关键词： 原发性肾病综合征   调节性T细胞   稳定性   可塑性   耗竭   牛奶蛋白过敏   肠道菌群   无菌鼠   调节性T细胞   免疫耐受和免疫稳态   B细胞   早期活化   DOCK8  

摘要： 目的:原发性肾病综合征（Primary Nephrotic Syndrome,PNS）是儿童常见的原发肾小球疾病,也是引起我国儿童终末期肾病的重要疾病之一。由于其病因的复杂性及异质性,目前对于该病发病机制的认识仍十分有限。近年来的相关研究结果提示免疫功能紊乱及免疫炎症是PNS发病的重要机制,多种固有及适应性免疫应答异常可能参与PNS的发生发展,其中T细胞相关免疫应答失调的作用近年来越来越受到关注,被认为是介导PNS发生发展的核心环节之一。调节性T细胞（Regulatory T cell,Treg）是CD4+T细胞的亚群之一,以转录因子Foxp3表达为标志,具有强大的免疫抑制能力,在机体外周免疫耐受及免疫稳态的建立与维持中发挥核心作用。前期研究显示,PNS患儿急性期外周血中Treg水平下调,提示Treg应答异常参与PNS发生发展。同时既往的研究显示,在多种自身免疫、免疫紊乱及相关炎症条件下,存在Treg细胞谱系稳定性,可塑性及功能异常。但是,目前在肾病综合征、免疫相关肾病及相关动物模型中尚缺乏相关研究报道。故本研究目的主要为明确PNS条件下,Treg细胞是否存在谱系稳定性,可塑性及功能异常,并分析导致以上异常的潜在分子机制。以期加深对于PNS免疫发病机制的认识,同时为临床干预寻找新的靶标。方法:收集重庆医科大学附属儿童医院肾脏内科收治的初诊PNS患儿急性期外周血标本（PNS组）,同时在本院体检中心收集年龄性别相匹配的健康儿童外周血标本作为对照（HC组）:通过流式细胞术,分析Treg细胞相关免疫表型;通过分离纯化外周血Treg细胞、体外刺激其活化及增殖,分析Treg细胞稳定性及可塑性;通过分离纯化外周血Treg细胞及Tresponder细胞,体外共培养,分析Treg细胞的免疫抑制能力;通过分离纯化外周血Treg细胞,基因表达谱及生物信息学分析,磷酸化流式等检测,解析导致PNS条件下Treg异常的潜在信号通路及分子机制;通过分离纯化外周血Treg细胞,特异性抑制剂干预及体外功能、稳定性、可塑性实验,进一步明确相关分子机制在PNS-Treg细胞稳定性,可塑性及功能异常中的关键作用。结果:（1）PNS患儿外周血中Treg细胞谱系核心转录因子Foxp3表达稳定性显著受损,表现为PNS组中CD25+Foxp3-细胞比例显著升高,Treg细胞中Foxp3表达水平显著下降,同时体外稳定性实验提示,PNS-Treg细胞增殖过程中存在Foxp3表达的显著丢失;（2）PNS患儿外周血中Treg细胞表现出显著的可塑性异常,表现为表达IFN-γ、T-bet、及CXCR3的Th1样Treg细胞水平显著升高,同时体外可塑性实验提示,PNS-Treg细胞增殖过程中,伴随Foxp3表达的下调,Treg细胞显著向分泌IFN-γ的Th1样Treg细胞转化,甚至完全转分化为Th1细胞;（3）PNS患儿外周血中Treg细胞存在显著的功能失调,表现为对Tresponder细胞体外增殖的抑制能力显著减弱;（4）Treg细胞的以上异常应答,与过度活化诱导的耗竭状态紧密相关,表现为与Treg及conventional T细胞活化及耗竭相关的分子标志显著上调,同时基因表达谱及生信分析也显示大量活化及耗竭相关的基因集在PNS-Treg细胞中显著富集;（5）介导T细胞活化的TCR信号,及其下游的PI3K-AKT、MAPK信号通路在体外活化后的PNS-Treg细胞中显著富集,提示以上信号通路的异常活化,参与PNS中过度活化诱导的Treg耗竭。（6）作为PI3K-AKT、MAPK信号通路下游的共同调控靶点,m TORC1的活化水平在体外活化后的PNS-Treg细胞中显著上调。（7）m TORC1诱导的下游转录因子,c-Myc及SREBPs的蛋白表达水平在体外活化后的PNS-Treg细胞中显著上调,且受以上转录因子调控的靶基因集亦在体外活化后的PNS-Treg细胞中显著富集,提示m TORC1-c-Myc/SREBPs可能是介导PNS条件下过度活化诱导的Treg耗竭及相关免疫应答异常的关键下游环节;（8）特异性抑制剂干预m TORC1、c-Myc、及SREBPs可显著恢复PNS-Treg细胞的体外抑制能力,下调活化诱导的耗竭标志PD-1的表达。显著改善PNS-Treg细胞体外增殖中的Foxp3稳定性异常,并抑制其IFN-γ的分泌,即减弱PNS-Treg的可塑性异常;（9）基因表达谱及生物信息学分析提示,多种生物合成以及生物能量产生相关的代谢通路在体外活化后的PNS-Treg细胞中显著富集,提示这些异常活跃的代谢程序在活化诱导的PNS-Treg耗竭过程中可能发挥关键作用。结论:以上研究结果提示,PNS病理条件下,外周血Treg细胞表现出明显的功能、稳定性及可塑性异常。PNS-Treg细胞以上

关键词： BTLA   调节性T细胞   Treg   B淋巴细胞   BCR  

摘要： 第一部分BTLA对调节性T细胞发育及功能的研究目的:研究B和T淋巴细胞弱化因子（BTLA）对调节性T细胞（Treg）发育和功能的直接影响。方法:通过构建在Treg中特异性敲除BTLA基因的小鼠模型进行研究。比较免疫缺陷小鼠中枢及外周各淋巴器官中T细胞外周环境稳态、T细胞的活化及细胞因子的产生、Treg的发育及其功能相关分子的表达,并通过流式分选Treg及Naive细胞体外培养,探究Treg细胞在体外的抑制作用。结果:相比于野生型小鼠,Treg中选择性敲除BTLA的小鼠中枢及外周各淋巴器官中T细胞外周环境稳态、T细胞的活化水平及细胞因子的产生、Treg的发育及其功能相关分子的表达均未发现明显差异;体外的Treg细胞抑制功能试验发现Treg的抑制功能较野生型亦无明显差异。结论:BTLA对于Treg的发育和功能表达并无直接影响。第二部分BTLA对B淋巴细胞发育及BCR信号的影响研究目的:研究B和T淋巴细胞弱化因子（BTLA）对B淋巴细胞发育和及对BCR信号转导通路的影响。方法:构建在B淋巴细胞中特异性敲除BTLA基因的小鼠模型,比较免疫缺陷小鼠骨髓、脾脏等淋巴器官中B细胞外周环境稳态及功能分子表达,研究B细胞体外刺激增殖差异,分析sAg刺激后的B细胞中pY,pBtk向BCR簇募集与B细胞激活后磷酸化分子pY,pBTK,pCD19,pPI3K,pAKT,pS6的表达的影响。结果:相比于野生型小鼠,B淋巴细胞中选择性敲除BTLA的小鼠骨髓,脾脏,腹膜腔B细胞外周环境稳态及功能分子表达未发现明显差异;而BTLA基因在B淋巴细胞中的缺失增强了B淋巴细胞在体外刺激下的增殖,且BTLA基因的缺失使BCR活化及pY,pBTK磷酸化水平增强,其下游分子pCD19,pPI3K,pAKT,pS6磷酸化水平增强。结论:BTLA基因的表达被证实对BCR活化有抑制作用,在BCR信号转导通路中扮演重要角色。

关键词： Abp1   调节性T细胞   抑制功能   PGRN   BCR信号   B细胞发育  

摘要： 第一部分Abp1在调节性T细胞的发育及功能中的影响目的:探讨肌动蛋白连接蛋白1(Actin-binding protein 1,Abp1)对调节性T细胞(Treg)发育及功能的影响。方法:通过流式细胞术检测野生型小鼠(WT组)和Abp1基因敲除小鼠(KO组)的胸腺、脾脏、浅表淋巴结及肠系膜淋巴结中T淋巴细胞及Treg细胞的比例、数量以及相关功能性分子的表达,并利用体外抑制试验检测Abp1缺失对Treg抑制功能的影响。结果:Abp1 KO小鼠的胸腺、脾脏、浅表淋巴结及肠系膜淋巴结中的Treg的比例和细胞数目与WT小鼠相比没有明显的变化,同时缺失Abp1的Treg细胞的主要功能性分子ICOS、CTLA4、PD-1和NRP-1的表达亦没有显著的差异,进一步实验发现缺失Abp1的Treg细胞对初始T细胞向活化T细胞分化的抑制作用较WT相比无明显变化。结论:Abp1对Treg细胞的发育和功能没有显著影响。第二部分PGRN对B细胞发育及BCR信号的影响目的:探索PGRN如何调节BCR信号和外周B细胞分化的潜在分子机制。方法:通过流式细胞术检测野生型小鼠(WT组)和PGRN基因敲除小鼠(KO组)的骨髓B细胞和外周B细胞各亚群比例。使用激光共聚焦显微镜分别检测p Y、p CD19、p BTK和p SHIP与BCR之间的共定位。采用免疫印迹技术检测BCR近端、远端及负信号分子变化。结果:PGRN KO小鼠的骨髓B细胞与WT小鼠相比没有明显变化。而KO小鼠的外周B细胞亚群MZ B细胞比例升高,GC B细胞的比例则有所下降。KO小鼠的脾脏中的p Y、p CD19、p BTK和p SHIP与BCR之间的共定位均高于WT小鼠。同时KO小鼠的BCR上游信号分子CD19,CD19的下游信号分子BTK、PI3K、中间和远端的信号分子FOXO-1、Akt、S6以及负BCR信号分子SHIP的磷酸化水平较WT均有所升高。结论:PGRN对B细胞早期发育影响不明显,但对外周B细胞的分化起重要作用。PGRN的缺乏可能增强记忆性免疫应答,同时增强了B细胞的活化及BCR的激活。

关键词： 免疫性血小板减少症   细胞免疫   调节性B细胞   儿童  

摘要： 背景免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia,ITP）是一种自身免疫性疾病,其特点是血小板破坏增加,生成减少,血小板计数降低。多数研究表明,ITP的发病机制涉及体液免疫、细胞免疫,但其具体发病机制目前尚不完全明确,尤其细胞免疫机制。随着对ITP发病机制研究的深入,发现T细胞亚群Th17细胞、Treg细胞和B细胞亚群Breg细胞也可能参与ITP的发病过程,但目前国内外研究对于Th17细胞、Treg细胞、Breg细胞在ITP发病机制中的作用仍不明确,Th17/Treg平衡失调机制也不清楚。目的探讨Th17细胞、Treg细胞、Breg细胞在ITP发病机制中的作用;分析Breg细胞与Th17细胞、Treg细胞、Th17/Treg比值之间的相关性,探讨Breg细胞是否参与Th17/Treg平衡失调机制。方法1.研究对象根据儿童ITP诊断标准,选择2019年08月至2020年08月于新乡医学院第一附属医院收治的24例初诊ITP患儿作为实验组,另选择同期来本院门诊体检的年龄和性别相当的21例健康儿童作为对照组。2.检测Th17细胞、Treg细胞、Breg细胞水平无菌操作下,采集两组受试者外周静脉血2ml,置于EDTA抗凝管内,轻轻混匀,再分别取抗凝血,采用Dx FLEX流式细胞仪检测Th17细胞、Treg细胞、Breg细胞水平,计算Th17/Treg比值;应用XN-2000型全自动血细胞分析仪检测血小板水平;应用固相凝集法检测实验组血小板抗体。3.统计学处理应用SPSS22.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差（?χ?s）表示,组间比较采用两独立样本t检验,计数资料进行χ2检验,Breg细胞与Th17细胞、Treg细胞、Th17/Treg之间的相关性采用Pearson相关分析;以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.实验组与对照组年龄、性别比较实验组24例,男性13例,女性11例,平均年龄（42.2±32.4）个月;对照组21例,男性15例,女性6例,平均年龄（43.0±39.8）个月;两组年龄、性别比较均无统计学差异（P>0.05）。2.实验组与对照组血常规结果实验组与对照组之间白细胞、红细胞以及血红蛋白水平均无显著差异（P>0.05）;与对照组相比,实验组血小板计数明显减少,两组血小板计数分别为（14.79±9.82）×10～9/L、（356.00±88.48）×10～9/L,差异有统计学意义（P<0.05）。3.实验组与对照组Th17细胞、Treg细胞、Th17/Treg比值及Breg细胞水平比较实验组与对照组Th17细胞水平分别为（7.91±3.26）%、（3.42±1.74）%;Treg细胞水平分别为（6.93±1.79）%、（8.03±1.14）%;Th17/Treg比值分别为1.25±0.70、0.43±0.22;Breg细胞水平分别为（3.04±2.02）%、（6.59±1.74）%。实验组Th17细胞水平、Th17/Treg比值高于对照组,差异均有统计学意义（t=5.642、5.466,P<0.05）。实验组Treg细胞水平、Breg细胞水平低于对照组,差异均有统计学意义（t=-2.475、-6.261,P<0.05）。4.实验组Breg细胞与Th17细胞、Treg细胞、Th17/Treg比值相关性分析Pearson相关分析显示,实验组Breg细胞与Th17细胞、Treg细胞、Th17/Treg比值之间均无显著相关性（r=-0.001、-0.260、-0.097,P>0.05）。5.实验组Th17细胞、Treg细胞、Breg细胞与血小板计数相关性分析Pearson相关分析显示,实验组Th17细胞水平、Treg细胞水平、Breg细胞水平与血小板计数之间均无显著相关性（r=0.140、-0.185、0.004,P>0.05）。6.血小板抗体阳性组与阴性组Th17细胞、Treg细胞、Breg细胞水平比较血小板抗体阳性组和血小板抗体阴性组患儿的外周血Th17细胞水平分别为（9.58±3.31）%、（7.08±3.00）%;Treg细胞水平分别为（7.44±1.96）%、（6.68±1.71）%;Breg细胞水平分别为（2.48±0.60）%、（3.33±2.41）%。血小板抗体阳性组患儿的外周血Th17细胞、Treg细胞及Breg细胞水平与血小板抗体阴性组比较差异无统计学意义（t=1.860、0.989、-0.971,P>0.05）。结论1.初诊ITP患儿体内存在细胞免疫紊乱,Th17细胞、Treg细胞及Breg细胞参与ITP的发病过程;***患儿存在Th17/Treg比例失衡,Th17细胞占优势;未发现Breg细胞与Th17/Treg平衡失调相关。

关键词： 调节性B细胞   IL-10   胸腺瘤   免疫抑制  

摘要： 背景:胸腺瘤是最为常见的发生于前纵隔的一类胸腺上皮性肿瘤,其发病率约占所有胸腺肿瘤的90%,占全身所有恶性肿瘤的0.2%-1.5%。据统计,胸腺瘤在亚洲人的发病率相对较其他人群高,发病高峰年龄为40-50岁。胸腺瘤组织病理学及生物学行为体现出多样性,故在分类上存在多种标准及方式。WHO对胸腺瘤进行分类时,依据上皮细胞的形态和上皮细胞与淋巴细胞的比例将其划分为A型、AB型、B1型、B2型和B3型五种亚型,不同类型的胸腺瘤具有不同的生物学特征。调节性B细胞（regulatory B cells,Bregs）作为B淋巴细胞的一个亚群,最早在小鼠模型中被证实具有负向免疫调节作用。越来越多的证据表明,调节性B细胞参与抑制抗肿瘤免疫反应,从而促进肿瘤发生和发展,如胃癌、肺癌、肝癌、甲状腺癌、食管癌和乳腺癌等。然而,调节性B细胞是否参与胸腺瘤患者发病及相关机制尚不清楚。目的:调节性B细胞是B淋巴细胞的一个亚群,分泌白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）,在抑制性免疫应答中具有重要作用,但其在胸腺瘤疾病中的作用机制尚不清楚。本项研究旨在评估胸腺瘤患者外周血Bregs细胞亚群的表达水平,并与临床指标进行相关性分析,以进一步探讨它们在胸腺瘤免疫应答中的作用。方法:使用流式细胞术检测23名胸腺瘤患者和15名胸腺囊肿患者（对照组）外周血中Bregs细胞亚群的百分比。受试者的血清IL-10水平通过微量样本多指标流式蛋白定量技术（CBA）测定。采用统计学方法分析上述细胞及因子在两组之间的差异性及其与临床指标的关系。结果:1.与对照组相比,胸腺瘤患者外周血中循环IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率与血清IL-10的水平显著升高,并与KPS临床评分呈负相关。IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率随着胸腺瘤Masaoka分期等级的升高而显著增加,血清IL-10的水平也体现出了升高的趋势,并且在早期分期中IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率和血清IL-10的水平即出现显著升高。此外,IL-10+Bregs和IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率与血清IL-10的水平均呈正相关,IL-10+Bregs与IL-10+CD24hiCD38hiBregs呈正相关。2.在对胸腺瘤不同亚型的分析中,我们发现B型胸腺瘤中循环IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率与血清IL-10的水平显著升高,且IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率与KPS临床评分呈负相关,与血清IL-10的水平呈正相关。3.手术治疗后,患者外周血中循环IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率和血清中IL-10的水平明显降低。其中B型胸腺瘤中IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率和血清中IL-10的水平与其它类型的胸腺瘤相比,在治疗后降低的更加显著。结论:本研究表明胸腺瘤患者外周血中CD24hiCD38hiBreg细胞中IL-10的表达增加,尤其在B型胸腺瘤中表现的更加显著,提示Breg细胞可能参与胸腺瘤的致病过程。此外,Breg细胞还可以作为疾病诊断的生物标志物和潜在的治疗靶点。

关键词： 五羟色胺   溃疡性结肠炎   调节性B细胞   五羟色胺受体7   IL-10  

摘要： 研究背景与目的:溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）目前病因及发病机制未明,研究认为胃肠神经内分泌肽/胺与免疫细胞相互作用是其重要的致病机制之一。调节性B细胞（Regulatory B cells,Bregs）在维持肠道免疫稳态中发挥重要作用。此前我们的研究已经发现Bregs在溃疡性结肠炎中数量减少。肠道嗜铬细胞（Enterochromaffin cells,ECs）产生的五羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）通过免疫调控影响UC进程,但其免疫调节作用尤其对Bregs的影响尚不明确。因此,本研究以人和鼠的Bregs为研究靶点,利用UC小鼠模型、患者样本从细胞、分子和整体不同水平探究UC中5-HT通过其受体下游通路调控Bregs及UC进展的分子机制,为UC治疗提供新的理论基础。研究方法:（1）流式分析检测UC患者和健康人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中CD19+CD24highCD38highB细胞比例,并与UC疾病活动度评分及相关临床指标做相关性分析。（2）流式分选去除UC患者和健康人外周血PBMCs中的CD19+CD24highCD38highB细胞,并用CFSE染色,体外培养5天,流式检测UC患者和健康人外周血CD19+CD24highCD38highB细胞抑制功能差异。（3）分离UC患者和健康人外周血血清,ELISA检测血清中5-HT和白细胞介素（Interleukin）-10水平,并与UC患者外周血CD19+CD24highCD38highB细胞、疾病活动度评分及相关临床指标做相关性分析。（4）流式分析检测UC患者外周血PBMCs中B细胞不同亚群上5-HT受体的表达。（5）磁珠分选健康人外周血PBMCs中B细胞,使用5-HT体外刺激B细胞,培养2天,计数并用流式检测CD19+CD24highCD38highB细胞以及CD19+CD24highCD38highIL-10+B细胞比例。同时检测5-HT处理B细胞后p-STAT3以及p-ERK1/2在CD19+CD24highCD38highB细胞上表达情况。在使用5-HT受体7（5-HT7receptor,5-HT7R）拮抗剂以及STAT3抑制剂体外处理B细胞,培养2天,计数并用流式检测CD19+CD24highCD38highB细胞以及CD19+CD24highCD38highIL-10+B细胞比例,q RT-PCR检测B细胞中IL-10表达。（6）3.5%葡聚糖硫酸钠（Dextran sulfate sodium,DSS）喂养野生型小鼠7天得到肠炎小鼠模型。磁珠分选C57BL/6野生型小鼠脾脏B细胞并在体外用5-HT刺激培养2天,在造模前3天和1天将5-HT处理与不处理的B细胞转输给野生型小鼠。从造模之日起每天记录小鼠体重,对粪便硬度,粪便潜血水平进行评分,评估肠炎小鼠疾病活动指数（Disease activity index,DAI）。第8天处死小鼠,测量结直肠长度。取小鼠结直肠组织做HE染色,明确小鼠粘膜损伤以及炎性浸润程度。取小鼠结肠组织做免疫荧光染色,明确肠组织中IL-10表达情况。流式检测小鼠外周血PBMCs、肠系膜淋巴结（Mesenteric lymph node,MLN）、脾脏以及肠组织中黏膜固有层单个核细胞（Lamina propria mononuclear cells,LPMCs）中B220+IL-10+B细胞比例。研究结果:（1）UC患者外周血PBMCs中CD19+CD24highCD38highB细胞比例降低,CD19+CD24highCD38highB细胞比例与UC疾病活动度评分及相关临床指标负相关。（2）健康人外周血PBMCs去除CD19+CD24highCD38highB细胞后CD4+T细胞增殖受抑制率低于UC患者,UC患者外周血PBMCs中CD19+CD24highCD38highB细胞抑制功能受损。（3）UC患者外周血血清中5-HT和IL-10水平降低,并与与外周血PBMCs中CD19+CD24highCD38highB细胞,疾病活动度评分及相关临床指标正相关,并且血清5-HT与IL-10水平正相关。（4）UC患者外周血PBMCs中CD19+CD24highCD38highB细胞上5-HT7R表达高于健康人,5-HT1AR、5-HT2AR、5-HT3AR和5-HT3BR表达无差异。5-HT7R在UC患者和健康人CD19+CD24intCD38intB细胞和CD19+CD24highCD38-B细胞上表达无差异。（5）5-HT促进健康人外周血B细胞CD19+CD24highCD38highIL-10+B细胞数量及比例增加,但是

关键词： 白细胞介素28B   调节性T细胞   肝癌   肿瘤微环境  

摘要： 研究背景与目的2020年世界卫生组织公布的癌症数据显示,肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)发病率在世界癌症中占第6位,死亡率占第3位。肝癌的治疗目前仍是全球医疗的一大挑战,迫切需要新的治疗方法。调节性T细胞(regulatory T cells,Treg cells)具有抑制抗肿瘤免疫的作用,因此抑制Treg成为HCC免疫治疗的潜在策略。IL-28B是IFN-λ成员之一,已报道IL-28B具有抗肿瘤作用且下调Treg,但目前仍不清楚其抗肿瘤的免疫机制。因此本文评价IL-28B下调Treg对小鼠肝癌的治疗效应,阐明其对免疫微环境中T细胞亚群和细胞因子的影响,并研究IL-28B在体外对Treg生成的影响。研究方法(1)利用HEK 293细胞扩增腺病毒载体rAd-mIL-28B,PCR鉴定目的基因,TCID50法测定病毒滴度。(2)MTT法检测IL-28B体外对宫颈癌TC-1细胞增殖的抑制效应。(3)第0天BALB/c雌性小鼠皮下注射1 × 106个小鼠肝癌H22细胞,分别于第4、7和10天瘤内注瘤组织、脾脏、肺脏、肝脏和胸腺湿重;取肿瘤组织HE染色后观察细胞形态;注射1 × 108 PFUs rAd-mIL-28B,测量肿瘤直径。第1 1天处死小鼠,称量肿分离脾脏和肿瘤组织的淋巴细胞,流式细胞术(flow cytometer,FCM)检测T细胞CD4、CD8、Foxp3和PD-1分子的表达;分离血清及制备肿瘤组织匀浆,蛋白芯片技术检测Th1、Th2、Th17、IL-10和单核细胞相关细胞因子水平。(4)分离BALB/c小鼠脾细胞,利用CD3单抗/CD28单抗、IL-2、TGF-β诱导生成iTreg细胞,在此诱导条件下加入IL-28B培养3天后,FCM检测CD4、CD25 和 Foxp3 分子,RT-PCR 检测 Foxp3 和 PD-1 mRNA 水平,ELISA 检测细胞培养上清IL-10水平。(5)构建H22荷瘤小鼠,每天给予E2-a灌胃治疗,剂量为100 mg/kg/day并于第4、7和10天瘤内注射1 × 108 PFUs rAd-mIL-28B,测量肿瘤直径。第11天处死小鼠,称量肿瘤组织湿重;取肿瘤组织HE染色后观察细胞形态;分离脾脏和肿瘤组织的淋巴细胞,FCM检测T细胞CD4、CD8、Foxp3和PD-1分子的表达;分离血清蛋白芯片技术检测Th1、Th2、Th17、IL-10和单核细胞相关细胞因子水平。研究结果(1)PCR法鉴定扩增的腺病毒载体rAd-mIL-28B含有IL-28B基因,TCID50法检测 rAd-mIL-28B 滴度为 1 × 1010.6 PFU/ml,rAd-EGFP 滴度为 1 X 109.55 PFU/ml。(2)MTT试验证明50 μg/ml IL-28B和100 μg/ml IL-28B作用宫颈癌TC-1细胞72h后,OD值分别为0.80±0.09和0.85±0.08,低于阴性对照组(0.92±0.06)(p<0.05)。(3)在肝癌皮下移植瘤小鼠模型中,rAd-mIL-28B组肿瘤体积为796.74 ±447.58 mm3,低于 rAd-EGFP 组(1415.27±513.37 mm3)(p<0.05);rAd-mIL-28B组平均肿瘤重量为 0.63±0.30 g,低于 rAd-EGFP 组(1.16±0.34 g)(p<0.05),抑瘤率为 45.69%;肿瘤组织HE染色后,rAd-mIL-28B组可见肿瘤细胞坏死;rAd-mIL-28B 组的肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)中 CD8+T 细胞占淋巴细胞的比例(8.65±5.49%)高于未治疗组(3.21±1.45%)(p<0.05);与 rAd-EGFP 组相比,rAd-mIL-28B 组 TME 中 Foxp3+T 和 CD4+Foxp3+细胞占淋巴细胞的比例无统计学差异(p>0.05);rAd-mIL-28B组脾脏CD4+Foxp3+占CD4+T 细胞的比例为 16.78±2.93%,低于 rAd-EGFP 组(21.47±4.17%)(p<0.05);rAd-mIL-28B组脾脏中CD4+PD-1+T细胞占淋巴细胞比例为1.46±0.08%,明显低于 rAd-EGFP 组(2.40±0.31%)(p<0.05);与 rAd-EGFP 组相比,rAd-mIL-28B 组血清 CXCL13,ICAM-1,MCP-5 和 IL-7 水平降低(p<0.05),rAd-mIL-28B肿瘤组织内IL-15和sFasL的表达降低(p<0.05)。(4)与未刺激的脾细胞相比,脾细胞刺激组(500 ng/ml CD3单抗/CD28单抗、5 ng/ml IL-2和1.25

关键词： 系统性红斑狼疮   动脉粥样硬化   调节性B细胞   辅助性T细胞17  

摘要： 目的:系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种累及多种系统及器官的自身免疫性疾病,其发生与多种因素相关,常伴有自身抗体产生。国内外学者的研究表明无论诊断SLE的时间长短,心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）始终是导致SLE患者死亡的首要原因,而SLE患者患CVD风险较高,主要与动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）加速有关。既往研究发现辅助性T细胞17（T helper cell 17,Th17）与调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）失衡是导致SLE患者AS高发的重要原因之一。而调节性B细胞（regulatory B cells,Bregs）可间接调节Th17/Treg细胞平衡从而抑制炎性因子的释放。因此,本研究我们通过比较SLE早发AS患者、SLE患者、健康人群血清中Bregs、Th17及Tregs相关细胞因子的表达,并建立LDLr-/-小鼠+Pristane模型,通过RT-PCR、流式细胞、ELISA等实验检测SLE早发AS小鼠Breg细胞的表达及其对调控Th17/Treg细胞平衡以及对下游炎性因子释放的影响,并分析其可能分子机制,为预防及靶向治疗SLE早发AS提供理论依据。方法:1、收集2020年4月～2021年1月在桂林医学院附属医院风湿免疫科住院的SLE患者,依据颈动脉彩色多普勒超声检查结果,将SLE患者进行分组,将颈动脉内膜中层厚度（carotid intima-media thickness,c IMT）≥1.0mm的SLE患者作为SLE-AS组;将c IMT<1.0mm的SLE患者作为SLE-non AS组。收集SLE患者细胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ、TNF-α）检测结果和一般临床资料（如性别、年龄）、病程、体重指数（BMI）、疾病活动度（SLEDAI）、球蛋白、血脂组合（TG、CHO、HDL、LDL、APO-A、APO-B、LPa）、免疫一组（Ig M、Ig A、Ig G）、补体（C3、C4）、C反应蛋白（CRP）、血沉（ESR）、24小时尿蛋白水平。选取同一时间段在桂林医学院附属医院健康体检中心体检与SLE患者的性别、年龄匹配的健康体检者作为Control组,收集细胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ、TNF-α）检测结果和一般临床资料（如性别、年龄）,进行统计学分析。2、通过向10只8周龄的LDLr-/-小鼠腹腔注射Pristane试剂构建SLE早发AS小鼠的模型,作为SLE-AS组,同周龄的10只MRL/lpr小鼠作为SLE组,10只C57BL/6小鼠作为正常对照组,均为雌性,高脂饲料喂养14周后称重,记录观察各小鼠的皮肤毛发情况,摘眼球取血后检测白蛋白、血脂四项（TG、CHO、LDL、HDL）、补体C3、免疫球蛋白（Ig G）水平,取血清行酶联免疫吸附（ELISA）法检测抗核抗体（ANA）、抗双链DNA（ds DNA）抗体、细胞因子（IL-10、IL-17、IL-35、TGF-β、TNF-α）,取肾脏组织行HE染色、PAS染色,取主动脉行油红O染色;取脾脏后通过流式细胞术检测Bregs、Th17、Tregs表达,通过RT-PCR检测IL-10、RORγt、Foxp3 m RNA表达。结果:1、临床研究的结果:（1）共纳入SLE-AS组患者29例,SLE-non AS组患者106例,均无吸烟史,均有使用激素治疗,Control组共纳入242例。（2）SLE-AS组患者的年龄、病程时间、BMI、CHO、LDL、APO-B、LPa、ESR水平均高于SLE-non AS组患者,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）与Control组比较,SLE-non AS组患者血清IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α水平明显升高,SLE-AS组患者血清IL-6水平升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。但SLE-AS组和SLE-non AS组患者的细胞因子水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。（4）多因素Logistic回归分析结果显示年龄（OR 1.081,95%CI 1.025,1.141;P=0.004）、BMI（OR 1.402,95%CI 1.134,1.732;P=0.002）是SLE并发AS的危险因素。（5）SLE-AS组患者血清IL-2与疾病活动度SLEDAI呈负相关性（r=-0.517）,IL-6与球蛋白呈正相关性（r=0.388）,IFN-γ与Ig M呈正相关性（r=0.537）,均具有统计学意义（P<0.05）。（6）SLE-AS组患者血清IL-10/IL-17比值与TG、

关键词： CD5+CD19+B细胞   IL-10   CD4+细胞   炎症性肠病   克罗恩病   溃疡性结肠炎  

摘要： 目的:炎症性肠病包括克罗恩病及溃疡性结肠炎,CD4+T细胞在炎症性肠病炎症反应中有重要作用。调节性B细胞在许多免疫炎症反应中起到调节作用,目前调节性B细胞尚无特异性表面标记,CD5+CD19+细胞作为调节性B细胞中的一种具有一定的免疫调节功能。本实验旨在探索调节性B细胞在炎症性肠病中的作用及机制。方法:提取23名炎症性肠病患者(14名克罗恩病患者、9名溃疡性结肠炎患者)及12名正常对照组的外周血,分离PBMC,用荧光抗体APC-CD5、FITC-CD19标记,并用流式细胞学分析,在刺激培养48 h之后,将PBMC破膜并用荧光抗体PE-IL-10染色,流式下检测细胞内IL-10的表达,使用蛋白芯片检测细胞培养上清IL-10的表达。PBMC在剔除或没有剔除CD5+CD19+B细胞的条件下,用Percpcy5.5-IFN-γ、FITC-CD4进行标记,流式下检测CD4+IFN-γ+细胞的表达。结果:IBD组中CD5+CD19+细胞的比例显著高于NC组,IBD组与NC组之间CD5+CD19+IL10+细胞的比例和数量的差异无统计学意义,IBD组CD5+CD19+IL-10+细胞占CD5+CD19+细胞的比例显著低于NC组,蛋白芯片提示细胞培养上清中IL-10为克罗恩病组与溃疡性结肠炎组的差异蛋白。利用磁珠分选去除CD5+CD19+细胞后IBD组中CD4+Ifn-γ+细胞比例显著高于NC组,去除CD5+CD19+细胞前后IBD组中CD4+Ifn-γ+细胞比例变化显著高于NC组。结论:CD5+CD19+细胞作为Breg在IBD患者中体现出了数量的差异,并且存在功能的缺陷,在IBD中对CD4+T细胞具有抑制作用,但其抑制CD4+T细胞的具体机制值得我们进一步探索。

关键词： 调节性B细胞   移植免疫耐受   CD4+T细胞   CD8+T细胞   Tregs  

摘要： 目的:免疫调节细胞在诱导同种异体移植免疫耐受上是极具潜力的免疫治疗新途径。根据研究发现过继转移耐受性B细胞可以诱导移植耐受,因此诱导具有抗原特异性的调节性B细胞(Bregs)的产生及扩增是诱导免疫耐受的有效手段。本论文通过TLR信号通路体外激活扩增B细胞(Bregs-TLR),明确扩增后Bregs-TLR的细胞表型及与调节性功能相关的细胞因子IL-10的表达,并与已经验证的Bregs进行比较,探索和研究此Bregs-TLR在皮肤和胰岛移植中的免疫耐受诱导作用。并进一步研究其在诱导移植耐受过程中,与CD4+T,CD8+T以及Tregs的作用关系及相关作用机制,为寻找移植耐受的新型治疗方案提供理论依据。方法:建立B细胞体外扩增培养系统,激活扩增B6 B及OBI B细胞。通过流式细胞术检测扩增后Bregs-TLR细胞表型及细胞因子。构建小鼠胰岛移植及皮肤移植模型,将Bregs-TLR进行过继转移验证其调节功能。通过体外MLR以及体内建立抗原特异性免疫移植模型研究Bregs-TLR对CD4+T和CD8+T增殖和功能的影响。利用Transwell验证Bregs-TLR与T细胞的作用方式。使用SCID小鼠建立皮肤移植模型,采用IL-10及TGF-β抗体中和,验证Bregs-TLR对Tregs的诱导作用及作用机制。最后利用来自IL-10-/-小鼠和CD19cre/WTTGF-βfl/fl小鼠的B细胞,分离扩增IL-10-/-Bregs-TLR和TGF-β-/-Bregs-TLR并过继转移到胰岛移植模型进一步确认Bregs-TLR诱导耐受机制。结果:1)成功建立B细胞体外扩增培养体系。B6及OBI小鼠脾脏B细胞通过TLR信号通路激活扩增后,细胞数量增加2倍左右且细胞体积明显增大。2)细胞表型鉴定结果显示,B6 Bregs-TLR细胞表型主要为IgMhhiIgDint/lo与IgM+IgD-CD21-CD23-T1B 类似,OBI Bregs-TLR 细胞表型与 CD19+CD21hiCD23loMZ B相似。与B细胞活化及调节功能相关的细胞因子MHC-Ⅱ,LAP,CD40,CD80,CD86,PD-L1,IL-10等均明显上调,OBI相对于B6区别在于IgM与IgD表达极低,其他均相似。3)过继转移Bregs-TLR至移植动物模型中发现Bregs-TLR可以延长皮肤移植物及胰岛移植物的存活,4)体外MLR和体内建立抗原特异性移植模型探索Bregs-TLR与CD4+T的相互作用的结果显示,无论在体内外,Bregs-TLR均可抑制CD4+T细胞的增殖及其细胞因子TNF-α以及IFN-γ表达,同时可以诱导CD4+T的凋亡。Bregs-TLR通过细胞直接接触抑制CD4+T细胞反应,此抑制作用具有抗原特异性和剂量依赖性。5)与CD4+T相似的模型探索Bregs-TLR与CD8+T细胞的相互作用关系显示,Bregs-TLR与CD8+T细胞的关系在体外与体内相互矛盾,在体外可以抑制CD8+T细胞增殖及细胞因子IFN-γ分泌,并且可以诱导CD8+T细胞凋亡,其相互之间的作用方式是细胞直接接触;但是在体内却不能抑制CD8+T细胞的增殖。6)在皮肤移植模型中,在相同以及同等剂量的抗原刺激下,CD8+T比CD4+T表现出更快和更强的免疫应答,其中CD8介导是系统性免疫反应,CD4介导的是局部免疫反应。7)在皮肤移植模型中,Bregs-TLR可以上调CD4+Foxp3+Tregs,并且通过 TGF-β 而不是 IL-10 将 CD4+CD25-T 转化为CD4+CD25+Foxp3+Tregs。8)在胰岛移植模型中,TGF-β-/-Bregs-TLR过继转移后迅速发生排斥,但是IL-10-/-Bregs-TLR可以维持至少40%的胰岛移植小鼠长期存活,Bregs-TLR诱导免疫耐受依赖TGF-β而不是IL-10。结论:在体外通过TLR信号通路,使用CPG,LPS,PMA以及Ionomycin联合刺激方案可以显著地激活和扩增B细胞,且扩增后的Bregs-TLR具备与已经验证的Bregs的调控功能相关的细胞表型及细胞因子表达,可延长皮肤和胰岛移植物存活。在诱导移植耐受的过程中,Bregs-TLR通过细胞直接接触的方式控制细胞效应因子的分泌以及诱导细胞凋亡的方式控制CD4+T和CD8+T细胞介导的免疫应答,并且Bregs-TLR通过TGF-β而不是IL-10上调Tregs来诱导移植免疫耐受,此耐受诱导依赖抗原特异性。