关键词： 滤泡状细胞毒性T细胞   调节性B细胞   白介素10   非小细胞肺癌  

摘要： 现有研究发现,滤泡状细胞毒性T细胞(Follicular cytotoxic T cell,Tfc)是一种在慢性病毒感染中产生关键性作用的T细胞亚群。Tfc细胞具有细胞毒活性;并且像滤泡状辅助性T细胞(Follicular helper T cell,Tfh)一样,Tfc细胞表达CXCR5并可以响应CXCL13从而定位于B细胞滤泡。越来越多的证据表明,Tfc细胞具有促炎功能,并在多种炎性疾病中具有治疗潜力。但Tfc细胞是否在人类癌症中发挥作用,及其可能的调控机制,目前尚不完全明确。本课题研究了 Tfc细胞在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)外周血和肿瘤组织中的分布,及其在抗肿瘤免疫应答中的作用。并进一步探究了调节性B细胞(Regulatory B cell,Breg)对其的调控作用和可能的途径,为将来Tfc细胞在非小细胞肺癌的临床治疗应用提供理论依据。第一部分Tfc细胞在非小细胞肺癌患者体内的分布目的:本部分旨在确定非小细胞肺癌患者体内Tfc细胞的表型,并阐明Tfc细胞在外周血和肿瘤组织中的分布,为后续研究奠定基础。方法:采用流式细胞术确定非小细胞肺癌患者体内Tfc细胞的表型,并检测外周血和肿瘤微环境中Tfc细胞,确定其在外周血和肿瘤微环境中的分布。结果:非小细胞肺癌患者体内的Tfc细胞占总肿瘤浸润淋巴细胞和肿瘤浸润CD8+T细胞的比例均高于外周血中Tfc的比例。结论:与外周血相比,Tfc细胞在肿瘤组织中浸润富集,提示Tfc细胞可能参与了机体的抗肿瘤免疫应答。第二部分Tfc细胞在非小细胞肺癌患者体内的功能目的:探究Tfc细胞在非小细胞肺癌患者体内肿瘤组织中的作用,以及Tfc细胞参与抗肿瘤免疫应答可能的机制。方法:通过流式细胞术,检测外周血和肿瘤组织中Tfc细胞的脱颗粒能力。同时采用多重检测的方法,检测外周血和肿瘤组织中Tfc细胞促炎性细胞因子以及颗粒酶B和穿孔素的分泌能力。结果:在非小细胞肺癌患者的肿瘤微环境及外周循环中,Tfc细胞表达更高水平的CD107a。同时,肿瘤微环境及外周循环中的Tfc细胞分泌更高水平的促炎性细胞因子;但是颗粒酶B以及穿孔素的分泌水平明显降低。结论:在非小细胞肺癌患者体内,肿瘤微环境及外周循环中的Tfc细胞具有更强的去颗粒能力和促炎性细胞因子分泌,但细胞毒活性明显下降。说明,Tfc细胞可能不是通过直接杀伤癌细胞的方式参与机体的抗肿瘤免疫应答。第三部分Breg细胞在非小细胞肺癌患者体内对Tfc细胞的调控目的:研究Breg细胞在非小细胞肺癌患者体内对Tfc细胞的调控,为肿瘤的临床治疗提供新的思路。方法:明确NSCLC患者体内Breg细胞表型,检测外周血和肿瘤微环境中Tfc与Breg细胞的相关性。同时,将从患者体内分离得到的Tfc细胞与Breg细胞进行离体共培养,检测Tfc细胞的细胞因子分泌水平。同时探究白介素10(Interleukin 10,IL-10)在Breg细胞对Tfc的调控中的作用。结果:非小细胞肺癌患者体内,Breg细胞与Tfc细胞在外周血和肿瘤浸润淋巴细胞中的数量未发现明显相关性。与Breg细胞离体共培养并不影响Tfc细胞分泌颗粒酶B和穿孔素,但可显著抑制Tfc细胞促炎性细胞因子的分泌。而运用IL-10阻断后,Tfc的细胞因子分泌水平显著降低。结论:Breg细胞对NSCLC患者体内的Tfc细胞向肿瘤组织的浸润性以及细胞毒活性没有明显作用,但可以显著抑制Tfc细胞促炎性细胞因子的分泌水平,这种抑制的作用途径可能是通过IL-10来实现的。第四部分Tfc细胞促进抗肿瘤免疫反应及其可能的调控机制目的:在小鼠模型中进一步证实Tfc在体内抗肿瘤免疫中的作用,及其调控机制。方法:在小鼠体表建立LLC-OVA皮下移植肿瘤模型,然后分别转输Tfc和CXCR5-CD8+T细胞,观察肿瘤生长情况,采用流式细胞术检测在肿瘤微环境中浸润的CD8+T细胞。然后将Breg细胞与Tfc细胞一起共转输到接种了 LLC-OVA的小鼠体内,观察肿瘤生长情况。最后,对Breg和Tfc共转输小鼠进行IL-10的封闭,并随后阻断IL-10,进一步观察肿瘤生长情况。结果:Tfc细胞转输可以显著抑制小鼠肺肿瘤生长,而且可以有效促进肿瘤组织中CD8+T细胞浸润。Breg细胞与Tfc细胞共转输,小鼠肺肿瘤生长没有得到明显抑制,但是IL-10封闭可以部分抑制肿瘤生长。结论:在LLC小鼠肿瘤模型中,Tfc细胞可以显著抑制肿瘤生长,具有较强的抗肿瘤免疫能力,Breg细胞可以抑制Tfc细胞在抗肿瘤免疫应答中的作用,而且这种抑制作用可能是依赖IL-10得以实现的。

关键词： 骨髓增生异常综合征   调节性B细胞   细胞因子   免疫机制  

摘要： 目的:通过研究初治较低危、较高危骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes,MDS)患者及健康对照者外周血中调节性B细胞(regulatory B cells,Bregs)及细胞因子白介素-2(interleukin-2,IL-2)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达水平,初步探讨Bregs及相关细胞因子在MDS中的免疫发病机制。方法:收集兰州大学第二医院血液科2019年6月至2021年1月确诊的初治MDS患者28例,其中较低危组18例、较高危组10例,健康对照组10例。采用流式细胞术检测三组外周血Bregs细胞比例,流式微球捕获芯片技术(cytometric bead array,CBA)法检测外周血细胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α水平,并分析Bregs与细胞因子的相关性。结果:Bregs水平在MDS较高危组明显高于健康对照组和MDS较低危组,MDS较低危组低于健康对照组,三组差异均有统计学意义(P<0.001)。细胞因子检测结果显示,IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α水平在MDS较低危组明显高于健康对照组(P<0.001);IL-2、IFN-γ、TNF-α水平在MDS较高危组明显低于MDS较低危组(P<0.001),而IL-10水平在MDS较高危组明显高于MDS较低危组(P<0.001);IL-2、IFN-γ水平在健康对照组明显高于MDS较高危组(P<0.01)。IL-6、IL-10、TNF-α水平在健康对照组明显低于MDS较高危组(P<0.001)。相关性分析表明,较低危组MDS患者Bregs细胞与IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α呈负相关,与IL-10呈正相关。较高危组MDS患者Bregs细胞与IL-2、TNF-α呈负相关,与IL-6、IL-10呈正相关。进一步与临床参数比对发现,初诊MDS患者外周血Bregs水平与血红蛋白浓度呈负相关,与中性粒细胞计数与血小板计数水平间无相关性。结论:***及IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ及TNF-α在不同危险分层MDS中异常表达,提示Bregs等免疫紊乱可能参与了MDS的发病、发展。2.较低危组MDS患者Bregs与细胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α呈负相关,与IL-10呈正相关,较高危MDS组患者Bregs与细胞因子IL-2、TNF-α呈负相关,与IL-6、IL-10呈正相关,提示Bregs与细胞因子可能相互作用,共同导致MDS的免疫微环境紊乱。***患者Bregs水平与血红蛋白浓度呈负相关,提示Bregs可能在MDS患者贫血的发生中起一定作用。

关键词： 哺乳动物不育系20样激酶1   Wiskott-Aldrich综合征蛋白   调节性T细胞   细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4   神经纤毛蛋白-1   微小RNA-146a   B淋巴细胞   BCR信号  

摘要： 第一部分Mst1和WASp共同调控调节性T细胞外周稳态及抑制功能目的:以哺乳动物不育系20样激酶1（Mst1）基因敲除（Mst1KO）、Wiskott-Aldrich综合征蛋白（WASp）基因敲除（WASpKO）、Mst1-WASp双敲除（DKO）和野生型模型小鼠为研究对象,探究Mst1和WASp共同作用在调节性T细胞（Treg）中的影响及可能的机制。方法:在胸腺和脾脏中,通过流式技术检测T细胞各亚群的变化,重点检测Treg细胞的比例、数量及其相关分子的表达情况,并通过构建DKO骨髓嵌合小鼠验证表型变化是否为自发性。结果:（1）在脾脏中,DKO小鼠CD4+T细胞和CD8+T细胞的百分比和数量显著降低,其中,幼稚T细胞的比例降低,活化T细胞的比例增加。在胸腺中,没有发现百分比的统计学差异。（2）在脾脏中,DKO小鼠的CD4+CD25+Treg细胞和CD4+Fox P3+Treg细胞的数量降低,但比例上调。胸腺中百分比无差异。（3）ICOS和PD-1在DKO小鼠的胸腺和脾脏中均无明显变化。然而,DKO小鼠脾脏Treg细胞中的NRP-1的表达减少,同时,CTLA-4表达增加。（4）与WT小鼠相比,DKO小鼠脾脏中的CD4+T细胞产生的白细胞介素-4增加。（5）与WT嵌合体小鼠相比,DKO嵌合体小鼠T细胞各亚群及Treg细胞的结果变化趋势与上述一致。结论:Mst1与WASp以细胞固有方式共同影响Treg细胞外周稳态和功能,其机制可能涉及NRP-1和CTLA-4。第二部分Micro RNA-146a在B淋巴细胞发育及BCR信号的研究目的:探究微小RNA-146a（Micro RNA-146a,miR-146a）与B淋巴细胞发育及B细胞受体（BCR）信号的相关性及分子机制。方法:在miR-146a过表达（TG）的小鼠骨髓和脾脏中,用流式技术检测B细胞各亚群的表达情况。利用共聚焦激光扫描显微镜技术检测在可溶性抗原（sAg）的刺激下,在B细胞受体早期活化过程中,相关信号分子的表达情况。使用免疫印迹技术检测在BCR活化过程中0、5、10、30分钟四个时间点各信号分子磷酸化蛋白水平的变化。结果:miR-146a过表达的小鼠骨髓中未成熟B细胞的数量和比例高于野生型（WT）小鼠。脾脏中边缘区（MZ）B细胞无明显变化,然而,滤泡（FO）B细胞比例显著降低,过渡Ⅰ型（T1）B细胞和过渡Ⅱ型（T2）B细胞数量和比例升高。磷酸化的酪氨酸（pY）水平的峰值较WT明显增高,其下游各分子磷酸化水平增强。结论:miR-146a的表达在B细胞发育和外周分化及BCR活化中发挥正向调节作用,可能是由于免疫耐受的失调导致的。

关键词： 肝肾联合移植   免疫抑制剂   调节性B细胞   免疫保护  

摘要： 目的探讨肝肾联合移植受者治疗和管理经验。方法回顾性分析解放军总医院第八医学中心2003年11月至2019年6月22例肝肾联合移植受者手术、免疫抑制剂应用以及远期随访数据。结果22例肝肾联合移植受者术后3个月内死亡5例,1.3、5、10年存活率分别为77.3%、72.4%、66.9%、66.9%。围手术期死亡与移植肾延迟恢复、肺部感染呈正相关(P=0.000和P=0.039),与原发病、术前是否透析治疗、手术时间和术中出血量等无明显相关。顺利度过围手术期受者免疫抑制剂应用参照单纯肝脏移植受者,用量低于单纯肾脏移植受者,排斥反应发生率无明显升高。移植肾功能延迟恢复与供肾冷缺血时间及远期移植肾功能不全无明显相关(P=0.053和P=0.074)。术后1个月停用激素受者与术后3个月停用激素受者比较,急性排斥反应的发生率无明显增加。2例受者远期发生泌尿系移行细胞癌,手术切除并加用西罗莫司治疗后预后良好。结论肝肾联合移植围手术期死亡与移植肾功能延迟恢复、肺部感染明显相关,其免疫抑制剂应用可以参考单肝移植,如顺利度过围手术期,可以得到良好的远期预后。

关键词： 肝细胞肝癌   调节性B细胞   白细胞介素-10   免疫治疗   免疫抑制  

摘要： 肝细胞肝癌(HCC)是世界上常见的消化道恶性肿瘤之一,严重地威胁人类的生命安全。目前主要的治疗手段是手术切除、动脉栓塞化疗或等全身化疗,但效果均不佳。免疫治疗越来越受到研究者的关注。调节性B细胞(regulatory B cells,Bregs)是一类通过分泌白介素-10(IL-10)、转化生长因子-β(TGF-β)等细胞因子在自身免疫性疾病、肿瘤疾病及感染性疾病中发挥免疫抑制作用的B淋巴细胞群。其中,CD19CD24hiCD38hiB细胞是一种相当重要的亚型,在肿瘤免疫方面起着负性调节效应。本文就HCC与Bregs的相关性作一综述。

关键词： Crohn病   调节性B细胞   调节性T细胞   英夫利昔单抗  

摘要： 目的探讨外周血调节性B细胞(Breg细胞)和调节性T细胞(Treg细胞)与英夫利昔单抗治疗克罗恩病临床疗效的关系。方法2017年1月至2019年6月期间,在温州医科大学附属第二医院收集32例活动期克罗恩病患者和33名性别、年龄相匹配的健康对照者。取空腹静脉血5 ml,分离外周血单个核细胞(PBMCs),经多色流式细胞术检测PBMCs中Breg细胞(CD3-CD19^+IL-10^+B细胞)占B细胞的比例,以及Treg细胞(CD4^+CD25^+Foxp3^+T细胞)占CD4^+T细胞的比例。克罗恩病患者于第0、2、6周静脉注射英夫利昔单抗(5 mg/kg)诱导缓解,其后每隔8周给予相同剂量的英夫利昔单抗维持治疗。于第14周再次检测PBMCs中Breg细胞比例和Treg细胞比例,并与第0周进行比较。同时,克罗恩病患者分别于第0周和第14周检测C反应蛋白(CRP)、白细胞计数、血小板计数、血细胞沉降率辅助评估英夫利昔单抗疗效。结果英夫利昔单抗治疗前,克罗恩病组与健康对照组之间整体比较,PBMCs中Breg细胞比例较高[(3.15±1.17)%比(2.64±0.38)%,P=0.024],Treg细胞比例较低[(2.15±0.49)%比(4.25±0.41)%,P<0.001]。英夫利昔单抗治疗前和治疗第14周,克罗恩病组中Breg细胞比例和Treg细胞比例均呈独立正相关(r=0.628,P<0.001;r=0.749,P<0.001)。治疗第14周,根据症状、克罗恩病活动指数(CDAI)、内镜下黏膜愈合进行评估。CDAI<150且内镜下黏膜愈合者定义为缓解组(R组),CDAI≥150或内镜下黏膜未愈合者为未缓解组(N组)。治疗第14周与治疗前比较,R组中Breg细胞比例和Treg细胞比例均显著增高[(5.89±2.60)%比(3.19±1.27)%,P<0.001;(4.59±0.72)%比(2.08±0.47)%,P<0.001],CDAI和CRP均显著降低[CDAI:(63.19±14.69)比(195.62±58.13),P<0.001;CRP:(3.65±2.23)mg/L比(29.80±30.06)mg/L,P<0.001]。治疗前和第14周,克罗恩病患者中Breg细胞比例和Treg细胞比例与CRP(r=-0.279,P=0.026;r=-0.406,P=0.001)和CDAI(r=-0.409,P=0.001;r=-0.708,P<0.001)始终呈独立负相关。治疗第14周,ROC曲线分析显示"Breg细胞比例^+Treg细胞比例"对英夫利昔单抗疗效的预测价值高于其他参数(曲线下面积:0.782,截断值:0.8955,P=0.034)。结论Breg细胞和Treg细胞不仅与克罗恩病疾病活动密切相关,而且在活动期克罗恩病患者中,联合检测这两类免疫细胞对英夫利昔单抗疗效的预测价值更高。

关键词： Breg细胞   ITP   血小板   免疫调节  

摘要： 目的本实验通过给免疫性血小板减少症(ITP)模型小鼠经尾静脉注射经流式分选的Breg细胞,探究其对该疾病的治疗效果,以期为临床ITP的治疗提供新思路。方法(1)制备小鼠Breg细胞:将25只Balb/c雄性小鼠经麻醉脱颈处死后取脾脏,研磨后收集脾细胞,首先经磁珠分选出B细胞,再加入流式抗体分选出Breg细胞(CD19+CD5+CD1dhi)。(2)建立小鼠ITP模型:将12只小鼠随机分为两组,正常对照组和ITP模型组,模型组小鼠腹腔注射CD41抗体,注射剂量为每20克体重小鼠给予100µg药物,观察造模情况。(3)实验分组:将24只小鼠随机分为两组,即ITP模型组(I组)和ITP+Breg输注组(IB组),I组小鼠腹腔注射CD41抗体,IB组小鼠在腹腔注射CD41抗体后经尾静脉输注1×106个Breg细胞。每隔一定时间计数血小板,在I组与IB组血小板下降百分比有差距的时间点取小鼠脾脏进行Treg和Breg的流式检测。结果经尾静脉取血检测两组小鼠的血常规,统计血小板计数显示,在第5、42、68小时I组与IB组小鼠血小板计数下降的百分比比较,差异有统计学意义(P<0.05),在此3个时间点每组各取4只小鼠进行麻醉后并处死,在操作台上取脾脏磨脾来收集细胞进行流式检测。经过流式分析发现,I组小鼠的Treg细胞的变化为升高趋势,而IB组小鼠表现为先下降后又升高的趋势,两组第42、68小时比较,差异有统计学意义(3.27±0.86 vs.1.90±0.08,P=0.022;3.23±0.24 vs.2.30±0.10,P=0.009)。I组在这3个时间点的Breg细胞变化不大,IB组则表现为明显的先升高后下降,两组第42小时比较,差异有统计学意义(1.78±0.22 vs.4.33±1.30,P=0.010)。结论给ITP模型小鼠输注具有免疫负性调节作用的Breg细胞并未达到预期的治疗效果,这与临床ITP缓解患者外周血Breg细胞数量比初诊者升高不符,提示Breg细胞虽然是自身免疫性疾病的治疗方向,但在ITP疾病发生发展中的作用有待进一步探索。

关键词： 三氯乙烯   职业性三氯乙烯药疹样皮炎   肝功能   淋巴细胞   调节性T细胞   调节性B细胞  

摘要： 目的以职业性三氯乙烯药疹样皮炎(OMDT)患者为研究对象,分析治疗前后患者肝功能及外周血调节性淋巴细胞的变化特点。方法于2019年12月,以2017年2月至2019年2月期间收治的16例OMDT患者(其中8例为多形红斑,8例为重症多形红斑)为研究对象,检测患者治疗前后的肝功能指标和外周血调节性淋巴细胞百分数,分析肝功能与外周血调节性T、B淋巴细胞的变化情况及两者之间的相关性。结果治疗前,试验组患者丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)和谷氨酰肽酶(GGT)高于健康对照组,总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和胆碱脂酶(CHE)低于健康对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);治疗前,试验组患者淋巴细胞、CD4^+T细胞、调节性T细胞(CD4^+CD25^+Tregs)、调节性B细胞(CD19^+CD24^+CD27^+Bregs)百分数和CD4^+/CD8^+比值均低于健康对照组,CD8^+T细胞百分数高于健康对照值,差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗前,患者肝功能指标ALT、AST、GGT、DBIL水平与CD4^+CD25^+Tregs、CD19^+CD24^+CD27^+Bregs、CD4^+T细胞百分数和CD4^+/CD8^+比值呈负相关(r=-0.386^-0.809,P<0.05),与CD8^+T细胞百分数呈正相关(除DBIL外)(r=0.503~0.568,P<0.05);TP、ALB水平与CD4^+CD25^+Tregs、CD19^+CD24^+CD27^+Bregs、CD4^+T细胞百分数呈正相关(r=0.351~0.784,P<0.05),ALB与CD8^+T细胞百分数呈负相关(r=-0.315,P<0.05),CHE与CD4^+CD25^+Tregs、CD19^+CD24^+CD27^+Bregs百分数、CD4^+/CD8^+比值呈正相关(r=0.390~0.527,P<0.05)。结论OMDT患者存在免疫功能紊乱,可能由调节性淋巴细胞失衡引起,其肝脏损害可能与CD8^+T细胞的增高、CD4^+T细胞、CD4^+CD25^+Tregs、CD19^+CD24^+CD27^+Bregs百分数和CD4^+/CD8^+的比值降低有关。

关键词： 系统性红斑狼疮   调节性B淋巴细胞   作用机制  

摘要： 系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种以产生大量自身抗体、机体免疫复合物沉积、多脏器受损为特点的自身免疫性疾病。B细胞的过度活跃、增殖促使病理性免疫应答,导致SLE的发生与进展。SLE患者体内的B细胞兼有“致病性”和“保护性”的功能。而具有“保护性”功能的是具有负向免疫抑制作用的新型细胞亚群--调节性B淋巴细胞(Bregs)。Bregs介导的免疫抑制对维持免疫耐受有重要作用。Bregs主要通过分泌抑制性细胞因子(如IL-10、IL-35和TGF-β等)或直接同T淋巴细胞接触来参与免疫调节,抑制有害的免疫应答,从而发挥保护作用。本文就Bregs的发现、表型、功能以及在SLE中的作用机制展开综述。

关键词： 矽肺   CD19^+CD24hi CD38hi B细胞   CD19^+CD25^+B细胞   CD4^+CD25^+T细胞  

摘要： 目的探讨外周血调节性B细胞和调节性T细胞在Ⅰ期矽肺患者中的水平变化及意义。方法采用流式细胞术方法,检测82例Ⅰ期矽肺患者(矽肺组)、48例具有与矽肺组相同接尘条件的健康井下接尘矿工(接尘组)及45例井上健康查体人员(正常组)外周血CD19^+CD24hi CD38hi B、CD19^+CD25^+B及CD4^+CD25^+T细胞水平。结果与接尘组和正常组比较,矽肺组CD19^+CD24hi CD38hi B、CD19^+CD25^+B及CD4^+CD25^+T细胞水平升高,差异均具有统计学意义(P<0.01)。与正常组比较,接尘组CD19^+CD24hi CD38hi B细胞水平减低,差异具有统计学意义(P<0.05)。肺功能轻度障碍组CD4^+CD25^+T细胞水平低于正常组和中重度障碍组,差异均具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。接尘年限<20年组CD19^+CD24hi CD38hi B细胞水平明显低于接尘年限20-年组和接尘年限30-年组,差异均具有统计学意义(P<0.01)。相关性分析显示,正常组外周血CD19^+CD24hi CD38hi B细胞水平与CD4^+CD25^+T细胞水平呈负相关(r=-0.441,P<0.05),CD19^+CD25^+B细胞水平与CD4^+CD25^+T细胞水平呈正相关(r=0.477,P<0.05),矽肺组和接尘组各指标间无相关性。结论Ⅰ期矽肺患者外周血CD19^+CD24hi CD38hi B、CD19^+CD25^+B及CD4^+CD25^+T细胞失衡并参与该病发生发展,CD4^+CD25^+T细胞水平可预示早期肺功能损伤,CD19^+CD24hi CD38hi B水平可能与接尘时间有关。