关键词： 生长阻滞和DNA损伤基因45(Gadd45)   激活转录因子3(ATF3)   荧光素酶报告质粒   启动子活性  

摘要： 目的 :构建大鼠生长阻滞及DNA损伤诱导基因45(growth arrest and DNA-damage-inducible gene 45,Gadd45)β/γ启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察在大鼠肾小球系膜细胞(glomerular messangial cells,GMCs)中过表达激活转录因子3(activating transcription factor 3,ATF3)后分别对大鼠Gadd45β/γ基因启动活性的影响。同时筛选其可能的ATF3结合位点。方法:采用PCR技术,将扩增出的大鼠Gadd45β基因启动子全长(-1 105^+236 nt)和Gadd45γ基因启动子全长(-913^+72nt)分别插入到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,获得Gadd45β/γ基因启动子全长荧光素酶报告质粒(p GL3-Gadd45β/γ-FL),再将p GL3-Gadd45β/γ-FL分别与课题组前期构建的大鼠野生型ATF3过表达质粒(p IRES2/ATF3)共转染GMCs,检测其荧光素酶活性,以确定ATF3对Gadd45β/γ基因的启动作用。另用生物信息学软件预测Gadd45β/γ基因启动子上ATF3潜在的结合位点,并据此构建4个Gadd45β和3个Gadd45γ基因启动子截短片段的荧光素酶报告质粒。将Gadd45β/γ基因启动子全长和各截短片段的荧光素酶报告质粒与p IRES2/ATF3共转染GMCs,再行荧光素酶活性测定,以筛选ATF3的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,大鼠Gadd45β/γ基因启动子(全长和截短)的荧光素酶报告质粒均构建成功。将p GL3-Gadd45β/γ-FL分别和p IRES2/ATF3共转染GMCs发现,Gadd45β/γ基因启动子活性均显著增加。而将Gadd45β启动子全长及4个截短质粒分别与p IRES2/ATF3共转染GMCs后显示,p GL3-Gadd45β-4的启动活性显著低于p GL3-Gadd45β-FL、p GL3-Gadd45β-1、p GL3-Gadd45β-2和p GL3-Gadd45β-3。提示ATF3可能结合在Gadd45β基因启动子的(-146^+23 nt)区域。同样,将Gadd45γ启动子全长及3个截短质粒分别与p IRES2/ATF3共转染GMCs后显示,p GL3-Gadd45γ-2、p GL3-Gadd45γ-3的启动活性显著低于p GL3-Gadd45γ-FL和p GL3-Gadd45γ-1。提示ATF3可能结合在Gadd45γ基因启动子的(-456^-61 nt)区域,且这段区域可能包含1个以上ATF3结合位点。结论:成功构建了大鼠Gadd45β/γ基因启动子全长及各截短片段荧光素酶报告质粒,并初步确定了ATF3在Gadd45β/γ基因启动子上的结合区域。

关键词： CARDIOVASCULAR disease diagnosis   CARDIOVASCULAR disease treatment   CROSS-talk (Biology)   HEART cells   MACROPHAGES   CARDIAC research  

关键词： akt   ATF3   PTEN   prostate cancer  

摘要： Stress response mediator activating transcription factor 3 (ATF3) engages in diverse oncogenic pathways including the androgen receptor signaling essential for prostatic proliferation. In line with frequent downregulation of ATF3 expression in human prostate cancers, we have provided the first genetic evidence supporting the role of ATF3 as a tumor suppressor in a subset of prostate cancers with PTEN dysfunction.

关键词： 猪血凝性脑脊髓炎病毒   ATF3   MX1   小鼠  

摘要： 猪血凝性脑脊髓炎是由猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus, PHEV)引起仔猪的一种急性、高度接触性传染病,主要侵害1～3周龄哺乳期的仔猪,临床以仔猪呕吐、衰竭和/或明显的神经症状为主要特征,死亡率达20%～100%,给养殖业带来巨大的经济损失。PHEV具有嗜神经性,主要由感染部位经外周神经向中枢神经系统传播,引起大脑呈现非化脓性脑脊髓炎的病理性损伤。MX1蛋白是一种抗病毒蛋白,由Ⅰ型干扰素(IFNα/β)诱导宿主细胞产生的,具有广谱的抗病毒作用。ATF3是激活转录因子家族成员,是转录调控、细胞凋亡、细胞分裂和生存的一个重要调控因子,可以使细胞增殖加速,与病毒的复制密切相关。本实验室前期研究表明,小鼠大脑皮层及神经瘤细胞N2a感染PHEV后,ATF3基因与MX1基因均呈差异表达。但这两种基因差异表达是否与病毒感染有直接的关系,其表达水平与PHEV病毒载量之间是否有相关性尚不明确。因此,本研究旨在通过检测PHEV感染后大脑中ATF3和MX1的表达水平,探索ATF3、MX1表达水平和PHEV病毒载量之间的关系,为阐明抗病毒蛋白和活性转录因子的作用机理奠定一定的理论基础。方法：建立PHEV急性感染小鼠模型,用0.1mL的PHEV(103TCID50/0.1mL)以颅内接种方式感染5周龄的雌性健康昆明小鼠,使小鼠在第5d全部死亡。之后将30只小鼠随机分为病毒组和对照组,每组各15只,病毒组颅内注射0.1mL的PHEV,对照组接种相同剂量的PBS。在感染后第1～5d每天每组分别随机选3只小鼠剖杀,取大脑一部分于液氮中保存,进行荧光定量PCR；另一部分大脑固定于福尔马林溶液中,进行H.E.染色和免疫组织化学试验。结果发现,接毒后第1～2d的小鼠精神状态及饮食无明显异常；接毒后第3d小鼠出现明显的神经症状,如弓背,两前肢呈“弹钢琴样”上下摆动；接毒后第5d小鼠瘫痪,抽搐死亡；对照组小鼠无异常反应。剖检发现接毒组小鼠大脑充血水肿；组织病理学观察发现接毒组小鼠大脑呈典型的非化脓性脑炎变化,如神经元固缩、坏死,小胶质细胞增多,卫星现象及“血管套”形成。Real-time PCR结果显示,接毒组小鼠大脑ATF3和MX1基因表达水平与PHEV病毒载量均升高,且ATF3和MX1基因表达水平与PHEV的病毒载量呈现正相关关系,相关性极显著(p<0.01)。对不同感染时间段小鼠大脑PHEV病毒载量和ATF3基因表达水平进行比较,结果显示,对照组、感染第1～4d小鼠与第5d小鼠之间病毒载量和ATF3基因表达水平均呈现显著差异(p<0.05)。免疫组化结果显示,小鼠感染病毒后大脑ATF3、MX1蛋白及PHEV的胞浆中均有棕黄色阳性信号,且大脑中ATF3蛋白、MX1蛋白表达量和PHEV均增加。

关键词： 热应激   孕酮   大鼠   黄体退化   NR4A1   HSP70   MAPK   ATF3   PKB  

摘要： 热应激影响雌性动物的许多生殖功能,如卵泡发育、卵母细胞成熟和早期胚胎发育。目前,研究表明热应激通过干扰动物的生殖内分泌等发挥作用。同时,热休克反应依赖于细胞信号途径的调控。因此,本论文以假孕大鼠为研究对象,建立热应激模型。应用ELISA、Western blot和IHC等方法,研究孕酮合成及分解代谢相关蛋白及相关信号通路元件的表达模式,以揭示热应激影响卵巢黄体退化的作用机制,为研究热应激影响雌性动物繁殖性能提供理论依据。主要内容如下:1热应激对大鼠黄体孕酮合成及分解代谢相关蛋白表达的影响为探讨热应激对黄体孕酮合成及分解代谢通路相关蛋白表达的影响,本研究采用PMSG/hCG(DO)联合处理70只(28日龄)大鼠诱导假孕,然后随机分为非热应激(NHS)和热应激(HS)两组。每天在相同时间,将HS组置于40℃热应激2h。每天测定大鼠的饮水量、采食量及热应激前后的直肠温度。假孕第3天,热应激结束后2h,采集两组大鼠的血清和卵巢组织(n=5)。假孕第7天,热应激结束后2h,处死或PGF分别处理0h、1h、2h、8h或24h后处死,然后收集血清和卵巢组织(n=5)。应用ELISA检测血清孕酮浓度、Western blot和IHC检测孕酮合成及分解代谢通路相关蛋白的表达。ELISA结果表明,热应激对黄体形成过程中孕酮浓度无显著影响。Westernblot结果表明热应激对黄体形成过程中StAR、P450scc和3βHSD表达无显著影响,但PKA磷酸化底物在第3天表达高于第7天(P<0.05)。PGF降低了两组大鼠血清孕酮浓度,且热应激抑制了 PGF诱导的孕酮浓度下降(P<0.05);PGF或热应激单一处理均对PKA磷酸化底物、StAR、P450scc、3βHSD及NR4A1-F表达无显著影响,但均诱导NR4A1-S表达上调(P<0.05),且热应激降低PGF诱导的NR4A1-S表达(P<0.05);IHC结果表明,PKA磷酸化底物主要在黄体细胞的细胞核中表达,而StAR、P450scc、3βHSD和NR4A1-F均在黄体细胞的细胞质表达。上述结果提示,热应激降低假孕大鼠PGF诱导的黄体退化过程中NR4A1-S的表达,NR4A1-S可能参与调控黄体退化过程中孕酮的分解代谢。2热应激对大鼠黄体退化中ERK1/2磷酸化及HSP70与ATF3表达的影响为研究热应激对PGF诱导的黄体退化过程中HSP70及MAPK/ATF3和PKB信号通路元件表达的影响,以假孕大鼠为试验对象,构建热应激模型(同试验1)。假孕第7天,热应激结束2h后,大鼠以PGF分别处理0h、1 h、2h、8h或24h后处死,收集卵巢组织。应用Western blot和IHC检测HSP70及MAPK/ATF3和PKB信号通路元件蛋白的表达。Western blot结果表明:与NHS组相比,热应激没有改变HSP70和p-ERK-1/2的基础水平,但热应激促进PGF诱导的HSP70和p-ERK-1/2水平的上升(P<0.05);热应激促进p-p38MAPK基础水平的上调(P<0.05);在PGF处理2h后,ATF3的表达量显著上升,且热应激抑制PGF诱导的ATF3表达(P<0.05)。对于PKB通路,在PGF处理8 h和24 h后,p-Akt(Thr308/Ser473)的表达量显著降低(P<0.05),但热应激对其没有显著影响。这些结果提示,在PGF诱导的假孕大鼠黄体退化过程中,热应激促进HSP70和p-ERK-1/2表达,抑制ATF3的表达,这可能有助于减少PGF诱导孕酮的下降,维持黄体功能。

关键词： 急性肺损伤   脂多糖   活化转录因子3   TL1A   RNA干扰   基因芯片  

摘要： 1.背景和目的急性肺损伤(acute lung injury,ALI),急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是因为各种肺内、外因素所致的以肺泡毛细血管膜弥漫性损伤、严重低氧血症为特征的呼吸危重症,因外其发病机制尚不完全清楚,所以仍有较高的病死率。其中,炎症反应失衡在疾病的发生发展中占有重要地位。由革兰阴性杆菌感染引起的脓毒血症是导致ALI/ARDS的重要病因,而脂多糖(Lipopolysaccharide LPS)作为革兰阴性杆菌的胞壁成分是先天性免疫反应及炎症反应的启动子,是导致ALI/ARDS的重要原因之一。因此,明确LPS导致炎症损伤的发病机制对急性肺损伤的治疗有重要意义。目前已证实,转录活化因子3(activating transcription factor 3,ATF3)是一应激早期快反应基因,其表达与炎症反应、机体稳态维持、肿瘤发生等密切相关。在多种炎症模型中,ATF3对炎症反应起刹车作用。然而,ATF3在LPS致急性肺损伤中的作用尚不完全清楚。鉴于此,本课题拟通过比较腹腔注射LPS后的野生型小鼠和ATF3敲基因小鼠的各项炎症指标,明确ATF3在LPS致急性肺损伤小鼠模型中的作用;将两组小鼠肺组织通过基因芯片技术寻找其差异基因;并最后通过构建干扰质粒下调ATF3在小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞中的表达,探讨ATF3调控LPS导致炎症反应的可能机制,从而为急性肺损伤的防治提供潜在的新靶点。2.研究方法(1)构建急性肺损伤动物模型,并明确ATF3在动物模型中的表达规律向小鼠进行腹腔注射LPS,注射量为15mg/kg,从而建立急性肺损伤小鼠的动物模型,分别采取RT-PCR以及Western blot的方法,检测ATF3在LPS刺激后的各个时相点,小鼠肺组织中的表达情况,从而明确其表达规律。(2)观察ATF3对LPS诱导的急性肺损伤小鼠的保护作用构建ATF3敲基因小鼠,用Western blot的方法鉴定敲基因小鼠中ATF3的表达缺失,通过比较野生型小鼠和ATF3敲基因小鼠的肺组织病理切片、肺组织湿干比、肺组织中炎症因子的表达水平、肺泡灌洗液蛋白浓度以及7天存活率来评估ATF3对LPS诱导的急性肺损伤小鼠的保护作用。(3)利用基因芯片技术筛选急性肺损伤小鼠中与atf3相关的差异基因同时用lps对c57小鼠及atf3敲基因小鼠进行腹腔注射后2小时,然后提取两组小鼠肺组织的总rna,通过基因芯片技术筛选差异表达基因。再结合文献阅读,最终重点关注tl1a分子,并提出atf3可能是通过下调tl1a的表达实现对急性肺损伤的炎症保护作用这一假说。(4)以小鼠单核巨噬细胞株raw264.7细胞为模型探讨atf3在lps诱导的急性肺损伤中的可能机制用rt-pcr和westernblot的方法比较raw264.7细胞中,atf3在lps刺激后各个时间点的表达变化。构建质粒,用rna干扰的方法下调atf3在raw264.7细胞中的表达,观察atf3对lps诱导的细胞炎症损伤以及信号分子通路tl1a表达的影响;采用sirna双干扰技术同时下调atf3和tl1a在raw264.7细胞中的表达后,通过检测炎症因子il-6的表达变化说明tl1a信号通过在atf3调控lps诱导的急性肺损伤中的作用。3.结果(1)atf3表达于正常小鼠肺组织,lps腹腔注射后,小鼠肺组织内atf3的表达水平明显增加(p<0.05),以lps腹腔注射2h时相点达表达高峰,rt-pcr与westernblot的结果趋势一致。(2)将野生型小鼠与atf3敲基因小鼠作为对比,lps腹腔注射以后,atf3敲基因小鼠的肺组织病理损伤加重,肺组织湿干比增加,炎症因子il-6、il-1β、tnf-α表达增加,肺泡灌洗液蛋白浓度增加,小鼠7天存活率显著下降(p<0.05)。(3)从基因芯片的结果中找到了atf3敲基因小鼠和野生型小鼠的差异基因tl1a,结合阅读文献,提出了atf3可能通过下调tl1a表达,对lps诱导的急性肺损伤炎症起到调控作用的科学假说。(4)lps刺激后,atf3在raw264.7细胞中的表达上调,表达高峰点在lps处理6h后,下调atf3的表达会增加lps诱导的炎症因子tnf-α和il-6的释放;与lps和ncsirna+lps组相比,atf3sirna组和atf3sirna+lps组raw264.7细胞中tl1a的表达显著增加(p<0.05),为进一步证实tl1a信号通路在atf3调控lps诱导的急性肺损伤中的作用,我们同时下调了atf3和tl1a在raw264.7细胞中的表达,与atf3sirna+lps组相比,atf3sirna+tl1asirna组raw264.7细胞中il-6的表达

关键词： ATF3   dPRL   FOXO1   miR-135b   蜕膜化   人子宫内膜间质细胞  

摘要： 目的探究转录因子ATF3参与调控8-Br-cAMP联合MPA诱导人子宫内膜间质细胞蜕膜化泌乳素分泌的分子机制。方法通过免疫组化方法明确ATF3在子宫内膜中表达及定位。采用Western blotting实验调查胚胎反复种植失败女性与胚胎一次移植成功女性分泌期子宫内膜ATF3的表达情况。利用Western blotting、Q-PCR对应检测8-Br-cAMP联合MPA诱导子宫内膜间质细胞体外蜕膜化后ATF3与miR-135b表达变化。以Q-PCR、ELFA方法调查AIF3和miR-135b对间质细胞蜕膜化泌乳素(decidual prolactin,dPRL)表达、分泌的调控作用;细胞免疫荧光实验分析二者对间质细胞形态的影响。采用染色质免疫共沉淀、Q-PCR实验探究ATF3对miR-135b的调控作用。运用 Westernblotting、Q-PCR 实验验证 ATF3 及 miR-135b 对 FOXO1蛋白及mRNA的调控作用。结果ATF3表达于人子宫内膜间质细胞及上皮细胞。胚胎反复种植失败患者(n=31)分泌期子宫内膜组织中ATF3表达较胚胎一次移植成功女性(n=29)显著降低(P<0.001)。8-Br-cAMP联合MPA诱导间质细胞ATF3 mRNA早期表达增多,于lh升高5倍;ATF3蛋白表达也相应增高,于16 h增加4倍以上。无外源激素存在时,腺病毒介导ATF3的过表达以浓度依赖方式显著增加人子宫内膜间质细胞蜕膜化标志分子dPRL的表达与分泌(P<0.01),同时促进间质细胞骨架蜕膜化样改变;功能缺失实验进一步验证沉默内源性ATF3表达可抑制8-Br-cAMP联合MPA诱导下蜕膜化间质细胞分泌的dPRL至60%(P<0.01),并使细胞呈去蜕膜样变。miR-135b在间质细胞蜕膜化过程中表达显著降低,16 h减少至30%(P<0.001)。MiR-135b与FOXO1 3'UTR区种子序列结合,过表达miR-135b使hESCs中FOXO1蛋白表达减少至30%,并显著抑制蜕膜化间质细胞dPRL分泌(P<0.01)。ATF3结合miR-135b启动子区,抑制miR-135b转录(P<0.001),上调FOXO1蛋白表达,修复miR-135b导致的蜕膜细胞dPRL分泌减少,促进细胞蜕膜化进程。结论人子宫内膜间质细胞体外蜕膜化过程中,ATF3表达明显升高而miR-135b表达显著降低。miR-135b下调FOXO1表达,过表达ATF3转录抑制miR-135b,促进FOXO1表达,参与调控8-Br-cAMP联合MPA诱导人子宫内膜间质细胞体外蜕膜化过程中dPRL的表达。ATF3调控子宫内膜蜕膜化过程机制的研究,有望为提高胚胎种植率和妊娠成功率提供新的分子靶点和治疗方向。

关键词： 重组高密度脂蛋白   炎症反应   脂多糖   RAW264.7   细胞   ATF3  

摘要： 背景:ATF3在抑制炎症信号中通过抑制TLR的产生而发挥重要作用,高密度脂蛋白(HDL)或其主要蛋白成份Apo A-I具有显著的抗炎症作用。本研究探讨载脂蛋白A-I(Apo A-I)及其半胱氨酸突变体重组高密度脂蛋白对ATF3表达量的影响。方法:(1)利用pET原核表达系统表达载脂蛋白A-I74,A-I228,A-Im和A-IWT,亲和层析纯化后,加入DPPC,制作成重组高密度脂蛋白。(2)培养RAW264.7细胞,LPS刺激诱导炎症细胞模型,然后给于重组高密度脂蛋白干预,ELISA试剂盒检测炎症因子IL-6和TNF-α的表达水平,观察细胞形态学的改变,RT-PCR和western blotting检测细胞中转录激活因子ATF3 m RNA和蛋白表达水平的变化。结果:细胞形态学观察发现,与正常组比较,LPS组与rHDL228组细胞形态趋向于巨噬细胞化并出现降解,rHDL74、rHDLM和rHDLWT对LPS刺激的细胞有不同的保护作用。ELISA检测发现,rHDL74、rHDLm和rHDLwt中TNF-ɑ与IL-6的表达水平恢复到接近空白对照组水平,rHDL 228组TNF-ɑ与IL-6水平较较空白对照组明显升高(p<0.01)。rHDL74、rHDLM和rHDLWT中TNF-ɑ与IL-6水平较LPS组明显降低(P<0.01)。Western blotting结果显示,与对照组相比,LPS组与rHDL 228组ATF3的表达水平下降,具有显著性差异(p<0.01)。rHDL74、rHDLM和rHDLWT组表达水平明显升高且差异显著(p<0.05)。结论:重组高密度脂蛋白rHDL74、rHDLWT、rHDLM促进ATF3在m RNA和蛋白水平上的表达。而rHDL228下调其表达。

关键词： Thy-1肾炎(Thy-1N)   亚溶解型C5b-9(sublytic C5b-9)   肾小球系膜细胞(GMC)   p300   早期生长应答基因1(Egr-1)   活化转录因子3(ATF3)   生长阻滞和DNA损伤诱导基因45(Gadd45)   细胞凋亡   sublytic C5b-9   Thy-1N   GMC   染色质步移(genome walking)   mRNA稳定性   启动子活性   细胞凋亡   sublytic C5b-9   p300   Egr-1   ATF3   乙酰化修饰   启动子活性   细胞凋亡  

摘要： 第一部分 Thy-1N肾组织和sublytic C5b-9刺激GMC上调的p300、Egr-1、ATF3和Gadd45基因表达时相及其与GMC凋亡的相关性目的:检查Thy-1肾炎(Thy-1 nephritis,Thy-1N)大鼠肾组织(体内)和体外亚溶解(sublytic)C5b-9刺激大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)中 p300、早期生长应答基因 1(early growth response gene 1,Egr-1)、活化转录因子 3(activating transcription factor 3,ATF3)及生长阻滞和 DNA 损伤诱导基因 45(growth arrest-and DNA-damage-inducible gene 45,Gadd45)的基因表达情况,并探讨p300、Egr-1、ATF3和Gadd45在sublytic C5b-9诱导GMC凋亡中的作用。方法:复制大鼠Thy-1N模型,同时用sublytic C5b-9刺激体外培养的GMC,收集不同时间点和不同分组的肾组织或GMC,行qPCR和western blot(WB)检查p300、Egr-1、ATF3和Gadd45的表达水平,并分别用电镜和流式细胞术检查肾组织中GMC和体外培养GMC的凋亡情况。然后,构建Egr-1、ATF3和Gadd45 的过表达质粒(pIRES2/Egr-1、pIRES2/ATF3、pIRES2/Gadd45α、pIRES2/Gadd45β 和 pIRES2/Gadd45γ)和发卡状小干扰 RNA(short hairpin RNA,shRNA),即 shEgr-1、shATF3、shGadd45α、shGadd45β 和 shGadd45y 以及 p300的shRNA(shp300),将上述质粒分别转染至大鼠GMC中培养48h,过表达组不予处理,而shRNA组再给予sublytic C5b-9刺激3h,收集细胞用流式细胞术检测细胞凋亡百分比。结果:Thy-1N大鼠肾组织和受sublytic C5b-9刺激的大鼠GMC中,p300、Egr-1、ATF3和Gadd45的表达水平显著上调,其中Egr-1蛋白的高峰时间点在体内和体外分别为2h和1h,而p300、ATF3和Gadd45的高峰时间点在体内和体外均为3h。同时观察到发病大鼠的肾小球中GMC呈明显的凋亡改变,且被sublytic C5b-9刺激的GMC凋亡数量也明显增加。此外,过表达Egr-1、ATF3或Gadd45均能促进GMC凋亡,而沉默p300、Egr-1、ATF3或Gadd45则能显著抑制由sublytic C5b-9诱导的凋亡反应。结论:Thy-1N 大鼠肾组织和 sublytic C5b-9 刺激的 GMC 中,p300、Egr-1、ATF3和Gadd45的表达明显上调,且这些分子对sublytic C5b-9诱导的GMC凋亡有促进作用。第二部分 Sublytic C5b-9诱导GMC上调的Egr-1和ATF3之间的上下游关系及其对Gadd45β/γ基因表达的调控目的:检查由sublytic C5b-9诱导上调的Egr-1和ATF3之间的上下游关系,并探讨Egr-1和ATF3对Gadd45基因表达的调控作用与机制。方法:首先用qPCR和WB检查GMC转染pIRES2/Egr-1或shEgr-1后ATF3基因表达水平的变化,再用同样的方法检查GMC转染pIRES2/ATF3或shATF3后Egr-1基因表达水平的改变。接着,在GMC中共转染pIRES2/Egr-1+shATF3(设 shCTR 对照)或 shEgr-1+pIRES2/ATF3(设 pIRES2 对照),后者再予 sublytic C5b-9刺激3h,用流式细胞术检查GMC的凋亡情况。然后,用染色质步移(genome walking)方法获取大鼠ATF3基因近端启动子序列,并构建其启动子荧光素酶报告质粒pGL3-ATF3,将其分别与pIRES2/Egr-1和shEgr-1共转染至GMC，测定ATF3启动子的荧光素酶活性。此外,为研究Egr-1对ATF3转录后调控的机制,我们将shEgr-1转染至GMC后行sublytic C5b-9和蛋白酶体抑制剂MG132处理,用ATF3或泛素抗体进行免疫沉淀(immunoprecipitation,IP),检测ATF3的泛素化水平;另在shEgr-1转染GMC后行sublytic C5b-9刺激1h,再予放线菌素D(actinomycin D)处理的不同时间点,收集RNA用qPCR测定ATF3 mRNA的稳定性。同时,我们用qPCR和WB检查了 GMC在转染Egr-1和ATF3的过表达质粒或相应shRNA后

关键词： Thy-1肾炎（Thy-1N）   E1A结合蛋白p300（p300）   早期生长应答蛋白-1（Egr-1）   激活转录因子3（ATF3）   生长阻滞及DNA损伤诱导基因45（Gadd45）   Thy-1肾炎（Thy-1N）   慢病毒载体（LV）   E1A结合蛋白p300（p300）   早期生长应答蛋白-1（Egr-1）   激活转录因子3（ATF3）   生长阻滞及DNA损伤诱导基因45（Gadd45）   凋亡   增生  

摘要： 第一部分Thy-1肾炎大鼠肾组织中乙酰基转移酶(p300)、转录因子(Egr-1、ATF3)及凋亡基因(Gadd45α/β/γ)的表达情况目的:检查Thy-1肾炎(Thy-1 nephritis，Thy-1N)大鼠肾组织中E1A结合蛋白p300(E1A binding protein p300,p300)、早期生长应答蛋白-1(early growth response protein-1,Egr-1)、激活转录因子 3(activating transcription factor 3,ATF3)和生长阻滞及DNA损伤诱导基因45(growth arrest and DNA-damage-inducible gene 45,Gadd45)α/β/γ的表达情况,并进一步测定 p300与Egr-1或ATF3的相互作用及Egr-1和ATF3的乙酰化水平。方法:给大鼠尾静脉注射抗胸腺细胞血清(anti-thymocyte serum，ATS)复制Thy-1N模型,在肾炎发病的不同时间点(0h、1h、2h、3h、6h、12h)取大鼠肾皮质,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR，qRCR)和蛋白质印迹(western blot，WB)实验检查Thy-1N大鼠肾组织中p300、Egr-1、ATF3和Gadd45α/β/γ的mRNA和蛋白表达水平。然后,通过免疫共沉淀(immunoprecipitation，IP)和WB检查大鼠Thy-1N发病不同时间点肾组织中p300与Egr1或ATF3的相互作用及Egr1和ATF3的乙酰化水平。结果:Thy-1N大鼠肾组织中,p300、Egr-1、ATF3和Gadd45α/β/γ表达水平均以时间依赖性的方式逐渐升高,且在Thy-1N发病1h和3h时(p300为3h,余下因子为1h)mRNA丰度达到峰值,蛋白水平则在2h和3h时(Egr-1为2h,其余蛋白为3h)达到高峰。此外,实验还发现,Thy-1N大鼠肾组织中p300能够与ATF3发生相互作用,且在3h时作用最为显著,但实验并未测到p300与Egr-1间的相互作用。与此同时,ATF3的乙酰化水平也以时间依赖性的方式升高,并在3h达到高峰,但实验亦未测到Egr-1的乙酰化修饰。结论:在Thy-1N大鼠的肾组织中,p300、Egr-1、ATF3和Gadd45α/β/γ的表达均明显升高,且p300能够与ATF3相互作用并使其发生乙酰化。第二部分沉默肾组织中p300、Egr-1、ATF3和Gadd45β/γ基因后对Thy-1肾炎大鼠GMC凋亡和增生病变的影响目的:研究沉默肾组织中的p300、Egr-l、ATF3和Gadd45β/γ基因后对Thy-1N大鼠GMC凋亡和后续增生病变及尿蛋白分泌的影响。方法:分别包装p300、Egr-l、ATF3和Gadd45β/γ shRNA慢病毒载体,形成LV-shp300、LV-shEgr-1、LV-shATF3 和 LV-shGadd45β/γ,通过侵染细胞实验验证其相应慢病毒滴度,并确定其侵染大鼠GMC的能力。然后,通过大鼠肾动脉灌注术将 LV-shp300、LV-shEgr-1、LV-shATF3 和 LV-shGadd45β/γ 悬液分别导入大鼠两侧肾脏,再经尾静脉注射抗胸腺细胞血清(ATS)复制Thy-1N模型。分别在大鼠注射ATS后2h、3h和7d取大鼠肾组织,并留取7d时的24h尿液。通过蛋白质印迹(WB)检查各组大鼠肾组织中相应p300、Egr-l、ATF3和Gadd45β/γ的蛋白表达水平以验证其干扰效果。在确定了相关蛋白能被成功干扰后再用WB检查沉默肾内p300、Egr-1和ATF3后,其肾组织中凋亡相关蛋白Gadd45β/γ的表达情况。另采用免疫共沉淀(IP)和WB实验测定沉默肾内p300后对Thy-1N大鼠肾组织中ATF3乙酰化水平的影响。此外,利用病理学实验技术检查不同处理的Thy-1N大鼠发病3h及7d时,其肾组织的相关病理学改变,并测定各组大鼠7d时的24h尿蛋白总量。结果:包装的 LV-shp300、LV-shEgr-1、LV-shATF3 和 LV-shGadd45β/y 能够侵染大鼠GMC。利用大鼠肾动脉灌注术将LV-shRNAs注入大鼠肾脏,沉默相应p300、Egr-1和ATF3后,Thy-1N大鼠肾组织中凋亡相关蛋白Gadd45β/γ的表达水平显著降低。同样,在干扰了 p300后,Thy-1N大鼠肾组织中的ATF3乙酰化水平也明显下调。此外,沉默相应p300、Egr-1、ATF3和Gadd45β/y后,Thy-1N大鼠发病3h时,其肾组织内肾小球的凋亡细胞数大量减少,并在Thy-1N大鼠发病第7d时,肾组织内GMC增生和细胞外基质(ECM