关键词： 肿瘤   调节性B细胞   调节性T细胞   IL-10  

摘要： 目的:探究CD19+CD24hi CD38hi调节性B细胞(B regulatory cells,Bregs)在卵巢癌患者外周血中的表达频率及其与国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)分期间的关系,并分析其与调节性T细胞(T regulatory cells,Tregs)及白细胞介素-10(Interleukin 10,IL-10)之间的相关性。方法:(1)根据术后病理结果将本次研究中的所有患者分为两组,即卵巢良性肿瘤组和卵巢癌组;(2)运用流式细胞术检测所有患者样本外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)中CD19+CD24hi CD38hi Bregs细胞表达频率;(3)运用流式细胞术检测所有患者外周血样本PBMC中CD4+CD25+Tregs细胞表达频率;(4)采用酶联免疫吸附实验检测血清IL-10的表达水平;(5)收集患者临床病理资料进行整理和分析,揭示Bregs、Tregs与临床病理情况之间的关系。结果:(1)卵巢良性肿瘤患者外周血中Bregs百分比为1.68(1.49～1.89)%,卵巢癌患者外周血中Bregs百分比为2.27(2.04～2.56)%,有统计学差异;(2)卵巢良性肿瘤患者外周血中Tregs百分比为2.60(2.33～2.86)%,卵巢癌患者外周血中Tregs百分比为4.22(3.89～4.58)%,有统计学差异;(3)卵巢良性肿瘤患者IL-10浓度为(11.068±3.233)pg/ml,卵巢癌患者IL-10浓度为(29.026±12.462)pg/ml,有统计学差异;(4)卵巢癌患者外周血中异常上调Bregs、Tregs与卵巢癌患者FIGO分期密切相关。结论:与卵巢良性肿瘤患者相比,Bregs和Tregs在卵巢癌患者外周血中所占比例显著升高,能够通过IL-10的分泌参与卵巢癌免疫反应,并与较差的临床分期相关,这可能为卵巢癌的免疫治疗提供新靶点。

关键词： 调节性B细胞   系统性红斑狼疮   白细胞介素-10   白细胞介素-35   转化生长因子-β  

摘要： 背景:调节性B细胞(Regulatory B cells,Bregs)是以负性调节功能为特征的B细胞亚群,具有抑制炎症免疫反应、预防自身免疫反应的调节作用,参与多种免疫病理过程。Bregs既可通过分泌大量的抑制性细胞因子以浓度依赖的方式,亦可通过连接负性共刺激因子以接触依赖的方式发挥其功能。Bregs在包括自身免疫性疾病在内的多种疾病发病过程中扮演着重要角色。但Bregs在SLE病程中的分布规律、对于免疫细胞的影响以及免疫调节功能的作用机制目前尚不明确。目的:(1)明确SLE患者外周血Bregs亚群的表达情况及分布特点,比较SLE患者中Bregs的功能变化,分析Bregs亚群与SLE临床指标的相关性。(2)明确治疗前后SLE患者外周血Bregs的转归。(3)探索Bregs及其功能分子对CD4+T细胞分化、增殖以及功能的影响,探讨Bregs参与SLE疾病发生发展的可能机制。方法:(1)选取新发初治的SLE患者(n=72),同时选取年龄、性别匹配的健康对照,统计SLEDAI-2K、补体、血沉、C反应蛋白、尿蛋白等临床指标。(2)通过流式细胞术对外周血Bregs亚群、B细胞亚群、Th细胞亚群等细胞群的表达和分布进行分析,利用细胞内染色流式对Bregs亚群进行功能分析。应用ELISA技术测定了外周血中IL-10、IL-35、TGF-β1以及BAFF水平,CBA技术测定Th细胞功能分子水平。(3)分析Bregs亚群与SLE临床指标之间的相关性。(4)随访规范治疗的SLE患者,研究治疗前后Bregs亚群细胞水平和IL-10、IL-35、TGF-β1水平的变化。(5)通过在体外模拟SLE患者Bregs与CD4+T细胞的作用环境,建立transwell共培养体系,研究SLE中Bregs对CD4+T细胞的影响及其可能的作用机制。结果:(1)流式细胞术分析发现,SLE患者外周血中IL-10+Bregs以及IL-35+Bregs亚群细胞比例降低,TGF-β1+Bregs比例无明显变化。CD19+CD24hiCD38hi过渡期Bregs和CD19+CD24hiCD27+记忆Bregs细胞比例减低。CD19+CD24hiCD38hiBregs在外周血总CD3-CD19+B细胞中的比例要低于CD19+CD24hiCD27+Bregs。相关性分析发现,SLE患者外周血IL-10+Bregs的比例与CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈明显正相关,IL-35+Bregs的比例与CD19+CD24hiCD38hiBregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈明显正相关。(2)SLE患者血浆中IL-35、TGF-β1水平明显减低,IL-10水平升高。IL-35水平与IL-35+Bregs亚群比例、CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例明显相关。(3)体外细胞培养试验表明,SLE患者CD19+CD24hiCD27+Bregs产IL-10以及IL-35水平均高于CD19+CD24hiCD38hi Bregs。(4)SLE患者外周血中Th17细胞的频率明显升高,血浆中TNF-α、IL-6、IL-17A、BAFF等细胞因子水平升高,IL-2水平降低。SLE患者血浆中IL-17A水平与外周血中Th17细胞的频率呈正相关,BAFF水平与外周血CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈负相关。(5)SLE患者CD27+CD38-/lo MB、CD27+CD38hi PB和CD27-CD38hi TB的频率增高,CD27-CD38-/lonaive B细胞的频率下降。IL-35+Bregs亚群比例与CD27+CD38-/loMB、CD27-CD38-/lonaive B细胞比例负相关。TGF-β1+Bregs亚群比例与CD27+CD38hiPB细胞比例负相关。CD19+CD24hiCD38hiBregs亚群比例与CD27-CD38-/lonaive B细胞比例正相关。CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例与CD27-CD38hi TB细胞比例负相关。(6)临床指标相关性分析发现,SLE患者外周血的IL-35+Bregs亚群比例与ESR呈负相关,IL-10+Bregs亚群比例与CRP呈负相关。IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD38highBregs亚群比例与血清中C3水平呈正相关。外周血的IL-10+Bregs亚群比例与血清中C4水平呈正相关。外周血的IL-10+Bregs、IL-35+Bregs亚群比例与SLE疾病活动性评分SLEDAI水平呈负相关。(7)与轻中度活动的SLE患者相比,重度疾病活动的SLE患者IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例明显降低。(8)与不伴

关键词： 乳酸   调节性B细胞   GPR81   PPARα   ROS   肺腺癌  

摘要： 研究背景与目的:调节性B细胞(regulatory B cells,Bregs)是一群具有免疫调节功能的B细胞的统称,近年来的研究发现Breg细胞在自身免疫性疾病、感染、肿瘤等多种疾病参与免疫调节反应。Breg细胞通过多种机制发挥促肿瘤作用,而肿瘤微环境中Breg细胞的分化机制尚不明确。乳酸是肿瘤细胞的代谢产物之一,乳酸影响多种免疫细胞的分化及功能,在肿瘤免疫耐受、免疫逃逸等方面发挥重要作用。而乳酸对B细胞分化及功能影响的研究较少,尚不明确。本课题通过对体外乳酸处理后B细胞免疫表型和功能的变化及其机制的研究,结合小鼠体内LDHA敲低D121细胞肺腺癌模型中B细胞及CD8T细胞等其他免疫细胞的比率及活性研究,阐释了乳酸诱导B细胞向Breg样细胞分化及促进肿瘤进展的作用及其机制。研究方法:(1)磁珠分选小鼠脾脏B细胞,使用BAFF,BAFF联合乳酸分别培养B细胞2天,流式检测乳酸对B细胞中Bregs相关表型分子表达的影响。磁珠分选小鼠脾脏CD4和CD8T细胞,将上述两组B细胞分别与CFSE标记的CD3、CD28刺激的CD4和CD8T细胞共培养2-3天,流式评估乳酸处理的B细胞对T细胞增殖的影响。(2)使用BAFF,BAFF联合乳酸分别培养小鼠脾脏B细胞2天,荧光定量PCR检测两组B细胞内IL-10等免疫抑制分子以及PPARα、NADPH氧化酶相关亚基m RNA的表达差异。流式检测两组B细胞内IL-10、TGFβ、PD-L1以及ROS等分子的表达差异。蛋白免疫印迹检测两组B细胞内p40phox和p47phox蛋白表达差异。(3)磁珠分选小鼠脾脏B细胞体外培养2天,分为BAFF,BAFF+乳酸,BAFF+GPR81激动剂,BAFF+乳酸+GPR81抑制剂,BAFF+乳酸+PPARα抑制剂处理组,比较不同处理方法对B细胞免疫抑制功能的影响。此外,在体外乳酸诱导的B细胞与T细胞共培养体系中,分别加入anti-IL-10抗体,anti-TGFβ抗体,anti-PD-L1抗体,iNOS拮抗剂,arg-1拮抗剂或过氧化氢酶,流式评估上述分子对乳酸诱导Breg样细胞免疫调节功能的影响。明确乳酸诱导Breg样细胞免疫抑制功能的分子机制。(4)应用慢病毒CRISPR/cas9技术敲低小鼠肺腺癌细胞系D121细胞内LDHA基因,分别给予B6小鼠接种NC组D121细胞和LDHA KD D121细胞得到肺腺癌小鼠模型。记录两组荷瘤鼠肿瘤大小,绘制肿瘤增长曲线,以此评估LDHA敲低对小鼠肿瘤增长的影响。第20天处死小鼠,流式检测两组荷瘤小鼠脾脏、肿瘤内CD8INFγT细胞、CD8GrBT细胞、CD25CD81B细胞、IL-10B细胞、Treg细胞和MDSCs的比例,以及B细胞内ROS表达水平,磁珠分选两组肿瘤内B细胞,荧光定量PCR比较两组B细胞中NADPH氧化酶相关亚基m RNA的表达水平,明确乳酸对Breg样细胞分化的影响及其促进肿瘤增长的机制。(5)流式细胞分析法测定肺癌患者及健康对照组外周血中CD24CD38B细胞和IL-10B细胞的比例,磁珠分选健康人外周血中T和B细胞,乳酸培养B细胞2天,B细胞与CFSE标记的CD3、CD28刺激的T细胞共培养3-5天,流式评估乳酸对B细胞IL-10、ROS及CD24、CD38表达的影响,流式评估乳酸诱导的Breg样细胞对T细胞增殖的影响。通过免疫荧光染色明确肺腺癌组织及癌旁组织内LDHA与ROSCD19B细胞的共定位关系,明确乳酸对表达ROS的Breg样细胞分化的影响。研究结果:(1)乳酸上调小鼠B细胞CD25和CD81的表达,使B细胞具有Breg样表型。(2)乳酸诱导的Breg样细胞显著抑制T细胞增殖。乳酸诱导Breg样细胞免疫抑制功能与IL-10、TGFβ、PD-L1、arg-1、i NOS、IDO等效应分子无关。(3)乳酸通过NADPH氧化酶上调小鼠B细胞ROS的表达,乳酸诱导的Breg样细胞通过ROS发挥抑制T细胞增殖的免疫调节功能。(4)乳酸促进小鼠B细胞中GPR81 m RNA的表达,GPR81激动剂3,5-DHBA处理的B细胞高表达ROS,并抑制T细胞增殖,而GPR81阻断剂3-OBA可逆转乳酸诱导的Breg样细胞的免疫抑制功能,乳酸通过结合并激活GPR81受体诱导小鼠B细胞发挥免疫抑制功能。(5)乳酸通过结合小鼠B细胞表面GPR81受体,促进小鼠B细胞中PPARα的表达,诱导B细胞内ROS表达水平增高,PPARα阻断剂逆转乳酸诱导B细胞ROS的表达和免疫抑制功能的发挥,乳酸通过GPR81-PPARα-ROS通路诱导Breg样细胞分化并发挥免疫抑制功能。(6)LDHA敲低使荷瘤小鼠肿瘤体积减少,肿瘤组织内Ki-67表达降低,脾脏及肿瘤内CD25CD81B细胞和MDSCs比例降低,肿瘤组织内B细胞中

关键词： 姜黄素   TLR/MyD88   调节性B细胞   结肠炎   肠道菌群  

摘要： 目的:本研究采用DSS法复制小鼠复发型结肠炎模型,在评价姜黄素对结肠炎疗效,观察肠道菌群丰度与组成同时,检测小鼠结肠组织中TLR/My D88信号通路相关蛋白和调节性B细胞亚型与亚群及其有关的细胞因子的分泌,并进一步明确姜黄素通过TLR/My D88通路调控肠道菌群与调节性B细胞和细胞因子,缓解小鼠复发型结肠炎可能的作用机制。方法:1.动物分组、模型复制和给药方法:选用40只SPF级雄性BALB/c小鼠,18～22 g,适应性喂养7d后进行试验。随机将小鼠分成以下4组,正常组(Normal),复发型结肠炎模型组(DSS),复发型结肠炎模型+姜黄素治疗组(DSS+Cur),复发型结肠炎模型+美沙拉嗪对照组(DSS+5-ASA)。每组10只并用苦味酸标记编组。正常饮用水配制3%(w/v)DSS(35000-50000 k D)溶液,除正常组小鼠外,其余30只小鼠均予以3%DSS溶液自由饮用,连续5 d。后正常饮水1 w,再用2%DSS水溶液再饮用5 d。正常组予以正常饮用水,姜黄素治疗组给予200 mg·kg的姜黄素混悬液,以灌胃的方式给药;美沙拉嗪对照组给予300 mg·kg美沙拉嗪混悬液,以灌胃方式给药;正常组及DSS组给予等容积的生理盐水,以灌胃方式给药,连续10 d。2.姜黄素治疗DSS诱导的复发型结肠炎的疗效评价:每日观察各组小鼠的饮食状况、毛发状态、活动频率、结直肠出血与大便粘滞程度等体征变化,并记录小鼠体质量变化情况。处死当天称量小鼠体质量,小鼠麻醉后立即摘眼球取血于采血管内,脱颈椎处死,快速取出小鼠结肠并拍照留存。称量结肠质量,计算结肠质量指数,单位长度结肠质量,制作结肠病理切片,电子显微镜下观察结肠横切面,进行组织损伤评分。3.肠道菌群测序:样本收集,在灭菌条件下迅速随机选取六只小鼠回盲部粪便,立即置于干冰中暂时冻存,并在-80℃冰箱中储存。粪便DNA提取与PCR扩增,高通量测序获得肠道菌群数据,与基因库对比进行数据分析,探索菌群与复发型结肠炎的相关性,以及姜黄素对肠道菌群的影响,并将TLR2和TLR5与肠道菌群进行关联性分析,寻找两者之间的联系。4.调节性B细胞亚型及亚群的分析:采用流式细胞术对CD25Breg,Foxp3Breg,CD1dBreg,PD-L1Breg,Tim-1Breg,CD27Breg细胞的比率测定,并将上述细胞与肠道菌群进行关联性分析,探究姜黄素能否通过肠道菌群或直接调节Breg分化及功能治疗复发型结肠炎。5.调节性B细胞相关细胞因子分析:采用ELISA法检测结肠组织IL-1β,IL-4,IL-6,IL-10,IL-13,IL-33,CCL-2,IFN-γ,Ig A,TGF-β1和TNF-α细胞因子的分泌量并将IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-33、Ig A与肠道菌群进行关联性分析,探究姜黄素调控肠道菌群与细胞因子的关系及其缓解结肠炎炎症的机制。***/My D88信号通路相关蛋白检测:采用Western Blot Assy法对TLR4、TLR2、TLR5、My D88、IRAK1、IRAK4、NF-κB p65,TRAF6,TAB1,TAB2,TAK1,MKK3,MKK6,p38 MAPK,CREB进行检测,探究姜黄素对TLR/My D88信号通路调控作用。7.统计学分析:采用SPSS22.0软件进行统计学检验与分析,各组数据均进行正态检验及独立样本t检验,采取单因素方差分析确定显著性,相关关系采用直线回归相关分析。计量资料均以均数±标准差(?x±SD),以P<0.05表示差异具有显著性,以P<0.01表示差异具有极显著性。结果:1.姜黄素治疗结肠炎疗效评价:小鼠在DSS第一次给药后第5天,体质量增长率开始下降。到第9天,小鼠体质量增长率达到最低点,之后缓慢恢复,第十四天开始小鼠饮用2%DSS可以发现,DSS组小鼠体质量增长率开始下降,而姜黄素治疗组与美沙拉嗪对照组体质量增长率趋于平缓,具有预防作用。处死当天与DSS组比较,正常组与给药治疗后体质量增长率明显好转。与正常组相比较,DSS组小鼠的体质量、结肠长度显著下降(P<0.01,P<0.05),经治疗后则显著上升或有明显上升趋势(P<0.01)。与正常组相比,DSS组的结肠质量指数、结肠质量与结肠质量/结肠长度和结肠组织损伤评分有明显上升(P<0.05,P<0.01),经治疗后则显著降低(P<0.01)。经姜黄素与美沙拉嗪治疗后,溃疡及糜烂面积减少,炎症细胞浸润降低,血管不正常生长恢复,腺体排列规则,隐窝及杯状细胞恢复。提示姜黄素可以有效缓解治疗实验性复发型结肠炎。2.肠道菌群研究:对肠道菌群测序发现,与正常组相比DSS组多样性降低,但DSS组独有菌群上升。uncultured＿bacterium＿g＿Lachno

关键词： 重症肺炎   调节性B细胞   儿童   细胞因子  

摘要： 背景重症肺炎是儿科常见的呼吸系统疾病,也是我国住院儿童死亡的主要原因。炎性细胞因子大量分泌、免疫平衡被打破所致的病理性免疫损伤在重症肺炎的疾病进程中占据着重要作用。既往研究显示,重症肺炎患儿体内存在细胞因子异常,患儿血清中促炎性细胞因子肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α,TNF-α）及白细胞介素（interleukin,IL）-17A水平高于健康对照者,抑炎性细胞因子IL-10的水平存在波动,这些细胞因子水平反映了机体的炎症状态,并与重症肺炎的发病及预后密切相关。调节性B细胞（regulatory B cell,Breg）是一类新发现的具有负向调节作用的B淋巴细胞亚群,可通过分泌抑制性细胞因子或直接的细胞接触介导免疫耐受、抑制过度炎症反应,在多种疾病中参与免疫调控。Breg可通过分泌IL-10或上调调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）表达的方式调控机体TNF-α、IL-17A的水平,但儿童重症肺炎中TNF-α、IL-17A及IL-10水平的变化是否与Breg相关,儿童重症肺炎中Breg如何表达,目前尚不明确。因此分析Breg及其相关细胞因子在重症肺炎患儿中的表达水平,对进一步探究儿童重症肺炎的免疫机制具有重要意义。目的测定重症肺炎患儿外周血中Breg占B淋巴细胞的比例及相关细胞因子IL-10、TNF-α、IL-17A的水平,并与普通肺炎患儿及健康对照儿童相比,探究Breg在不同严重程度的肺炎患儿体内的表达差异及与IL-10、TNF-α、IL-17A细胞因子的相关性,探讨Breg和其介导的免疫反应在儿童重症肺炎中的作用。方法本研究纳入30例重症肺炎患儿、30例普通肺炎患儿和20例健康对照儿童,肺炎患儿于入院时行小儿危重病例评分（pediatric critical illness score,PCIS）,并于24小时内收集外周静脉血2mL,应用流式细胞仪检测CD19+CD24hiCD38hi B细胞占B淋巴细胞的比例及IL-10、TNF-α、IL-17A的表达水平。利用SPSS 23.0软件行统计学分析,比较3组之间的Breg比例及IL-10、TNF-α、IL-17A水平差异,分析重症肺炎及普通肺炎患儿体内Breg比例与患儿住院天数、PCIS评分、IL-10、TNF-α、IL-17A的相关性,再根据是否接受机械通气、28天治疗结局分组,分别比较不同组别重症肺炎患儿住院时间、PCIS评分、Breg比例、IL-10、TNF-α、IL-17A水平。通过计算曲线下面积（area under the curve,AUC 值）、灵敏度和特异度来评价Breg比例及PCIS评分对肺炎严重程度评估的准确性。结果（1）重症肺炎患儿、普通肺炎患儿及健康对照儿童之间的Breg比例、IL-10、TNF-α、IL-17A水平有差异（P＜0.05）。与普通肺炎患儿及健康对照儿童相比,重症肺炎患儿Breg 比例降低,IL-10、TNF-α、IL-17A含量升高（均P＜0.05）。与健康对照儿童相比,普通肺炎患儿外周血Breg 比例、IL-10、TNF-α、IL-17A含量均升高（均P＜0.05）。（2）重症肺炎患儿入院时患儿PCIS评分较普通肺炎患儿降低（P＜0.05）,;重症肺炎患儿较普通肺炎患儿的住院时间延长（P＜0.05）。（3）重症肺炎患儿Breg 比例与患儿住院时间、TNF-α、IL-17A水平呈负相关（r=-0.370,r=-0.548,r=-0.490,均P＜0.05）,与 PCIS 评分正相关（r=0.438,P＜0.05）。重症肺炎患儿外周血的Breg比例与IL-10水平无明显相关（P＞0.05）。普通肺炎患儿的Breg 比例与患儿PCIS评分、IL-10水平呈正相关（r=0.411,r=0.468,P＜0.05）,与 TNF-α、IL-17A 水平呈负相关（r=-0.316,r=-0.551,均P＜0.05）。普通肺炎患儿外周血的Breg 比例与患儿住院天数无明显相关（P＞0.05）。（4）机械通气组患儿住院时间、TNF-α、IL-17A水平较非机械通气组患儿增加（均P＜0.05）,PCIS评分、Breg比例较非机械通气组患儿降低（均P＜0.05）,而两组之间IL-10水平的差异无统计学意义（P＞0.05）。（5）在30例重症肺炎患儿中,有2例28天内死亡病例,此两例患儿体内的Breg 比例、IL-10水平较其他患儿降低,TNF-α、IL-17A水平较其他患儿高,但差异无统计学意义（均P＞0.05）。（6）经ROC曲线分析,患儿入院24h内的Breg比例用于预测肺炎严重程度的准确度为0.8539（95%置信区间:0.758-0.950）,Breg 比例＜7.8%用于诊断重症肺炎的灵敏度为0

关键词： 再生障碍性贫血(AA)   调节性B细胞(Breg)   白介素10(IL-10)   转化生长因子β(TGF-β)   白介素9(IL-9)   白介素9受体(IL-9R)   发病机制  

摘要： 背景再生障碍性贫血(再障aplastic anemia,AA)是由多种原因引起的一种骨髓衰竭综合征。骨髓血细胞生成减少导致粒细胞、网织红细胞、单核细胞以及血小板均减少,临床表现为不同程度的贫血、出血和感染。目前公认,AA是T细胞介导的自身免疫性疾病。AA患者体内存在辅助性T细胞0(helper T lymphocyte 0,Th0)向辅助性T细胞1(helper T lymphocyte 1,Th1)极化和辅助性T细胞2(helper T lymphocyte 2,Th2)相对减少的免疫异常现象,导致Th1/Th2细胞比例失衡并向Th1细胞偏移,进而出现细胞免疫亢进、自身免疫被打破。这一变化可能与异常激活的T细胞分泌的细胞因子如白介素12(interleukin 12,IL-12)、干扰素γ(interferon-γ,IFN-y)等抑制骨髓造血干细胞的增殖分化有关。Th1细胞以分泌IFN-γ为特征,介导细胞免疫;Th2细胞以分泌IL-4为代表,参与体液免疫。本实验通过观察IFN-γ、IL-4的蛋白表达情况来间接观察AA患者体内Th1、Th2细胞的免疫状态。B细胞来源于造血干细胞,在骨髓成熟、次级淋巴器官激活,合成并分泌抗体,介导体液免疫。活化的B细胞表达多种细胞因子受体(cytokine receptor,CKR)、分泌多种细胞因子、参与抗原呈递、活化T细胞共同参与疾病免疫调节导致免疫紊乱。B细胞根据功能可分为效应性B细胞和调节性B细胞(regulatory B cells,Breg)。Breg细胞是类似于调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的具有免疫抑制功能的一组特殊B细胞亚群。Breg细胞主要通过分泌细胞因子IL-10、转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)发挥免疫调节作用,影响其他免疫细胞,抑制过强的免疫应答,维持免疫耐受。Breg细胞中IL-10的表达与STAT家族磷酸化改变有关,在系统性硬化病中Breg细胞的缺乏与STAT3受损密切相关,进一步证明了Breg细胞分泌IL-10依赖STAT3的磷酸化。IL-10是一具有多种生物活性的免疫抑制因子,具有抑制CD4+T细胞增殖分化及分泌IFN-γ、抑制Th1和Th2细胞向两极分化、诱导T细胞分化为Treg细胞及分泌IL-10的免疫调节功能。TGF-β通过抑制骨髓造血细胞、抑制T细胞和B细胞的增殖、抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的分化、抑制IFN-γ等炎性细胞因子的产生、诱导Treg细胞的分化及分泌细胞因子发挥免疫调节作用。另一方面Breg细胞可通过细胞间作用影响Treg细胞数量及功能而发挥免疫调节作用。在多种免疫系统疾病中Breg细胞的数量和功能均有不同程度减低,如强制性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)、慢性移植抗宿主病(chronic graft-versus-host disease,cGVHD)等。同为自身免疫性疾病的AA,Breg细胞在其发生发展中的作用及免疫调节机制如何?Breg细胞在AA患者体内发生怎样的变化及与其他免疫细胞的关系如何?为研究Breg细胞在AA发生发展中的作用,本研究首先分析了 AA患者骨髓及外周血中IL-10+CD19+Breg细胞亚群、TGF-β+CD19+Breg细胞亚群的变化;通过检测IL-10、TGF-β基因及蛋白水平表达情况,分析Breg细胞在AA患者体内的功能状态;通过分析与外周血反映骨髓增生程度相关临床指标(中性粒细胞计数、网织红细胞计数、血小板计数)的相关性,进而评估Breg细胞与AA疾病病情严重度程度及治疗预后转归的关联性。探讨Breg细胞在AA发病机制中的作用及临床意义,为AA的免疫治疗提供新的观点及方向。IL-9是一种单链糖蛋白,分子量为14kDa,是γ家族受体成员之一,主要由T细胞分泌,如Th2、Th9、Th17、Treg细胞等。IL-9与效应细胞上的白介素9受体(interleukin 9 receptor,IL-9R)结合后发挥免疫调节作用,与TGF-β协同诱导幼稚CD4+T细胞分化成Th17细胞,可增强Foxp3+Treg细胞的逆转录抑制功能。当IL-9与IL-9R结合时可通过激活JAK中的JAK1、JAK3相互磷酸化,促使STAT磷酸化,特别是STAT3磷酸化,之后它们移至细胞核以激活IL-9诱导的基因的表达,从而发挥影响细胞的增殖与凋亡作用。多项研究提示IL-9对免疫系统具有双向调节作用,不同情况下对各种疾病的抑制或促进作用各异。在实验性自身免疫性

关键词： 原发性肾病综合征   调节性T细胞   稳定性   可塑性   耗竭   牛奶蛋白过敏   肠道菌群   无菌鼠   调节性T细胞   免疫耐受和免疫稳态   B细胞   早期活化   DOCK8  

摘要： 目的:原发性肾病综合征（Primary Nephrotic Syndrome,PNS）是儿童常见的原发肾小球疾病,也是引起我国儿童终末期肾病的重要疾病之一。由于其病因的复杂性及异质性,目前对于该病发病机制的认识仍十分有限。近年来的相关研究结果提示免疫功能紊乱及免疫炎症是PNS发病的重要机制,多种固有及适应性免疫应答异常可能参与PNS的发生发展,其中T细胞相关免疫应答失调的作用近年来越来越受到关注,被认为是介导PNS发生发展的核心环节之一。调节性T细胞（Regulatory T cell,Treg）是CD4+T细胞的亚群之一,以转录因子Foxp3表达为标志,具有强大的免疫抑制能力,在机体外周免疫耐受及免疫稳态的建立与维持中发挥核心作用。前期研究显示,PNS患儿急性期外周血中Treg水平下调,提示Treg应答异常参与PNS发生发展。同时既往的研究显示,在多种自身免疫、免疫紊乱及相关炎症条件下,存在Treg细胞谱系稳定性,可塑性及功能异常。但是,目前在肾病综合征、免疫相关肾病及相关动物模型中尚缺乏相关研究报道。故本研究目的主要为明确PNS条件下,Treg细胞是否存在谱系稳定性,可塑性及功能异常,并分析导致以上异常的潜在分子机制。以期加深对于PNS免疫发病机制的认识,同时为临床干预寻找新的靶标。方法:收集重庆医科大学附属儿童医院肾脏内科收治的初诊PNS患儿急性期外周血标本（PNS组）,同时在本院体检中心收集年龄性别相匹配的健康儿童外周血标本作为对照（HC组）:通过流式细胞术,分析Treg细胞相关免疫表型;通过分离纯化外周血Treg细胞、体外刺激其活化及增殖,分析Treg细胞稳定性及可塑性;通过分离纯化外周血Treg细胞及Tresponder细胞,体外共培养,分析Treg细胞的免疫抑制能力;通过分离纯化外周血Treg细胞,基因表达谱及生物信息学分析,磷酸化流式等检测,解析导致PNS条件下Treg异常的潜在信号通路及分子机制;通过分离纯化外周血Treg细胞,特异性抑制剂干预及体外功能、稳定性、可塑性实验,进一步明确相关分子机制在PNS-Treg细胞稳定性,可塑性及功能异常中的关键作用。结果:（1）PNS患儿外周血中Treg细胞谱系核心转录因子Foxp3表达稳定性显著受损,表现为PNS组中CD25+Foxp3-细胞比例显著升高,Treg细胞中Foxp3表达水平显著下降,同时体外稳定性实验提示,PNS-Treg细胞增殖过程中存在Foxp3表达的显著丢失;（2）PNS患儿外周血中Treg细胞表现出显著的可塑性异常,表现为表达IFN-γ、T-bet、及CXCR3的Th1样Treg细胞水平显著升高,同时体外可塑性实验提示,PNS-Treg细胞增殖过程中,伴随Foxp3表达的下调,Treg细胞显著向分泌IFN-γ的Th1样Treg细胞转化,甚至完全转分化为Th1细胞;（3）PNS患儿外周血中Treg细胞存在显著的功能失调,表现为对Tresponder细胞体外增殖的抑制能力显著减弱;（4）Treg细胞的以上异常应答,与过度活化诱导的耗竭状态紧密相关,表现为与Treg及conventional T细胞活化及耗竭相关的分子标志显著上调,同时基因表达谱及生信分析也显示大量活化及耗竭相关的基因集在PNS-Treg细胞中显著富集;（5）介导T细胞活化的TCR信号,及其下游的PI3K-AKT、MAPK信号通路在体外活化后的PNS-Treg细胞中显著富集,提示以上信号通路的异常活化,参与PNS中过度活化诱导的Treg耗竭。（6）作为PI3K-AKT、MAPK信号通路下游的共同调控靶点,m TORC1的活化水平在体外活化后的PNS-Treg细胞中显著上调。（7）m TORC1诱导的下游转录因子,c-Myc及SREBPs的蛋白表达水平在体外活化后的PNS-Treg细胞中显著上调,且受以上转录因子调控的靶基因集亦在体外活化后的PNS-Treg细胞中显著富集,提示m TORC1-c-Myc/SREBPs可能是介导PNS条件下过度活化诱导的Treg耗竭及相关免疫应答异常的关键下游环节;（8）特异性抑制剂干预m TORC1、c-Myc、及SREBPs可显著恢复PNS-Treg细胞的体外抑制能力,下调活化诱导的耗竭标志PD-1的表达。显著改善PNS-Treg细胞体外增殖中的Foxp3稳定性异常,并抑制其IFN-γ的分泌,即减弱PNS-Treg的可塑性异常;（9）基因表达谱及生物信息学分析提示,多种生物合成以及生物能量产生相关的代谢通路在体外活化后的PNS-Treg细胞中显著富集,提示这些异常活跃的代谢程序在活化诱导的PNS-Treg耗竭过程中可能发挥关键作用。结论:以上研究结果提示,PNS病理条件下,外周血Treg细胞表现出明显的功能、稳定性及可塑性异常。PNS-Treg细胞以上

关键词： 调节性B细胞   IL-10   胸腺瘤   免疫抑制  

摘要： 背景:胸腺瘤是最为常见的发生于前纵隔的一类胸腺上皮性肿瘤,其发病率约占所有胸腺肿瘤的90%,占全身所有恶性肿瘤的0.2%-1.5%。据统计,胸腺瘤在亚洲人的发病率相对较其他人群高,发病高峰年龄为40-50岁。胸腺瘤组织病理学及生物学行为体现出多样性,故在分类上存在多种标准及方式。WHO对胸腺瘤进行分类时,依据上皮细胞的形态和上皮细胞与淋巴细胞的比例将其划分为A型、AB型、B1型、B2型和B3型五种亚型,不同类型的胸腺瘤具有不同的生物学特征。调节性B细胞（regulatory B cells,Bregs）作为B淋巴细胞的一个亚群,最早在小鼠模型中被证实具有负向免疫调节作用。越来越多的证据表明,调节性B细胞参与抑制抗肿瘤免疫反应,从而促进肿瘤发生和发展,如胃癌、肺癌、肝癌、甲状腺癌、食管癌和乳腺癌等。然而,调节性B细胞是否参与胸腺瘤患者发病及相关机制尚不清楚。目的:调节性B细胞是B淋巴细胞的一个亚群,分泌白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）,在抑制性免疫应答中具有重要作用,但其在胸腺瘤疾病中的作用机制尚不清楚。本项研究旨在评估胸腺瘤患者外周血Bregs细胞亚群的表达水平,并与临床指标进行相关性分析,以进一步探讨它们在胸腺瘤免疫应答中的作用。方法:使用流式细胞术检测23名胸腺瘤患者和15名胸腺囊肿患者（对照组）外周血中Bregs细胞亚群的百分比。受试者的血清IL-10水平通过微量样本多指标流式蛋白定量技术（CBA）测定。采用统计学方法分析上述细胞及因子在两组之间的差异性及其与临床指标的关系。结果:1.与对照组相比,胸腺瘤患者外周血中循环IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率与血清IL-10的水平显著升高,并与KPS临床评分呈负相关。IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率随着胸腺瘤Masaoka分期等级的升高而显著增加,血清IL-10的水平也体现出了升高的趋势,并且在早期分期中IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率和血清IL-10的水平即出现显著升高。此外,IL-10+Bregs和IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率与血清IL-10的水平均呈正相关,IL-10+Bregs与IL-10+CD24hiCD38hiBregs呈正相关。2.在对胸腺瘤不同亚型的分析中,我们发现B型胸腺瘤中循环IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率与血清IL-10的水平显著升高,且IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率与KPS临床评分呈负相关,与血清IL-10的水平呈正相关。3.手术治疗后,患者外周血中循环IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率和血清中IL-10的水平明显降低。其中B型胸腺瘤中IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率和血清中IL-10的水平与其它类型的胸腺瘤相比,在治疗后降低的更加显著。结论:本研究表明胸腺瘤患者外周血中CD24hiCD38hiBreg细胞中IL-10的表达增加,尤其在B型胸腺瘤中表现的更加显著,提示Breg细胞可能参与胸腺瘤的致病过程。此外,Breg细胞还可以作为疾病诊断的生物标志物和潜在的治疗靶点。

关键词： 五羟色胺   溃疡性结肠炎   调节性B细胞   五羟色胺受体7   IL-10  

摘要： 研究背景与目的:溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)目前病因及发病机制未明,研究认为胃肠神经内分泌肽/胺与免疫细胞相互作用是其重要的致病机制之一。调节性B细胞(Regulatory B cells,Bregs)在维持肠道免疫稳态中发挥重要作用。此前我们的研究已经发现Bregs在溃疡性结肠炎中数量减少。肠道嗜铬细胞(Enterochromaffin cells,ECs)产生的五羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)通过免疫调控影响UC进程,但其免疫调节作用尤其对Bregs的影响尚不明确。因此,本研究以人和鼠的Bregs为研究靶点,利用UC小鼠模型、患者样本从细胞、分子和整体不同水平探究UC中5-HT通过其受体下游通路调控Bregs及UC进展的分子机制,为UC治疗提供新的理论基础。研究方法:(1)流式分析检测UC患者和健康人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中CD19CD24CD38B细胞比例,并与UC疾病活动度评分及相关临床指标做相关性分析。(2)流式分选去除UC患者和健康人外周血PBMCs中的CD19CD24CD38B细胞,并用CFSE染色,体外培养5天,流式检测UC患者和健康人外周血CD19CD24CD38B细胞抑制功能差异。(3)分离UC患者和健康人外周血血清,ELISA检测血清中5-HT和白细胞介素(Interleukin)-10水平,并与UC患者外周血CD19CD24CD38B细胞、疾病活动度评分及相关临床指标做相关性分析。(4)流式分析检测UC患者外周血PBMCs中B细胞不同亚群上5-HT受体的表达。(5)磁珠分选健康人外周血PBMCs中B细胞,使用5-HT体外刺激B细胞,培养2天,计数并用流式检测CD19CD24CD38B细胞以及CD19CD24CD38IL-10B细胞比例。同时检测5-HT处理B细胞后p-STAT3以及p-ERK1/2在CD19CD24CD38B细胞上表达情况。在使用5-HT受体7(5-HTreceptor,5-HTR)拮抗剂以及STAT3抑制剂体外处理B细胞,培养2天,计数并用流式检测CD19CD24CD38B细胞以及CD19CD24CD38IL-10B细胞比例,q RT-PCR检测B细胞中IL-10表达。(6)3.5%葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium,DSS)喂养野生型小鼠7天得到肠炎小鼠模型。磁珠分选C57BL/6野生型小鼠脾脏B细胞并在体外用5-HT刺激培养2天,在造模前3天和1天将5-HT处理与不处理的B细胞转输给野生型小鼠。从造模之日起每天记录小鼠体重,对粪便硬度,粪便潜血水平进行评分,评估肠炎小鼠疾病活动指数(Disease activity index,DAI)。第8天处死小鼠,测量结直肠长度。取小鼠结直肠组织做HE染色,明确小鼠粘膜损伤以及炎性浸润程度。取小鼠结肠组织做免疫荧光染色,明确肠组织中IL-10表达情况。流式检测小鼠外周血PBMCs、肠系膜淋巴结(Mesenteric lymph node,MLN)、脾脏以及肠组织中黏膜固有层单个核细胞(Lamina propria mononuclear cells,LPMCs)中B220IL-10B细胞比例。研究结果:(1)UC患者外周血PBMCs中CD19CD24CD38B细胞比例降低,CD19CD24CD38B细胞比例与UC疾病活动度评分及相关临床指标负相关。(2)健康人外周血PBMCs去除CD19CD24CD38B细胞后CD4T细胞增殖受抑制率低于UC患者,UC患者外周血PBMCs中CD19CD24CD38B细胞抑制功能受损。(3)UC患者外周血血清中5-HT和IL-10水平降低,并与与外周血PBMCs中CD19CD24CD38B细胞,疾病活动度评分及相关临床指标正相关,并且血清5-HT与IL-10水平正相关。(4)UC患者外周血PBMCs中CD19CD24CD38B细胞上5-HTR表达高于健康人,5-HTR、5-HTR、5-HTR和5-HTR表达无差异。5-HTR在UC患者和健康人CD19CD24CD38B细胞和CD19CD24CD38B细胞上表达无差异。(5)5-HT促进健康人外周血B细胞CD19CD24CD38IL-10B细胞数量及比例增加,但是对CD19CD24CD38B细胞数量和比例无影响,同时使B细胞IL-10表达增加。5-HTR拮抗剂以及STAT3抑制剂能逆转5-HT促进Bregs产生IL-10。(6)转输5-HT处理的B细胞能缓解DSS诱导的小鼠肠道炎症,小鼠便血缓解,体重降低减慢,结肠长度较长,HE染色提示肠道炎症浸润程度较轻,。同时转输5-HT处理的B细胞能诱导外周血PBMC

关键词： Abp1   调节性T细胞   抑制功能   PGRN   BCR信号   B细胞发育  

摘要： 第一部分Abp1在调节性T细胞的发育及功能中的影响目的:探讨肌动蛋白连接蛋白1（Actin-binding protein 1,Abp1）对调节性T细胞（Treg）发育及功能的影响。方法:通过流式细胞术检测野生型小鼠（WT组）和Abp1基因敲除小鼠（KO组）的胸腺、脾脏、浅表淋巴结及肠系膜淋巴结中T淋巴细胞及Treg细胞的比例、数量以及相关功能性分子的表达,并利用体外抑制试验检测Abp1缺失对Treg抑制功能的影响。结果:Abp1 KO小鼠的胸腺、脾脏、浅表淋巴结及肠系膜淋巴结中的Treg的比例和细胞数目与WT小鼠相比没有明显的变化,同时缺失Abp1的Treg细胞的主要功能性分子ICOS、CTLA4、PD-1和NRP-1的表达亦没有显著的差异,进一步实验发现缺失Abp1的Treg细胞对初始T细胞向活化T细胞分化的抑制作用较WT相比无明显变化。结论:Abp1对Treg细胞的发育和功能没有显著影响。第二部分PGRN对B细胞发育及BCR信号的影响目的:探索PGRN如何调节BCR信号和外周B细胞分化的潜在分子机制。方法:通过流式细胞术检测野生型小鼠（WT组）和PGRN基因敲除小鼠（KO组）的骨髓B细胞和外周B细胞各亚群比例。使用激光共聚焦显微镜分别检测p Y、p CD19、p BTK和p SHIP与BCR之间的共定位。采用免疫印迹技术检测BCR近端、远端及负信号分子变化。结果:PGRN KO小鼠的骨髓B细胞与WT小鼠相比没有明显变化。而KO小鼠的外周B细胞亚群MZ B细胞比例升高,GC B细胞的比例则有所下降。KO小鼠的脾脏中的p Y、p CD19、p BTK和p SHIP与BCR之间的共定位均高于WT小鼠。同时KO小鼠的BCR上游信号分子CD19,CD19的下游信号分子BTK、PI3K、中间和远端的信号分子FOXO-1、Akt、S6以及负BCR信号分子SHIP的磷酸化水平较WT均有所升高。结论:PGRN对B细胞早期发育影响不明显,但对外周B细胞的分化起重要作用。PGRN的缺乏可能增强记忆性免疫应答,同时增强了B细胞的活化及BCR的激活。