关键词： 调节性B细胞   慢性乙型肝炎   获得性免疫缺陷综合征   慢性丙型肝炎  

摘要： 调节性B细胞(regulatory B cells,Breg)是一类具有负向免疫调节作用的B淋巴细胞亚群,其对免疫应答的调控已被认为是小鼠和人类免疫系统的一个新的重要组成部分。以往对Breg的研究主要集中于肿瘤和自身免疫性疾病中,但近年来Breg在慢性感染性疾病中的作用引起关注。本文归纳了Breg的表型、作用方式及其在慢性感染性疾病进程中所发挥的作用,以期为慢性感染性疾病的免疫治疗提供新的方向。

关键词： CD19^(+)CD24^(high)CD27^(+)调节性B细胞   TH1/TH2/TH17细胞因子   手足口病  

摘要： 目的探讨调节性B细胞(Breg)和TH1/TH2/TH17细胞因子在儿童手足口病(HFMD)中的作用。方法应用流式细胞术检测93例HFMD外周血CTL细胞、NK细胞、Breg细胞和Treg细胞的表达情况,CBA方法分析血清TH1/TH2/TH17细胞因子表达水平。以41例健康儿童为对照。结果 HFMD轻重症组Breg细胞和Treg细胞的表达均显著低于照组(P <0.01),重症组显著低于轻症组(P <0.01);CTL细胞和NK细胞及其颗粒酶B和穿孔素表达水平显著高于对照组(P <0.01),重症组显著高于轻症组(P <0.01)。HFMD血清IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17A表达水平显著高于对照组(P <0.01),重症组IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A表达水平均显著高于轻症组,上述差异均有统计学意义(P <0.01)。相关性分析显示,Breg与Treg的表达呈正相关(r=0.55,P <0.01);轻症组Breg、Treg与IL-10表达水平呈正相关(r值分别为0.73、0.83,P <0.01)。结论 HFMD Breg细胞表达水平显著减低,TH1/TH2/TH17细胞因子表达水平明显改变,这些变化可能参与HFMD病情进展。

关键词： 调节性B细胞   免疫性血小板减少症   发病机制  

摘要： 目的探讨调节性B细胞(regulatory B cells,Breg细胞)在免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)中的变化及意义。方法选取2017年1月至2020年1月新疆维吾尔自治区人民医院门诊就诊或住院初次明确诊断为ITP的31例患者纳入观察组;另选择同期于该院门诊健康体检者20例纳入对照组。ITP患者均采用大剂量地塞米松治疗。采集ITP患者治疗前后和对照组研究对象体检当日外周血2 ml,采用流式细胞仪测定CD19^(+)CD24^(^(hi))CD38^(^(hi))Breg细胞、调节性T细胞(regulatory T cells,Treg细胞)、CD19^(+)CD23^(+)B细胞和CD4^(+)CD25^(+)T细胞变化;采用酶联免疫吸附测定检测血清白介素-10(interleukin-10,IL-10)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平。比较观察组和对照组研究对象、观察组患者治疗前和治疗后、观察组中缓解患者和无效患者外周血CD19^(+)CD24^(^(hi))CD38^(^(hi))Breg细胞表达率、Treg细胞水平、CD19^(+)CD23^(+)B细胞和CD4^(+)CD25^(+)T细胞表达率、血清IL-10和TNF-α水平。结果观察组患者外周血CD19^(+)CD24^(hi)CD38^(hi)Breg细胞表达率、CD4^(+)CD25^(+)T细胞表达率、Treg细胞水平和血清IL-10水平均显著低于对照组(均P<0.001),CD19^(+)CD23^(+)B细胞表达率和血清TNF-α水平均显著高于对照组(均P<0.001)。观察组患者治疗后外周血CD19^(+)CD24^(^(hi))CD38^(^(hi))Breg细胞表达率、CD4^(+)CD25^(+)T细胞表达率、Treg细胞水平和血清IL-10水平均显著高于本组治疗前(均P<0.001),CD19^(+)CD23^(+)B细胞表达率和血清TNF-α水平均显著低于本组治疗前(均P<0.001)。观察组中无效患者外周血CD19^(+)CD24^(hi)CD38^(hi)Breg细胞表达率、CD4^(+)CD25^(+)T细胞表达率、Treg细胞水平和血清IL-10水平均显著低于缓解患者(均P<0.001),CD19^(+)CD23^(+)B细胞表达率和血清TNF-α水平均显著高于对照组(均P<0.001)。结论ITP患者存在Breg细胞比例失衡,其变化程度与病情有关联,故而Breg细胞在ITP发病机制中具有重要意义。

关键词： 多发性硬化   调节性B细胞   白细胞介素-10   白细胞介素-35   转化生长因子-β  

摘要： 自身免疫性疾病(autoimmune disease,AID)是遗传易感个体的多因素疾病,调节性B细胞(regulatory B cell,Bregs)通过产生白细胞介素(interleukin,IL)-10、IL-35、转化生长因子-β(tumor necrosis factor-β,TGF-β)在AID中发挥重要作用。多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一类重要的神经系统免疫性疾病,在MS实验性自身免疫性脑脊髓炎模型(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)中,缺乏Bregs会导致更严重和更急性的EAE,这表明Bregs在抑制早期阶段疾病的启动和发展中尤为重要。文章就Bregs通过分泌细胞因子IL-10、IL-35、TGF-β抑制MS炎症反应的机制进行综述。

关键词： 重症肺炎   调节性B细胞   儿童   细胞因子  

摘要： 背景重症肺炎是儿科常见的呼吸系统疾病,也是我国住院儿童死亡的主要原因。炎性细胞因子大量分泌、免疫平衡被打破所致的病理性免疫损伤在重症肺炎的疾病进程中占据着重要作用。既往研究显示,重症肺炎患儿体内存在细胞因子异常,患儿血清中促炎性细胞因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)及白细胞介素(interleukin,IL)-17A水平高于健康对照者,抑炎性细胞因子IL-10的水平存在波动,这些细胞因子水平反映了机体的炎症状态,并与重症肺炎的发病及预后密切相关。调节性B细胞(regulatory B cell,Breg)是一类新发现的具有负向调节作用的B淋巴细胞亚群,可通过分泌抑制性细胞因子或直接的细胞接触介导免疫耐受、抑制过度炎症反应,在多种疾病中参与免疫调控。Breg可通过分泌IL-10或上调调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)表达的方式调控机体TNF-α、IL-17A的水平,但儿童重症肺炎中TNF-α、IL-17A及IL-10水平的变化是否与Breg相关,儿童重症肺炎中Breg如何表达,目前尚不明确。因此分析Breg及其相关细胞因子在重症肺炎患儿中的表达水平,对进一步探究儿童重症肺炎的免疫机制具有重要意义。目的测定重症肺炎患儿外周血中Breg占B淋巴细胞的比例及相关细胞因子IL-10、TNF-α、IL-17A的水平,并与普通肺炎患儿及健康对照儿童相比,探究Breg在不同严重程度的肺炎患儿体内的表达差异及与IL-10、TNF-α、IL-17A细胞因子的相关性,探讨Breg和其介导的免疫反应在儿童重症肺炎中的作用。方法本研究纳入30例重症肺炎患儿、30例普通肺炎患儿和20例健康对照儿童,肺炎患儿于入院时行小儿危重病例评分(pediatric critical illness score,PCIS),并于24小时内收集外周静脉血2mL,应用流式细胞仪检测CD19+CD24hiCD38hi B细胞占B淋巴细胞的比例及IL-10、TNF-α、IL-17A的表达水平。利用SPSS 23.0软件行统计学分析,比较3组之间的Breg比例及IL-10、TNF-α、IL-17A水平差异,分析重症肺炎及普通肺炎患儿体内Breg比例与患儿住院天数、PCIS评分、IL-10、TNF-α、IL-17A的相关性,再根据是否接受机械通气、28天治疗结局分组,分别比较不同组别重症肺炎患儿住院时间、PCIS评分、Breg比例、IL-10、TNF-α、IL-17A水平。通过计算曲线下面积(area under the curve,AUC 值)、灵敏度和特异度来评价Breg比例及PCIS评分对肺炎严重程度评估的准确性。结果(1)重症肺炎患儿、普通肺炎患儿及健康对照儿童之间的Breg比例、IL-10、TNF-α、IL-17A水平有差异(P<0.05)。与普通肺炎患儿及健康对照儿童相比,重症肺炎患儿Breg 比例降低,IL-10、TNF-α、IL-17A含量升高(均P<0.05)。与健康对照儿童相比,普通肺炎患儿外周血Breg 比例、IL-10、TNF-α、IL-17A含量均升高(均P<0.05)。(2)重症肺炎患儿入院时患儿PCIS评分较普通肺炎患儿降低(P<0.05),;重症肺炎患儿较普通肺炎患儿的住院时间延长(P<0.05)。(3)重症肺炎患儿Breg 比例与患儿住院时间、TNF-α、IL-17A水平呈负相关(r=-0.370,r=-0.548,r=-0.490,均P<0.05),与 PCIS 评分正相关(r=0.438,P<0.05)。重症肺炎患儿外周血的Breg比例与IL-10水平无明显相关(P>0.05)。普通肺炎患儿的Breg 比例与患儿PCIS评分、IL-10水平呈正相关(r=0.411,r=0.468,P<0.05),与 TNF-α、IL-17A 水平呈负相关(r=-0.316,r=-0.551,均P<0.05)。普通肺炎患儿外周血的Breg 比例与患儿住院天数无明显相关(P>0.05)。(4)机械通气组患儿住院时间、TNF-α、IL-17A水平较非机械通气组患儿增加(均P<0.05),PCIS评分、Breg比例较非机械通气组患儿降低(均P<0.05),而两组之间IL-10水平的差异无统计学意义(P>0.05)。(5)在30例重症肺炎患儿中,有2例28天内死亡病例,此两例患儿体内的Breg 比例、IL-10水平较其他患儿降低,TNF-α、IL-17A水平较其他患儿高,但差异无统计学意义(均P>0.05)。(6)经ROC曲线分析,患儿入院24h内的Breg比例用于预测肺炎严重程度的准确度为0.8539(95%置信区间:0.758-0.950),Breg 比例<7.8%用于诊断重症肺炎的灵敏度为0

关键词： 肿瘤   调节性B细胞   调节性T细胞   IL-10  

摘要： 目的:探究CD19+CD24hi CD38hi调节性B细胞(B regulatory cells,Bregs)在卵巢癌患者外周血中的表达频率及其与国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)分期间的关系,并分析其与调节性T细胞(T regulatory cells,Tregs)及白细胞介素-10(Interleukin 10,IL-10)之间的相关性。方法:(1)根据术后病理结果将本次研究中的所有患者分为两组,即卵巢良性肿瘤组和卵巢癌组;(2)运用流式细胞术检测所有患者样本外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)中CD19+CD24hi CD38hi Bregs细胞表达频率;(3)运用流式细胞术检测所有患者外周血样本PBMC中CD4+CD25+Tregs细胞表达频率;(4)采用酶联免疫吸附实验检测血清IL-10的表达水平;(5)收集患者临床病理资料进行整理和分析,揭示Bregs、Tregs与临床病理情况之间的关系。结果:(1)卵巢良性肿瘤患者外周血中Bregs百分比为1.68(1.49～1.89)%,卵巢癌患者外周血中Bregs百分比为2.27(2.04～2.56)%,有统计学差异;(2)卵巢良性肿瘤患者外周血中Tregs百分比为2.60(2.33～2.86)%,卵巢癌患者外周血中Tregs百分比为4.22(3.89～4.58)%,有统计学差异;(3)卵巢良性肿瘤患者IL-10浓度为(11.068±3.233)pg/ml,卵巢癌患者IL-10浓度为(29.026±12.462)pg/ml,有统计学差异;(4)卵巢癌患者外周血中异常上调Bregs、Tregs与卵巢癌患者FIGO分期密切相关。结论:与卵巢良性肿瘤患者相比,Bregs和Tregs在卵巢癌患者外周血中所占比例显著升高,能够通过IL-10的分泌参与卵巢癌免疫反应,并与较差的临床分期相关,这可能为卵巢癌的免疫治疗提供新靶点。

关键词： 乳酸   调节性B细胞   GPR81   PPARα   ROS   肺腺癌  

摘要： 研究背景与目的:调节性B细胞（regulatory B cells,Bregs）是一群具有免疫调节功能的B细胞的统称,近年来的研究发现Breg细胞在自身免疫性疾病、感染、肿瘤等多种疾病参与免疫调节反应。Breg细胞通过多种机制发挥促肿瘤作用,而肿瘤微环境中Breg细胞的分化机制尚不明确。乳酸是肿瘤细胞的代谢产物之一,乳酸影响多种免疫细胞的分化及功能,在肿瘤免疫耐受、免疫逃逸等方面发挥重要作用。而乳酸对B细胞分化及功能影响的研究较少,尚不明确。本课题通过对体外乳酸处理后B细胞免疫表型和功能的变化及其机制的研究,结合小鼠体内LDHA敲低D121细胞肺腺癌模型中B细胞及CD8+T细胞等其他免疫细胞的比率及活性研究,阐释了乳酸诱导B细胞向Breg样细胞分化及促进肿瘤进展的作用及其机制。研究方法:（1）磁珠分选小鼠脾脏B细胞,使用BAFF,BAFF联合乳酸分别培养B细胞2天,流式检测乳酸对B细胞中Bregs相关表型分子表达的影响。磁珠分选小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞,将上述两组B细胞分别与CFSE标记的CD3、CD28刺激的CD4+和CD8+T细胞共培养2-3天,流式评估乳酸处理的B细胞对T细胞增殖的影响。（2）使用BAFF,BAFF联合乳酸分别培养小鼠脾脏B细胞2天,荧光定量PCR检测两组B细胞内IL-10等免疫抑制分子以及PPARα、NADPH氧化酶相关亚基m RNA的表达差异。流式检测两组B细胞内IL-10、TGFβ、PD-L1以及ROS等分子的表达差异。蛋白免疫印迹检测两组B细胞内p40phox和p47phox蛋白表达差异。（3）磁珠分选小鼠脾脏B细胞体外培养2天,分为BAFF,BAFF+乳酸,BAFF+GPR81激动剂,BAFF+乳酸+GPR81抑制剂,BAFF+乳酸+PPARα抑制剂处理组,比较不同处理方法对B细胞免疫抑制功能的影响。此外,在体外乳酸诱导的B细胞与T细胞共培养体系中,分别加入anti-IL-10抗体,anti-TGFβ抗体,anti-PD-L1抗体,iNOS拮抗剂,arg-1拮抗剂或过氧化氢酶,流式评估上述分子对乳酸诱导Breg样细胞免疫调节功能的影响。明确乳酸诱导Breg样细胞免疫抑制功能的分子机制。（4）应用慢病毒CRISPR/cas9技术敲低小鼠肺腺癌细胞系D121细胞内LDHA基因,分别给予B6小鼠接种NC组D121细胞和LDHA KD D121细胞得到肺腺癌小鼠模型。记录两组荷瘤鼠肿瘤大小,绘制肿瘤增长曲线,以此评估LDHA敲低对小鼠肿瘤增长的影响。第20天处死小鼠,流式检测两组荷瘤小鼠脾脏、肿瘤内CD8+INFγ+T细胞、CD8+GrB+T细胞、CD25+CD81+B细胞、IL-10+B细胞、Treg细胞和MDSCs的比例,以及B细胞内ROS表达水平,磁珠分选两组肿瘤内B细胞,荧光定量PCR比较两组B细胞中NADPH氧化酶相关亚基m RNA的表达水平,明确乳酸对Breg样细胞分化的影响及其促进肿瘤增长的机制。（5）流式细胞分析法测定肺癌患者及健康对照组外周血中CD24hiCD38hiB细胞和IL-10+B细胞的比例,磁珠分选健康人外周血中T和B细胞,乳酸培养B细胞2天,B细胞与CFSE标记的CD3、CD28刺激的T细胞共培养3-5天,流式评估乳酸对B细胞IL-10、ROS及CD24、CD38表达的影响,流式评估乳酸诱导的Breg样细胞对T细胞增殖的影响。通过免疫荧光染色明确肺腺癌组织及癌旁组织内LDHA与ROS+CD19+B细胞的共定位关系,明确乳酸对表达ROS的Breg样细胞分化的影响。研究结果:（1）乳酸上调小鼠B细胞CD25和CD81的表达,使B细胞具有Breg样表型。（2）乳酸诱导的Breg样细胞显著抑制T细胞增殖。乳酸诱导Breg样细胞免疫抑制功能与IL-10、TGFβ、PD-L1、arg-1、i NOS、IDO等效应分子无关。（3）乳酸通过NADPH氧化酶上调小鼠B细胞ROS的表达,乳酸诱导的Breg样细胞通过ROS发挥抑制T细胞增殖的免疫调节功能。（4）乳酸促进小鼠B细胞中GPR81 m RNA的表达,GPR81激动剂3,5-DHBA处理的B细胞高表达ROS,并抑制T细胞增殖,而GPR81阻断剂3-OBA可逆转乳酸诱导的Breg样细胞的免疫抑制功能,乳酸通过结合并激活GPR81受体诱导小鼠B细胞发挥免疫抑制功能。（5）乳酸通过结合小鼠B细胞表面GPR81受体,促进小鼠B细胞中PPARα的表达,诱导B细胞内ROS表达水平增高,PPARα阻断剂逆转乳酸诱导B细胞ROS的表达和免疫抑制功能的发挥,乳酸通过GPR81-PPARα-ROS通路诱导Breg样细胞分化并发挥免疫抑制功能。（6）LDHA敲低使荷瘤小鼠肿瘤体积减少,肿瘤组织内Ki-67表达降低,脾脏及肿瘤内CD25+CD81+B细

关键词： 调节性B细胞   系统性红斑狼疮   白细胞介素-10   白细胞介素-35   转化生长因子-β  

摘要： 背景:调节性B细胞(Regulatory B cells,Bregs)是以负性调节功能为特征的B细胞亚群,具有抑制炎症免疫反应、预防自身免疫反应的调节作用,参与多种免疫病理过程。Bregs既可通过分泌大量的抑制性细胞因子以浓度依赖的方式,亦可通过连接负性共刺激因子以接触依赖的方式发挥其功能。Bregs在包括自身免疫性疾病在内的多种疾病发病过程中扮演着重要角色。但Bregs在SLE病程中的分布规律、对于免疫细胞的影响以及免疫调节功能的作用机制目前尚不明确。目的:(1)明确SLE患者外周血Bregs亚群的表达情况及分布特点,比较SLE患者中Bregs的功能变化,分析Bregs亚群与SLE临床指标的相关性。(2)明确治疗前后SLE患者外周血Bregs的转归。(3)探索Bregs及其功能分子对CD4+T细胞分化、增殖以及功能的影响,探讨Bregs参与SLE疾病发生发展的可能机制。方法:(1)选取新发初治的SLE患者(n=72),同时选取年龄、性别匹配的健康对照,统计SLEDAI-2K、补体、血沉、C反应蛋白、尿蛋白等临床指标。(2)通过流式细胞术对外周血Bregs亚群、B细胞亚群、Th细胞亚群等细胞群的表达和分布进行分析,利用细胞内染色流式对Bregs亚群进行功能分析。应用ELISA技术测定了外周血中IL-10、IL-35、TGF-β1以及BAFF水平,CBA技术测定Th细胞功能分子水平。(3)分析Bregs亚群与SLE临床指标之间的相关性。(4)随访规范治疗的SLE患者,研究治疗前后Bregs亚群细胞水平和IL-10、IL-35、TGF-β1水平的变化。(5)通过在体外模拟SLE患者Bregs与CD4+T细胞的作用环境,建立transwell共培养体系,研究SLE中Bregs对CD4+T细胞的影响及其可能的作用机制。结果:(1)流式细胞术分析发现,SLE患者外周血中IL-10+Bregs以及IL-35+Bregs亚群细胞比例降低,TGF-β1+Bregs比例无明显变化。CD19+CD24hiCD38hi过渡期Bregs和CD19+CD24hiCD27+记忆Bregs细胞比例减低。CD19+CD24hiCD38hiBregs在外周血总CD3-CD19+B细胞中的比例要低于CD19+CD24hiCD27+Bregs。相关性分析发现,SLE患者外周血IL-10+Bregs的比例与CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈明显正相关,IL-35+Bregs的比例与CD19+CD24hiCD38hiBregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈明显正相关。(2)SLE患者血浆中IL-35、TGF-β1水平明显减低,IL-10水平升高。IL-35水平与IL-35+Bregs亚群比例、CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例明显相关。(3)体外细胞培养试验表明,SLE患者CD19+CD24hiCD27+Bregs产IL-10以及IL-35水平均高于CD19+CD24hiCD38hi Bregs。(4)SLE患者外周血中Th17细胞的频率明显升高,血浆中TNF-α、IL-6、IL-17A、BAFF等细胞因子水平升高,IL-2水平降低。SLE患者血浆中IL-17A水平与外周血中Th17细胞的频率呈正相关,BAFF水平与外周血CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈负相关。(5)SLE患者CD27+CD38-/lo MB、CD27+CD38hi PB和CD27-CD38hi TB的频率增高,CD27-CD38-/lonaive B细胞的频率下降。IL-35+Bregs亚群比例与CD27+CD38-/loMB、CD27-CD38-/lonaive B细胞比例负相关。TGF-β1+Bregs亚群比例与CD27+CD38hiPB细胞比例负相关。CD19+CD24hiCD38hiBregs亚群比例与CD27-CD38-/lonaive B细胞比例正相关。CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例与CD27-CD38hi TB细胞比例负相关。(6)临床指标相关性分析发现,SLE患者外周血的IL-35+Bregs亚群比例与ESR呈负相关,IL-10+Bregs亚群比例与CRP呈负相关。IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD38highBregs亚群比例与血清中C3水平呈正相关。外周血的IL-10+Bregs亚群比例与血清中C4水平呈正相关。外周血的IL-10+Bregs、IL-35+Bregs亚群比例与SLE疾病活动性评分SLEDAI水平呈负相关。(7)与轻中度活动的SLE患者相比,重度疾病活动的SLE患者IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例明显降低。(8)与不伴

关键词： 姜黄素   TLR/MyD88   调节性B细胞   结肠炎   肠道菌群  

摘要： 目的:本研究采用DSS法复制小鼠复发型结肠炎模型,在评价姜黄素对结肠炎疗效,观察肠道菌群丰度与组成同时,检测小鼠结肠组织中TLR/My D88信号通路相关蛋白和调节性B细胞亚型与亚群及其有关的细胞因子的分泌,并进一步明确姜黄素通过TLR/My D88通路调控肠道菌群与调节性B细胞和细胞因子,缓解小鼠复发型结肠炎可能的作用机制。方法:1.动物分组、模型复制和给药方法:选用40只SPF级雄性BALB/c小鼠,18～22 g,适应性喂养7d后进行试验。随机将小鼠分成以下4组,正常组(Normal),复发型结肠炎模型组(DSS),复发型结肠炎模型+姜黄素治疗组(DSS+Cur),复发型结肠炎模型+美沙拉嗪对照组(DSS+5-ASA)。每组10只并用苦味酸标记编组。正常饮用水配制3%(w/v)DSS(35000-50000 k D)溶液,除正常组小鼠外,其余30只小鼠均予以3%DSS溶液自由饮用,连续5 d。后正常饮水1 w,再用2%DSS水溶液再饮用5 d。正常组予以正常饮用水,姜黄素治疗组给予200 mg·kg的姜黄素混悬液,以灌胃的方式给药;美沙拉嗪对照组给予300 mg·kg美沙拉嗪混悬液,以灌胃方式给药;正常组及DSS组给予等容积的生理盐水,以灌胃方式给药,连续10 d。2.姜黄素治疗DSS诱导的复发型结肠炎的疗效评价:每日观察各组小鼠的饮食状况、毛发状态、活动频率、结直肠出血与大便粘滞程度等体征变化,并记录小鼠体质量变化情况。处死当天称量小鼠体质量,小鼠麻醉后立即摘眼球取血于采血管内,脱颈椎处死,快速取出小鼠结肠并拍照留存。称量结肠质量,计算结肠质量指数,单位长度结肠质量,制作结肠病理切片,电子显微镜下观察结肠横切面,进行组织损伤评分。3.肠道菌群测序:样本收集,在灭菌条件下迅速随机选取六只小鼠回盲部粪便,立即置于干冰中暂时冻存,并在-80℃冰箱中储存。粪便DNA提取与PCR扩增,高通量测序获得肠道菌群数据,与基因库对比进行数据分析,探索菌群与复发型结肠炎的相关性,以及姜黄素对肠道菌群的影响,并将TLR2和TLR5与肠道菌群进行关联性分析,寻找两者之间的联系。4.调节性B细胞亚型及亚群的分析:采用流式细胞术对CD25Breg,Foxp3Breg,CD1dBreg,PD-L1Breg,Tim-1Breg,CD27Breg细胞的比率测定,并将上述细胞与肠道菌群进行关联性分析,探究姜黄素能否通过肠道菌群或直接调节Breg分化及功能治疗复发型结肠炎。5.调节性B细胞相关细胞因子分析:采用ELISA法检测结肠组织IL-1β,IL-4,IL-6,IL-10,IL-13,IL-33,CCL-2,IFN-γ,Ig A,TGF-β1和TNF-α细胞因子的分泌量并将IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-33、Ig A与肠道菌群进行关联性分析,探究姜黄素调控肠道菌群与细胞因子的关系及其缓解结肠炎炎症的机制。***/My D88信号通路相关蛋白检测:采用Western Blot Assy法对TLR4、TLR2、TLR5、My D88、IRAK1、IRAK4、NF-κB p65,TRAF6,TAB1,TAB2,TAK1,MKK3,MKK6,p38 MAPK,CREB进行检测,探究姜黄素对TLR/My D88信号通路调控作用。7.统计学分析:采用SPSS22.0软件进行统计学检验与分析,各组数据均进行正态检验及独立样本t检验,采取单因素方差分析确定显著性,相关关系采用直线回归相关分析。计量资料均以均数±标准差(?x±SD),以P<0.05表示差异具有显著性,以P<0.01表示差异具有极显著性。结果:1.姜黄素治疗结肠炎疗效评价:小鼠在DSS第一次给药后第5天,体质量增长率开始下降。到第9天,小鼠体质量增长率达到最低点,之后缓慢恢复,第十四天开始小鼠饮用2%DSS可以发现,DSS组小鼠体质量增长率开始下降,而姜黄素治疗组与美沙拉嗪对照组体质量增长率趋于平缓,具有预防作用。处死当天与DSS组比较,正常组与给药治疗后体质量增长率明显好转。与正常组相比较,DSS组小鼠的体质量、结肠长度显著下降(P<0.01,P<0.05),经治疗后则显著上升或有明显上升趋势(P<0.01)。与正常组相比,DSS组的结肠质量指数、结肠质量与结肠质量/结肠长度和结肠组织损伤评分有明显上升(P<0.05,P<0.01),经治疗后则显著降低(P<0.01)。经姜黄素与美沙拉嗪治疗后,溃疡及糜烂面积减少,炎症细胞浸润降低,血管不正常生长恢复,腺体排列规则,隐窝及杯状细胞恢复。提示姜黄素可以有效缓解治疗实验性复发型结肠炎。2.肠道菌群研究:对肠道菌群测序发现,与正常组相比DSS组多样性降低,但DSS组独有菌群上升。uncultured＿bacterium＿g＿Lachno

关键词： 再生障碍性贫血(AA)   调节性B细胞(Breg)   白介素10(IL-10)   转化生长因子β(TGF-β)   再生障碍性贫血(AA)   白介素9(IL-9)   白介素9受体(IL-9R)   发病机制  

摘要： 背景再生障碍性贫血(再障aplastic anemia,AA)是由多种原因引起的一种骨髓衰竭综合征。骨髓血细胞生成减少导致粒细胞、网织红细胞、单核细胞以及血小板均减少,临床表现为不同程度的贫血、出血和感染。目前公认,AA是T细胞介导的自身免疫性疾病。AA患者体内存在辅助性T细胞0(helper T lymphocyte 0,Th0)向辅助性T细胞1(helper T lymphocyte 1,Th1)极化和辅助性T细胞2(helper T lymphocyte 2,Th2)相对减少的免疫异常现象,导致Th1/Th2细胞比例失衡并向Th1细胞偏移,进而出现细胞免疫亢进、自身免疫被打破。这一变化可能与异常激活的T细胞分泌的细胞因子如白介素12(interleukin 12,IL-12)、干扰素γ(interferon-γ,IFN-y)等抑制骨髓造血干细胞的增殖分化有关。Th1细胞以分泌IFN-γ为特征,介导细胞免疫;Th2细胞以分泌IL-4为代表,参与体液免疫。本实验通过观察IFN-γ、IL-4的蛋白表达情况来间接观察AA患者体内Th1、Th2细胞的免疫状态。B细胞来源于造血干细胞,在骨髓成熟、次级淋巴器官激活,合成并分泌抗体,介导体液免疫。活化的B细胞表达多种细胞因子受体(cytokine receptor,CKR)、分泌多种细胞因子、参与抗原呈递、活化T细胞共同参与疾病免疫调节导致免疫紊乱。B细胞根据功能可分为效应性B细胞和调节性B细胞(regulatory B cells,Breg)。Breg细胞是类似于调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的具有免疫抑制功能的一组特殊B细胞亚群。Breg细胞主要通过分泌细胞因子IL-10、转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)发挥免疫调节作用,影响其他免疫细胞,抑制过强的免疫应答,维持免疫耐受。Breg细胞中IL-10的表达与STAT家族磷酸化改变有关,在系统性硬化病中Breg细胞的缺乏与STAT3受损密切相关,进一步证明了Breg细胞分泌IL-10依赖STAT3的磷酸化。IL-10是一具有多种生物活性的免疫抑制因子,具有抑制CD4+T细胞增殖分化及分泌IFN-γ、抑制Th1和Th2细胞向两极分化、诱导T细胞分化为Treg细胞及分泌IL-10的免疫调节功能。TGF-β通过抑制骨髓造血细胞、抑制T细胞和B细胞的增殖、抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的分化、抑制IFN-γ等炎性细胞因子的产生、诱导Treg细胞的分化及分泌细胞因子发挥免疫调节作用。另一方面Breg细胞可通过细胞间作用影响Treg细胞数量及功能而发挥免疫调节作用。在多种免疫系统疾病中Breg细胞的数量和功能均有不同程度减低,如强制性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)、慢性移植抗宿主病(chronic graft-versus-host disease,cGVHD)等。同为自身免疫性疾病的AA,Breg细胞在其发生发展中的作用及免疫调节机制如何?Breg细胞在AA患者体内发生怎样的变化及与其他免疫细胞的关系如何?为研究Breg细胞在AA发生发展中的作用,本研究首先分析了 AA患者骨髓及外周血中IL-10+CD19+Breg细胞亚群、TGF-β+CD19+Breg细胞亚群的变化;通过检测IL-10、TGF-β基因及蛋白水平表达情况,分析Breg细胞在AA患者体内的功能状态;通过分析与外周血反映骨髓增生程度相关临床指标(中性粒细胞计数、网织红细胞计数、血小板计数)的相关性,进而评估Breg细胞与AA疾病病情严重度程度及治疗预后转归的关联性。探讨Breg细胞在AA发病机制中的作用及临床意义,为AA的免疫治疗提供新的观点及方向。IL-9是一种单链糖蛋白,分子量为14kDa,是γ家族受体成员之一,主要由T细胞分泌,如Th2、Th9、Th17、Treg细胞等。IL-9与效应细胞上的白介素9受体(interleukin 9 receptor,IL-9R)结合后发挥免疫调节作用,与TGF-β协同诱导幼稚CD4+T细胞分化成Th17细胞,可增强Foxp3+Treg细胞的逆转录抑制功能。当IL-9与IL-9R结合时可通过激活JAK中的JAK1、JAK3相互磷酸化,促使STAT磷酸化,特别是STAT3磷酸化,之后它们移至细胞核以激活IL-9诱导的基因的表达,从而发挥影响细胞的增殖与凋亡作用。多项研究提示IL-9对免疫系统具有双向调节作用,不同情况下对各种疾病的抑制或促进作用各异。在实验性自身免疫性