检测四组小鼠血清中总IgE、OVA-IgE、IL-10、IL-4、IFN-γ。流式加BD QuantiBRITE PE珠检测血液中CD19+CD23+、CD19+CD5+CD1d+B细胞百分率及B细胞表面CD23的表面密度及CD3+CD4+T细胞百分率。第二阶段临床试验阶段,搜集我院鼻科住院患者40例,其中单纯鼻中隔偏曲患者20例作为对照组（甲组）,过敏性鼻炎患者20例作为实验组（乙组）,均依据2015年变应性鼻炎诊断和治疗指南（2015年,天津）确诊或排除诊断,取其鼻中隔粘膜及静脉血。HE染色观察鼻粘膜组织学变化及嗜酸性粒细胞浸润情况,免疫荧光检测CD23、CD19、IL-10在两组鼻粘膜中的表达量。酶联免疫吸附试验ELISA检测两组血清中总IgE、IL-10、IL-4、IFN-γ水平。流式联合BD QuantiBRITE PE珠检测血液中B细胞膜表面CD19+CD23+、CD19+CD5+CD1d+B细胞百分率及B细胞上CD23的表面密度及CD3+CD4+T细胞百分率。结果与空白对照组大鼠（A组）相比,变应性鼻炎组（B组）的喷嚏、挠鼻次数明显增加;皮下硬结明显,染料扩散;鼻粘膜HE染色出现大量的嗜酸性粒细胞浸润

关键词： 狼疮鼠   BAFF   IL-35   CD5+CD1dhiFcg RIIbhiB细胞   Tregs   MZ B细胞   BAFFR   TACI   NF-κB1通路   狼疮鼠   抗BAFF治疗   狼疮鼠   BAFF   IL-35   Bregs   Tregs   狼疮鼠   SLE患者   皮损   BAFF   IL-35  

摘要： 第一部分外源性BAFF对狼疮鼠Bregs/Tregs分泌IL-35的影响【目的】研究BAFF是否影响狼疮鼠脾脏中Bregs/Tregs分泌IL-35及相关机制。【方法】采用磁珠分选法分选狼疮鼠及对照鼠脾脏边缘区及滤泡区(MZ&FO)B细胞、CD4+CD25-T细胞以及CD4+CD25+Tregs;经流式细胞术、Western-blotting及real time RT-PCR分别检测不同处理组B细胞内IL-35两亚基p35、EBI3的蛋白及m RNA水平的变化并通过ELISA法检测培养上清中IL-35的分泌水平;采用流式细胞术分析产IL-35 B细胞的表型、T细胞表面BAFF受体表达情况以及不同处理组T细胞内p35、EBI3的变化;流式分选CD5+CD1dhi Fcg RIIbhi B细胞亚群并与CD4+CD25-T细胞或CD4+T细胞1:1共培养,经流式细胞术检测T细胞胞内IFN-γ、TNF-α及IL-35的表达水平。【结果】与对照鼠相比,狼疮鼠脾脏B细胞表达更高水平的IL-35,且在一定浓度范围内,外源性BAFF可促进狼疮鼠及对照鼠脾脏B细胞分泌IL-35;BAFF诱导的产IL-35的B细胞主要来源MZ B细胞亚群且具有CD5+CD1dhi Fcg RIIbhi独特的细胞表型;该群CD5+CD1dhi Fcg RIIbhi B细胞通过分泌IL-35抑制CD4+CD25-T细胞分泌炎性细胞因子IFN-γ及TNF-α,诱导CD4+CD25+Tregs增殖并促进CD4+T细胞进一步分泌IL-35从而形成正反馈环路,发挥显著的免疫抑制效应。此外,Tregs表达BAFF受体(BAFF-R及TACI)且外源性BAFF能有直接促进Tregs分泌IL-35。【结论】在狼疮鼠中,BAFF不仅是重要的致病因子,更能够在一定条件下通过诱导CD5+CD1dhiFcg RIIbhi B细胞及Tregs分泌IL-35而发挥免疫调节功能,体现了调节免疫的双面性。第二部分BAFF体外促进狼疮鼠Bregs产生IL-35的作用机制【目的】探讨BAFF诱导狼疮鼠脾脏中Bregs分泌IL-35的相关信号通路。【方法】磁珠分选法分选狼疮鼠脾脏MZ B细胞;采用BAFF受体及NF-κB通路拮抗剂处理细胞后经流式细胞术及Western-blotting检测不同处理组B细胞内p35、EBI3的蛋白水平;并经ELISA法检测不同处理组培养上清液中IL-35的分泌水平。【结果】阻断BAFF-TACI结合后,B细胞胞内p35、EBI3的表达明显下降,而阻断BAFF-BAFFR结合后p35、EBI3的表达仅轻度下降且无统计学差异。然而,封闭BAFF-R或TACI后细胞培养上清中IL-35的分泌水平均下降明显;进一步阻断胞内总NF-κB及经典的NF-κB1通路后,胞内p35、EBI3的表达以及细胞培养上清中IL-35的分泌水平均明显降低。【结论】BAFF与TACI受体结合并通过经典的NF-κB1通路促进B细胞分泌IL-35。第三部分体内验证BAFF对狼疮鼠脾脏Bregs/Tregs分泌IL-35的影响【目的】体内验证狼疮鼠脾脏中BAFF对Bregs分泌IL-35的影响及相关机制。【方法】向狼疮鼠尾静脉注射PBS或抗BAFF蛋白,10天后终止动物实验,收集10天前后狼疮鼠眼球外周血。采用ELISA法检测狼疮鼠治疗前后及不同处理组血清BAFF及IL-35的水平;流式细胞术检测并分析脾脏中产IL-35 B/T细胞的比率变化及表型;经共聚焦显微镜直接观察不同处理组脾脏组织中产IL-35 B细胞的变化。【结果】相对于对照鼠,狼疮鼠血清中BAFF及IL-35的水平均明显升高且二者呈正相关,脾脏中产IL-35的CD19+B细胞、CD4+CD25+Foxp3+Tregs、产IL-35的CD4+T细胞比率均高于对照鼠;抗BAFF治疗后狼疮鼠血清中BAFF水平明显下降,而血清IL-35的水平虽有轻度下降但无统计学差异;脾脏中产IL-35的CD19+B细胞及CD5+CD1dhiFcg RIIbhi B细胞比率均明显降低,CD4+CD25+Foxp3+Tregs、产IL-35的CD4+T细胞比率亦可见显著下降;此外,脾脏中产IL-35的B细胞具有CD21+CD23-细胞表型,与MZ B细胞的表面标志相符。【结论】实验表明BAFF可诱导MZ B细胞转化为产IL-35的CD5+CD1dhi FcγRIIbhi B细胞,而抗BAFF治疗能够明显减少产IL-35的Bregs及Tregs,解释了临床上贝利单抗治疗效果不佳的原因,揭示了BAFF在自身免疫性疾病中的新的免疫调节功能。第四部分体内验证狼疮鼠及SLE患者皮损内BAFF对IL-35的影响【目的】体内验证狼疮鼠及SLE患者皮损内BAFF、IL-35以及产IL

关键词： 自身免疫性肝炎   B淋巴细胞   白细胞介素10   调节性B细胞  

摘要： 目的自身免疫性肝炎（Autoimmune Hepatitis,AIH）是一种免疫过度活跃介导的以肝脏为靶器官的获得性自身免疫性疾病。传统观念中B细胞主要通过产生特异性抗体及提呈抗原正向调节免疫反应参与自身免疫疾病的发病[1,2]。随着研究的深入,一类被命名为调节性B细胞（Regulatory B cells,Bregs）的具有负向免疫调节功能的B细胞亚群进入人们的视野,其主要通过产生IL-10等免疫抑制性细胞因子发挥作用[3]。研究发现,多种自身免疫性疾病的发生均和异常的B细胞数目及功能相关。目前B细胞亚群参与AIH发病的机制尚不明确,因此本研究通过对AIH患者及健康对照者外周血经典B细胞亚群、Bregs细胞的变化及相关抑制性细胞因子IL-10的表达进行检测,初步探讨其在AIH发病机制中的意义。方法选取2016年10月至2017年12月于天津医科大学总医院消化科就诊的AIH患者30名,患者均尚未接受免疫治疗,并排除其他免疫疾病或恶性肿瘤病史。阴性对照组为30名从天津医科大学总医院查体中心随机抽取的与AIH组信息（性别、年龄等）相匹配,且既往无肝功能损害、自身免疫性疾病或恶性肿瘤病史的体检者。收集受试者空腹外周静脉血,提取单个核细胞,在LPS+淋巴细胞刺激液（BD公司）刺激下培养5小时。第一部分AIH患者外周血B细胞及经典B细胞亚群数量分析流式细胞术检测并比较AIH组及阴性对照组外周血B细胞占淋巴细胞比例,及四种经典B细胞亚群(CD19+CD27-CD38++未成熟B细胞、CD19+CD27-CD38-/+幼稚B细胞、CD19+CD27+CD38-/+记忆B细胞、CD19+CD27+CD38++浆细胞)的比例差异。第二部分AIH患者外周血IL-10表达水平采用酶联免疫吸附试验（ELSIA）法,检测AIH组及阴性对照组外周血清中的IL-10水平。第三部分AIH患者外周血调节性B细胞表型鉴定及亚群分析流式细胞术检测并比较AIH组及阴性对照组外周血CD19+IL-10+调节性B细胞比例,确定AIH患者外周血调节性细胞亚群表型,检测并比较AIH组和阴性对照组外周血调节性B细胞亚群比例的差异。结果（1）AIH患者外周血CD19+B细胞占淋巴细胞的比例为（7.29%±2.59%）,与阴性对照组（8.28%±2.13%,P=0.11）比较无统计学差异。AIH患者外周血CD19+CD27-CD38++未成熟B细胞占CD19+B细胞的比例为（6.78%±1.78%）,与阴性对照组（7.28%±1.25%,P=0.215）比较无统计学差异;CD19+CD27+CD38++浆细胞占CD19+B细胞的比例为（4.43%±1.11%）,显著高于阴性对照组（1.75%±0.64%,P<0.001）;CD19+CD27+CD38-/+记忆B细胞占CD19+B细胞的比例为（31.63%±6.76%）,显著高于阴性对照组（21.29%±5.19%,P<0.001）;CD19+CD27-CD38-/+幼稚B细胞占CD19+B细胞的比例为（57.16%±7.87%）,显著低于阴性对照组（69.18%±5.19%,P<0.001）。（2）AIH患者外周静脉血清中IL-10水平为[（45.31±8.06）pg/ml],低于阴性对照组[（52.85±7.52）pg/ml,P=0.044]。（3）AIH患者外周血CD19+B细胞中CD19+IL-10+细胞的比例为（0.84%±0.28%）,显著低于阴性对照组（2.34%±0.62%,P<0.001）。AIH患者外周血CD19+B细胞中CD19+CD24hiCD38hi（调节性B细胞）的比例为（3.17%±0.92%）,显著低于阴性对照组（5.93%±1.12%,P<0.001）;CD19+CD24hiCD27+（前调节性B细胞+调节性B细胞）的比例为（6.05%±1.21%）,显著低于阴性对照组（10.37%±1.25%,P<0.001）。结论AIH患者相较于阴性对照组,外周血B细胞比例无明显差别,但其亚群的构成比存在差异。其中记忆B细胞、浆细胞比例显著增高,幼稚B细胞比例显著降低。AIH患者体内抑制性细胞因子IL-10水平降低,Bregs细胞数量及功能降低,导致其不能有效的抑制炎症反应,提示B细胞亚群数量和功能的失衡可能参与了AIH的发病。

关键词： NMOSD   IL-35   流式细胞仪   调节性B细胞   调节性T细胞  

摘要： 目的视神经脊髓炎谱系疾病（Neuromyelitis Optica spectrum disorders,NMOSD）是一种中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）自身免疫的炎症性疾病,特点是严重免疫介导的脱髓鞘和轴突损伤,其主要靶向目标是视神经和脊髓。白细胞介素-35（interleukin-35,IL-35）是由活化的炎症细胞分泌的负向免疫调节因子,在维持免疫稳态中具有重要作用。本文旨在研究IL-35在NMOSD中发生、发展的意义。方法收集2016年6月至2017年12月于天津医科大学总医院神经内科住院治疗的NMOSD患者35例。同时,选取我院体检中心年龄、性别相匹配的健康查体者35人作为健康对照组（healthy controls,HCs）。采集受试者血标本并记录性别、年龄、身高、体重、血脂、血糖、相关免疫指标等基本情况,同时记录患者脊髓受累节段数、首发年龄、诱因、病程及临床症状等基本资料,对所有急性期的患者进行扩展残疾状态量表（Expanded Disability Status Scale,EDSS）评分。使用细胞荧光免疫染色法检测患者血清中水通道蛋白4抗体（Aquaporin-4antibody,AQP4-Ab）水平,同时利用流式细胞仪分析在外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMCs）中标记CD19+CD138+IL-35+和CD4+CD25+IL-35+的细胞频率。采用Mann-Whitney秩和检验比较NMOSD组与HCs组之的间差异,Spearman等级相关分析用于分析IL-35+细胞频率与临床特点之间的相关性。P<0.05认为差异有统计学意义。结果***患者中有35例血清行AQP4-Ab检查其中阳性的有11例。***患者PBMCs中CD19+CD138+IL-35+细胞频率为7.99±5.27,较HCs显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）。***患者PBMCs中CD4+CD25+IL-35+细胞频率为0.89±0.60,较HCs组显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）。4.35例NMOSD患者CD19+CD138+IL-35+和CD4+CD25+IL-35+细胞频率与急性期EDSS评分存在负相关,但与复发次数及年复发率、脊髓受累节段数无明显相关性。结论***患者急性期T、B细胞分泌的IL-35明显降低,提示IL-35在NMOSD疾病的发病过程中起到了抑制炎性反应的作用,且有希望成为疾病急性期的炎性指标之一。***急性期IL-35细胞频率与急性期EDSS评分存在明显的负相关性,提示它可能是NMOSD病情严重程度的标记物。

关键词： 肾移植   髓源性抑制细胞   调节性B细胞   免疫状态  

摘要： 目的探究髓源性抑制细胞与调节性B细胞在肾移植受者不同免疫状态下的变化规律并分析两者的相关性,评估两者在肾移植术后不同免疫状态中的作用。方法1、收集2016年10月至2017年5月于郑州大学第一附属医院行肾移植手术的30例受者术前1天及术后1天、7天、14天、30天、90天的外周静脉血,应用流式细胞术检测MDSC与调节性B细胞水平的动态变化;2、以健康正常人作为对照,分析对比尿毒症患者、肾移植术后肾功能稳定患者、移植术后感染患者和急性排斥反应患者外周血的MDSC与调节性B细胞的水平;3、在肾移植不同免疫状态下分析MDSC与调节性B细胞的相关性。结果1、肾移植受者外周血中MDSC、Mo-MDSC、G-MDSC细胞水平均呈现相似的变化趋势:以移植术前1天水平（2.02%±1.90%,0.39%±0.30%,1.63%±1.48%）作为基线,术后1天各细胞比例大幅度上升达到峰值（6.76%±4.85%,1.21%±0.85%,5.55%±3.01%）,与术前水平相比具有统计学差异（P<0.001）;术后1天至30天,细胞水平呈现下降趋势,术后30天各细胞亚群比例（2.01%±1.84%,0.53%±0.36%,1.49%±1.01%）与术前1天水平相当;术后30天至90天,细胞比例缓慢上升至（2.34%±1.38%,0.68%±0.39%,1.67%±1.01%）,高于移植前水平,但差异性并无统计学意义（P>0.05）。CD19+CD24hiCD38hiIL-10+B细胞与CD19+CD24hiCD27+IL-10+B细胞在肾移植术后1天大幅度升高（3.59%±2.43%）、（3.00%±2.01%）并维持高水平至术后7天（3.74%±2.02%）、（3.01%±1.96%）,与术前1天（0.48%±0.45%）、（0.54%±0.41%）相比均具有显著性差异（P<0.001）;术后30天细胞比例降到（0.58%±0.51%）、（0.49%±0.40%）,与术前水平相比无统计学差异;术后30天至90天,细胞比例逐渐上升至（1.31%±1.24%）、（1.41%±1.13%）,高于移植前水平,差异具有统计学意义（P<0.05）。2、移植肾功能稳定组的Mo-MDSC、G-MDSC细胞水平为（0.62%±0.42%）、（1.68%±1.59%）,高于对照组（0.34%±0.29）、（1.45%±1.17%）与尿毒症组（0.39%±0.29%）、（1.52%±1.20）,但差异无统计学意义。术后感染患者机体Mo-MDSC的水平（1.90%±1.72%）显著高于正常人、尿毒症患者与移植术后稳定受者,差异具有统计学意义（P<0.05）;急性排斥反应患者的G-MDSC的水平（0.47%±0.53%）低于稳定组受者,两者间差异间具有统计学意义（P<0.05）,同时低于正常人及尿毒症组水平,但差异无统计学意义。移植肾功能稳定组的CD19+CD24hiCD38hiIL-10+B细胞（1.31%±1.25%）与CD19+CD24hiCD27+IL-10+B细胞（1.42%±1.40%）水平显著高于对照组（0.55%±0.59%）(0.69%±0.63%)与尿毒症组（0.48%±0.74%）(0.53%±0.81%),差异具有统计学意义（P<0.01）。肾移植术后感染患者（0.62%±1.21%）、（0.64%±0.34%）及急性排斥反应患者（0.27%±0.27%）、（0.24%±0.25%）的两种细胞比例显著低于移植肾功能稳定组受者,差异具有统计学意义（P<0.05）,与正常人、尿毒症患者间差异无统计学意义。3、移植肾功能稳定组受者外周血MDSC比例与CD19+CD24+CD38+IL-10+B细胞比例及CD19+CD24+CD27+IL-10+B细胞比例均具有相关性（r=0.437,P=0.016）、（r=0.483,P=0.007）,而在正常人、尿毒症患者、移植术后感染患者及急性排斥反应患者外周血中MDSC与Breg细胞间未见明显相关性。结论1、在免疫重构中,MDSC细胞主要受手术炎症反应的刺激而扩增,从而保护机体对抗炎症反应,同时部分MDSC细胞参与到早期的免疫调节中;Breg细胞的扩增主要由同种异体抗原的刺激作用,有助于抑制早期排斥反应及参与免疫调节。2、Mo-MDSC主要在肾移植术后感染时发挥抑制炎症反应效应,而G-MDSC的动员及募集可能与急性排斥状态中发挥免疫抑制效应有关;Breg细胞高水平状态与移植免疫平衡密切相关,其水平的降低预示着免疫平衡的打破,Breg细胞可作为免疫平衡的重要标志性细胞。3、移植肾功能稳态下,MDSC有可能具有诱导IL-10+Breg细胞扩增的功能,两者协同维持免疫平衡状态;MDSC与Breg细胞可以作为监测肾移植术