关键词： 浸润性乳腺癌   PD-1/PD-L1信号   调节性B细胞   肿瘤免疫  

摘要： 第一部分CD19和PD-1分子在浸润性乳腺癌组织中的表达及其生物学意义目的:研究浸润性乳腺癌肿瘤组织中CD19及PD-1分子的表达情况及其生物学意义。方法:采用免疫组织化学染色技术检测乳腺肿瘤患者肿瘤组织中CD19、PD-1分子的表达情况,并分析其与浸润性乳腺癌临床病理参数之间的关系以及这二者之间的共表达性。结果:(1)浸润性乳腺癌组织中,CD19和PD-1分子在肿瘤浸润性淋巴细胞中的表达显著高于乳腺纤维腺瘤,差异均具有统计学意义(P=003;P<0.0001);(2)浸润性乳腺癌肿瘤组织中,CD19与PD-1分子存在明显的共表达性(P=0.011,Kappa=0.177)。结论:在浸润性乳腺癌组织中,CD19及PD-1分子在肿瘤浸润性淋巴细胞中的表达显著高于乳腺纤维腺瘤组织,且二者存在明显的共表达性。第二部分乳腺肿瘤患者外周血中CD19、PD-1、Bregs及血清中sPD-L1、IL-10的表达及其生物学意义目的:研究乳腺肿瘤患者外周血中CD19+B细胞、PD-1+B细胞、Bregs的表达情况以及血清中sPD-L1、IL-10的表达情况。方法:利用流式细胞术检测健康人及乳腺良恶性肿瘤患者外周血中CD 19+B、PD-1+B cells及Bregs百分比的差异;利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乳腺良恶性肿瘤患者血清中sPD-L1、IL-10的水平;并分析浸润性乳腺癌患者血清中sPD-L1、IL-10的水平与各B细胞亚群间的相关性。结果:(1)浸润性乳腺癌患者外周血中PD-1+B cells、Bregs的百分比显著高于乳腺纤维腺瘤患者及健康人(P<0.001;P<0.0001);(2)浸润性乳腺癌患者血清中sPD-L1、IL-10的表达均高于乳腺纤维腺瘤患者(P<0.05;P<0.0001),且二者的表达呈正相关(r=0.267,P=0.005);(3)浸润性乳腺癌患者外周血中Bregs与血清中sPD-L1、IL-10之间呈正相关(r=0.205,P=0.041;r=0.206,P=0.037),而 CD19+B、PD-1+B cells 则分别与血清中 sPD-L1、IL-10之间为负相关(r=-0.295,P=0.002;r=-0.223,P=0.022)。结论:浸润性乳腺癌患者外周血中PD-1+B cells、Bregs以及血清中sPD-L1、IL-10均呈较高水平,且浸润性乳腺癌患者血清中sPD-L1与Bregs的分化关系密切。第三部分PD-1/PD-L1信号对调节性B细胞的诱导作用目的:进一步研究PD-1/PD-L1信号对Bregs分化的作用,以及对乳腺癌细胞株增殖与凋亡的影响。方法:使用T细胞、B细胞以及乳腺癌细胞株进行共育实验,研究PD-1/PD-L1信号的活化对Bregs的分化及IL-10mRNA表达的影响,并比较不同共育条件下的T、B细胞对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响。结果:(1)不同浓度sPD-L1蛋白均可体外诱导Bregs分化及IL-10mRNA的表达,并具有剂量依赖性(P<0.0001,P<0.0001);(2)T细胞、B细胞共育实验显示,sPD-L1预刺激组中Tregs的比例以及转录因子Foxp3的表达均高于其他各组(P<0.05);(3)T细胞、B细胞与肿瘤细胞株的共育实验显示,经sPD-L1预刺激组可明显促进肿瘤细胞的增殖(P<0.05);sPD-L1预刺激组中肿瘤细胞的凋亡显著低于其他共育组(P<0.05)。结论:PD-1/PD-L1信号可诱导Bregs的分化及上调IL-10mRNA的表达,并通过增加Tregs 比例来促进肿瘤细胞的增殖和抗凋亡作用。

关键词： 原发免疫性血小板减少症   增殖诱导配体   B淋巴细胞刺激因子   调节性B细胞   白细胞介素-10  

摘要： [目的]原发免疫性血小板减少症(Primary immune thrombocytopenia,ITP)是一种由体液免疫和细胞免疫异常导致血小板破坏增多而生成减少的自身免疫性出血性疾病,约占出血性疾病总数的1/3。增殖诱导配体(APRIL)是肿瘤坏死因子超家族中的新成员,与B细胞活化因子BAFF在结构和功能上十分相似。APRIL作为可溶性因子被各种细胞分泌,如非活化性B细胞、T细胞、单核细胞、树突状细胞、巨核细胞和巨噬细胞等。APRIL不仅在正常的免疫应答中起作用,在建立和维持自身免疫性和炎性疾病中也有重要的作用,尤其是在B细胞的增殖中起调控作用,介导免疫球蛋白类别的转换,并影响T细胞的应答。既往报道,通过实时定量PCR检测发现,与正常对照相比较ITP患者的外周单个核细胞中APRIL的mRNA水平明显上调,并且ITP患者血浆中可溶性APRIL的含量对比正常对照也是明显增高的。也有许多研究报道,在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮及原发性系统性硬化症等自身免疫系统疾病中,APRIL的表达水平也是明显升高的,并且其靶向药物贝利木单抗和阿塞西普已经应用于类风湿性关节炎的治疗中。基于APRIL具有促进增殖和调节免疫功能的作用,我们猜测,APRIL可能也参与了ITP自身免疫紊乱的发生与发展。本研究将明确血小板表面是否表达APRIL以及APRIL的表达量是否存在异常,进一步深入阐明APRIL是否以及如何介导血小板对ITP自身免疫发挥反向调控作用,并为发展新的治疗干预措施提供理论基础。[方法](1)本研究组入组诊断明确的ITP患者50人,另入组同期选取健康对照(HC相比)25例(年龄、性别匹配),采集外周静脉血,分离出血浆和外周血单个核细胞(PBMC)。(2)将血浆通过高速离心法分离,收获血小板。(3)流式细胞术检测ITP患者和正常对照的血小板表面膜表面结合型APRIL的表达水平。(4)分析ITP患者血小板表面膜表面结合型APRIL的水平与患者临床指标(血小板计数、血小板自身抗体、疗效等)之间的关系。(5)流式细胞术检测ITP患者外周单个核细胞中CD19+CD24hi CD38hi Bregs细胞亚群的含量,并与健康对照组比较分析。(6)通过ELISA检测ITP患者和正常对照的血浆中可溶性APRIL的含量水平。(7)给予APRIL体外刺激ITP组和HC组外周血单个核细胞,流式细胞术检测B10细胞含量变化。同时观察加用APRIL阻断剂后B10细胞含量的变化。(8)分别给予APRIL体外刺激和BLys体外刺激ITP组和HC组外周血单个核细胞细胞,流式细胞术检测加入不同刺激因子后对B10细胞含量产生的变化。[结果](1)经流式细胞术检测结果显示,初诊和慢性ITP患者血小板表面APRIL的表达量明显低于健康对照组MFI(1120.0400±241.4837)(p<0.001),此外,初诊ITP患者组较慢性ITP患者组更低MFI(626.1200±93.6978 VS 806.8400± 198.9369,p=0.001),差异具有统计学意义。并且,血小板计数与APRIL荧光强度呈正相关(r=0.396;p=0.015),差异具有统计学意义。ITP患者血小板计数越高,其表面APRIL的荧光强度越高。(2)特异性抗血小板膜蛋白抗体阳性组血小板表面APRIL的荧光强度高于特异性抗血小板膜蛋白抗体阴性组MFI(958.7143±221.4511 VS 693.9091±128.3156)(p=0.05),差异具有统计学意义。10例治疗完全缓解组ITP患者治疗后较治疗前血小板表面APRIL的荧光强度明显增强 MFI(721.3000±134.0481 VS 599.6000±70.32338,p=0.02),差异具有统计学意义。然而,在8例治疗无效组的ITP患者中,治疗前后血小板表面APRIL的荧光强度没有明显的变化(872.6667±225.53935 VS 846.0000±204.91624,p=0.81)。(3)ITP患者初治组和慢性组血浆中可溶性APRIL水平明显高于正常对照组(6.8770±2.9066pg/ml)(p=0.04 VS p=0.06)。ITP患者初治组和慢性组血浆中可溶性APRIL水平没有明显差异(10.4665±5.2198pg/ml VS 10.6993±5.0411pg/ml,p=0.856)。我们之后分析了血浆可溶性APRIL水平与患者临床指标的相关性,我们发现血浆可溶性APRIL的含量与血小板数目呈负相关(r=-0.3443,p=0.029)。(4)与正常对照相比,ITP患者Bregs含量明显降低,差异具有统计学意义。Bregs的含量与血小板计数呈正相关,差异具有统计学意义(5)加入APRIL因子刺激组的B10细胞的含量明显

关键词： 免疫性血小板减少症   间充质干细胞   调节性B细胞   基质衍生因子 1α   白介素10  

摘要： 研究背景免疫性血小板减少性症是一类以出血为主要表现的自身免疫性疾病,患者体内存在多种免疫调节细胞功能及数量的异常,其中自身反应B细胞可产生的致病性抗体可以介导血小板的破坏。间充质干细胞具有免疫调节功能,临床已有将其用于控制免疫反应的案例,B胞之中也存在着具有免疫调控功能的亚群,其可能是间充质干细胞发挥免疫调节的作用对象之一。研究目的探究间充质干细胞在SDF-1α的作用下调控ITP患者外周血中CD19+B细胞向调节性B细胞亚群分化的机制。研究方法采集健康人和ITP患者的外周血,分离外周血单个核细胞,测定CD19+细胞中表达IL-10的细胞及CD19/CD24hi/CD38hi细胞的比例,以此来反应ITP患者外周血中调节性B细胞的含量,并将其与间充质干细胞进行共同培养,流式细胞仪测定培养前后外周血单个核细胞群体中具有分泌IL-10能力的细胞亚群与表达CD19/CD24hi/CD38hi细胞的比例;使用ELISA的方法检测培养液中IL-10的含量。q-PCR测定经SDF-1α刺激后的间充质干细胞内miRNA-133的含量变化,进一步将间充质干细胞与来源自ITP患者的外周血单个核细胞共培养,流式检测培养前后外周血单个核细胞内亚群的变化情况。研究结果ITP患者CD19+亚群之中,表达IL-10的细胞及表型为CD19/CD24hi/CD38hi细胞的比例较正常对照均有所下降(2.40±0.62%vs 8.12±1.21%,2.11±0.35%vs 6.02±0.44%,P<0.05);将其与间充质干细胞共同培养后,与单独培养的外周血单个核细胞相比,其中表达IL-10的细胞及表型为CD119/CD24hi/CD38hi细胞的比例上升(5.78±0.86%vs2.44±0.58%,5.42±0.53%vs2.01±0.46%,P<0.05),共同培养液中IL-10的含量也有所上升(830.55±70.71 pg/ml vs 180.06±23.11 pg/ml,P<0.05)。使用SDF-1α刺激间充质干细胞之后,间充质干细胞内miRNA-133的表达上升(3.64±0.30)。进一步向间充质干细胞内转染合成的miRNA-133干扰物,经转染之后的间充质干细胞再次与来自ITP患者的外周血单个核细胞共同培养,与未经转染的间充质干细胞相比,转染miRNA-133干扰物后的间充质干细胞诱导来自ITP患者外周血的外周血单个核细胞中表达IL-10的细胞及表型为CD19/CD24hi/CD38hi细胞的比例下降(3.21±0.54%vs 5.78±0.86%;2.1±0.33%vs5.02±0.57%,P<0.05)。结论ITP患者外周血单个核细胞中调节性B细胞的比例较正常对照下降,表明TIP患者体内存在调节性B细胞减少,而c间充质干细胞可以在体外诱导来自患者的外周血单个核细胞中调节性B细胞亚群的分化。经一定浓度(0.1 ug/ml)SDF-1α刺激后,间充质干细胞内的miRNA-133表达升高;降低miRNA-133在间充质干细胞中的表达可减弱其诱导外周血单个核细胞中调节性B细胞分化的能力,表明0.1 ug/ml SDF-1α可以通过调节间充质干细胞中miRNA-133的表达进而影响其对调节性B细胞的诱导分化能力。

关键词： 芒果甙   白细胞介素10   JAK2   STAT3   ERK   单个核细胞   调节性B细胞  

摘要： 目的:我们的前期实验已证明芒果甙（mangiferin,MA）可上调小鼠脾脏单个核细胞（mononuclear cells,MNCs）中调节性B细胞（regulatory B cells,Bregs）和白细胞介素10（interleukin 10,IL-10）水平,本次研究在此基础上,进一步探究MA上调Bregs和IL-10的分子机制,为MA运用于慢性移植物抗宿主病（chronic graft-versus-host disease,cGVHD）防治提供分子依据。方法:通过颈椎脱臼法处死雄性BALB/c小鼠后,用红细胞裂解液分离出小鼠脾脏MNCs。首先检验MA是否可以激活JAK2-STAT3、ERK、及TLR4-MyD88三条信号通路,在此部分研究中,实验分组如下:（1）DMSO对照组;（2）实验组:用不同浓度MA（50uM、100uM、150uM、200uM）干预小鼠脾脏MNCs,用Western blot法检测各组细胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、ERK、p-ERK、TLR4、MyD88等分子的蛋白表达量,用RT-PCR检测各组细胞中TLR4的转录水平。然后,分别在抑制剂存在的条件下,验证MA激活以上信号通路是否影响Bregs增殖分化和IL-10的分泌,实验分组如下:（1）DMSO对照组;（2）200uM MA组;（3）200uM MA+抑制剂组（JAK2激活抑制剂AG490,或STAT3激活抑制剂HO3867,或ERK激活抑制剂U0126）,在证明抑制剂有效的前提下,用ELISA检测各组细胞培养上清液中IL-10的浓度,用流式细胞术检测各组细胞中Bregs的比例。结果:1、MA通过激活JAK2-STAT3信号通路促进IL-10表达,但Bregs的增殖分化不受该信号通路影响:（1）MA激活JAK2-STAT3信号通路。与对照组相比,MA呈剂量依赖性促进p-JAK2、p-STAT3蛋白表达,尤以200uM MA组增高最明显（P=0.000,P=0.008）,但不影响JAK2、STAT3的蛋白表达（P>0.05）。（2）AG490、HO3867可抑制MA对JAK2-STAT3信号通路的激活作用。Western blot结果显示,与MA组相比,MA+抑制剂组（AG490或HO3867）p-JAK2、p-STAT3的蛋白表达量显著减少(AG490:Pp-JAK2=0.043,Pp-STAT3=0.016;HO3867:Pp-STAT3=0.001)。（3）AG490、HO3867抑制MA上调MNCs中IL-10表达的作用。ELISA结果显示,与MA组相比,MA+抑制剂组（AG490或HO3867）IL-10的浓度明显降低（AG490:P=0.0057;HO3867:P=0.0333）,但流式细胞术结果显示两组Bregs水平并无差异（P>0.05）。2、MA通过激活ERK信号通路促进小鼠MNCs中负性调节因子IL-10的蛋白表达水平,但Bregs的增殖分化不受该通路影响:（1）MA上调ERK通路水平。与对照组相比,各组MA均可显著提高p-ERK的蛋白水平（P=0.045、0.016、0.103、0.047）,但不影响ERK的蛋白表达（P>0.05）。（2）U0126抑制MA对ERK的磷酸化。Western blot结果显示,与MA组相比,MA+U0126组p-ERK蛋白表达量显著减少（P=0.0079）。（3）U0126抑制MA对MNCs细胞IL-10分泌的促进作用。ELISA结果显示,与MA组相比,MA+U0126组IL-10的水平明显降低（P=0.0046）,但流式细胞术显示的Bregs水平两组之间并无差异（P>0.05）。3、MA可能通过激活TLR4-MyD88信号通路,促进小鼠MNCs中Bregs增殖和IL-10产生:（1）RT-PCR结果显示,与对照组相比,MA明显上调了MNCs中TLR4的转录水平（P=0.042、0.114、0.02、0.031）;Western blot结果也显示,MA可促进MNCs表达TLR4（P=0.049、0.09、0.003、0.001）、MyD88(P100uM=0.036)。结论:本研究对既往实验结果进行了补充和延伸,证实MA通过激活JAK2-STAT3和ERK两条信号通路上调小鼠脾脏MNCs中IL-10的表达,这为MA可能发挥的抗cGVHD作用提供了分子依据;然而,本次研究并未发现MA促进Bregs增殖的分子机制,以及芒果甙的体内活性等一系列问题也有待进一步深入研究,以期为cGVHD的防治提供新的治疗方案。

关键词： 鼻炎,变应性   CD23   白细胞介素10   调节性B细胞  

摘要： 目的:探寻抗CD23抗体是否通过Bregs介导的IL-10分泌调节T细胞的活化,寻找治疗变应性鼻炎的新靶点。方法:建立变应性鼻炎大鼠模型,应用抗CD23抗体干预,观察大鼠的行为学改变,通过皮肤被动过敏原实验、酶联免疫吸附实验、苏木精-伊红染色、免疫荧光、流式细胞术了解血清学指标、全身及鼻腔局部黏膜情况。结果:与正常对照组相比,变应性鼻炎组大鼠出现喷嚏、挠鼻、流涕,皮下肿块增大;血液中IL-10水平、IFN-γ、调节性B细胞(Bregs)百分率降低,IL-4水平、CD23^+B细胞、CD4^+T细胞百分率增高;鼻黏膜CD23荧光强度增加,CD19和IL-10荧光强度减弱。与变应性鼻炎组相比,抗体干预组大鼠喷嚏次数、挠鼻次数、流涕症状明显改善,皮下肿块缩小;血液中IL-10水平、IFN-γ、全血中Bregs细胞百分率增高,IL-4水平、CD23^+B细胞、CD4^+T细胞百分率降低;鼻黏膜CD23荧光强度减弱,CD19和IL-10荧光强度增强。两种给药途径差异无统计学意义。结论:B细胞上CD23表达增强参与变应性鼻炎的发生发展;抗CD23抗体应用可调控变应鼻炎的症状和体征,鼻腔滴入可作为抗CD23抗体应用的首选方法,抗CD23有望成为控制和治疗变应性鼻炎的新方法。抗CD23抗体可通过依赖Bregs分泌IL-10介导的T细胞活化发挥治疗作用。

关键词： 原发性干燥综合征   外周血调节性B细胞   白介素-10   转化生长因子  

摘要： 目的检测原发性干燥综合征(pSS)患者外周血调节性B细胞(Bregs)与白介素-10(IL-10)、转化生长因子(TGF-β1)治疗前、后表达水平变化,探讨Bregs细胞与IL-10、TGF-β1表达水平之间的相关性。方法采用流式细胞术检测51例pSS患者治疗前、后和43例对照组患者外周血中Bregs细胞的水平,同时采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定其IL-10、TGF-β1的表达水平,并与Bregs细胞进行相关性分析,分析Bregs细胞与疾病活动的相关性。结果 pSS患者治疗前Bregs细胞的水平高于对照组(P<0.05),pSS患者治疗后Bregs细胞的水平较治疗前减低(P<0.05)。治疗前pSS患者IL-10和TGF-β1的水平均高于对照组(P均<0.05),经治疗后IL-10和TGF-β1的水平较治疗前均减低(P均<0.05)。pSS患者外周血Bregs细胞的比例与IL-10和TGF-β1的水平均呈正相关(P均<0.05)。结论 pSS患者外周血Bregs细胞参与pSS的发病,并通过分泌IL-10和TGF-β1抑制炎症反应,进而起到负向调节的作用。

关键词： 白细胞介素-10   外周血Bregs数量   免疫性血小板减少症   调节性B细胞  

摘要： 目的研究免疫性血小板减少症患者的调节性B细胞的数量和功能,为临床医师评估该类疾病患者的病情提供重要指导。方法以2016年10月～2018年7月本院接诊的初诊免疫性血小板减少症患者40例为A组,另以本院同期接诊的完全缓解免疫性血小板减少症患者35例为B组,同时将同期接诊的健康体检者40名作为对照组,设为C组。采取流式细胞术对各组的外周血Bregs数量和白细胞介素-10表达量进行检测,同时对其检测结果作出分析和比较。结果 A组的外周血Bregs数量为(3.08±0.66)%,比B组以及C组的(5.45±0.82)%、(7.82±1.03)%低,组间差异有统计学意义(P<0.05)。A组外周血Bregs中的白细胞介素-10细胞比例为(32.29±8.68)%,比B组及C组的(51.03±10.54)%、(71.88±12.28)%低,组间差异有统计学意义(P<0.05),并且B组外周血Bregs中的白细胞介素-10细胞比例比C组低,组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论免疫性血小板减少症的发生与Bregs有着较为密切的关系,因此,临床医师可以将Bregs作为免疫性血小板减少症的一个重要治疗靶点,以进一步提高患者病情控制的效果。

关键词： 红斑狼疮   系统性   调节性B细胞   CD19  

摘要： 目的研究SLE患者外周血CD19^+CD24^(hi)CD38^(hi)Breg细胞变化。方法选取2015年1月～2018年3月在广州医科大学附属第二医院确诊为系统性红斑狼疮56例患者和对照组体检健康者30例,分别抽取外周静脉血分离PBMC,加入FITC-单克隆鼠抗人CD19抗体、 PE-单克隆鼠抗人CD24抗体、 APC-单克隆鼠抗人CD38抗体,室温避光作用后,流式细胞仪检测CD19^+CD24^(hi)CD38^(hi)Breg细胞。结果 SLE患者外周血CD19^+CD24^(hi)CD38^(hi)Breg细胞为(2.86±1.39)%,对照组为(4.07±1.48)%,两组比较差异有统计学意义(t=3.781,P<0.01)。活动期、非活动期SLE患者外周血CD19^+CD24^(hi)CD38^(hi)Breg细胞分别为(2.10±1.09)%vs (3.62±1.25)%,两组比较差异有统计学意义(t=4.854,P<0.01)。10例SLE患者治疗前、后外周血CD19^+CD24^(hi)CD38^(hi)Breg细胞分别为(2.28±1.24)%vs (3.34±0.78)%,两组比较差异有统计学意义(t=4.386,P<0.01)。结论 SLE患者外周血CD19^+CD24^(hi)CD38^(hi)Breg细胞减少,可能参与SLE发病,可能是观察疗效的指标。

关键词： 宫颈癌   外周血调节性B细胞   白细胞介素-10   转化生长因子-β  

摘要： 目的探讨宫颈癌患者外周血调节性B细胞数量及血清白细胞介素(IL)-10、转化生长因子(TGF)-β的表达水平。方法选择宫颈癌患者83例,同时选择健康志愿者59例为对照组。检测两组于不同临床分期CD19^+CD5^+/CD19^+B和CD19^+CD5^+CD1d^+/CD19^+B比例及血清IL-10、TGF-β表达情况。结果宫颈癌组CD19^+CD5^+/CD19^+B和CD19^+CD5^+CD1d^+/CD19^+B比例明显高于对照组(P<0. 05);血清IL-10、TGF-β表达显著高于对照组(P<0. 05);宫颈癌Ⅰ、Ⅱ期组CD19^+CD5^+/CD19^+B和CD19^+CD5^+CD1d^+/CD19^+B比例显著低于Ⅲ期和Ⅳ期组(P<0. 05);血清IL-10、TGF-β表达显著高于Ⅲ、Ⅳ期组(P<0. 05)。结论外周血调节性B细胞及血清IL-10和TGF-β可能与宫颈癌进展相关。

关键词： B细胞   调节性B细胞   IL-10   TGF-β   IL-35   神经系统自身免疫性疾病   脑血管病  

摘要： B淋巴细胞作为白细胞中的一个淋巴细胞亚群,来源于骨髓的多功能造血干细胞。既往认为其主要通过产生抗体、呈递抗原、分泌细胞因子及活化T细胞等发挥免疫调节作用,正向推动免疫反应[1-2]。近年来通过对B淋巴细胞的研究发现B细胞的一个亚群(调节性B淋巴细胞)具有不依赖其抗体分泌功能的免疫调节功能,即一种负向调节免疫反应,Mizoguchi E[3]和他的同事是最早用Bregs命名具有这种调节功能的B细胞的。