关键词： 绵羊   营养剥夺   骨骼肌   转录组测序分析   应激、免疫和凋亡   ATF3  

摘要： 营养剥夺可使动物机体发生一系列生理生化反应,包括应激、免疫和凋亡,其在骨骼肌中的具体机制尚不清楚。本试验旨在从动物和细胞水平,基于转录组测序和生物信息学分析鉴定营养剥夺条件下绵羊骨骼肌应激、免疫和凋亡相关的差异表达基因（DEGs）,为揭示相关机制奠定基础。首先通过对禁食条件下绵羊骨骼肌转录组测序（RNA-Seq）获得的DEGs进行GO和KEGG等分析,筛选了应激、免疫和凋亡相关DEGs及其通路,并在动物和细胞水平利用荧光定量PCR（q RT-PCR）对部分DEGs进行了验证。然后重点分析并研究了应激相关转录因子ATF3,利用生物信息学分析了其分子特性及基因启动子区转录调控元件,并扩增了其编码序列,合成了linker肽（G4S）3,构建了ATF3-（G4S）3-EGFP融合表达载体p ATF3-EGFP,转染绵羊成肌细胞后通过荧光观察和q RT-PCR检测了其表达效果。结果显示:（1）通过对营养剥夺条件下绵羊骨骼肌转录组结果分析,共筛选出107个应激、免疫和凋亡相关DEGs,其中15个基因上调,92个基因下调。应激、免疫和凋亡相关DEGs分别有45、60和66个,其中免疫和凋亡共同相关DEGs有32个,应激和凋亡共同相关DEGs有25个,应激和免疫共同相关DEGs有22个,应激、免疫和凋亡共同相关DEGs有15个。GO富集注释到45、47和64个应激、免疫和凋亡相关DEGs。KEGG通路注释到26和4个免疫、凋亡相关DEGs。蛋白互作得到3个分值最高的网络,相关性分析进一步表明,3个子网络中可能相互关联的DEGs之间多数呈现出表达水平的显著相关性。q RT-PCR结果与转录组测序结果趋势一致,证明了测序结果的可靠性。（2）成功建立了绵羊成肌细胞营养剥夺应激模型,并对上述分析的部分DEGs进行了q RT-PCR检测。结果显示,与2%HS（马血清）相比,20%和60%PBS组绵羊成肌细胞中ATF3、TNFRSF12A、MAFF、NR4A3、TRIB3、PPP1R15A、SOX4、ANGPTL4、NR1D1、TP63和IKBKG m RNA表达量显著升高;GADD45B、NR4A1、BCL2L1和STAT5B m RNA表达量显著降低。（3）生物信息学分析显示绵羊ATF3蛋白定位于细胞核,二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲组成,三级结构与二级结构保持一致且可信度高。进化树显示绵羊ATF3与牛、山羊、猪的同源性较高。绵羊ATF3基因启动子区存在CREB,NFKB,AP1和GRE等转录因子结合元件。酶切和测序结果表明p ATF3-EGFP融合表达载体构建成功,转染绵羊成肌细胞后,荧光观察和q RT-PCR结果显示ATF3成功过表达,为进一步深入研究奠定了基础。综上所述,本试验基于RNA-Seq筛选和鉴定,获得营养剥夺条件下绵羊骨骼肌中应激、免疫和凋亡功能相关的DEGs共107个,其中许多DEGs在三种功能间具有交叠性,部分DEGs存在互作关系和表达相关性。通过对候选基因ATF3生物信息学分析了解了其结构和特征,并利用体外重组技术实现了其在绵羊成肌细胞中的过表达。

关键词： ATF3   MIRI   凋亡   糖尿病   MAPK  

摘要： 研究背景:冠心病合并糖尿病(DM)的患者再灌注治疗后,发生心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的程度更重,其具体机制尚不明确。本研究旨在探讨转录激活因子3(activating transcription factor-3,ATF3)对糖尿病大鼠MIRI的影响,为提高冠心病合并DM患者再灌注治疗的临床获益提供新的参考。方法:(1)细胞实验:重组腺病毒载体转染H9C2细胞72 h后,给予高糖(HG)及缺氧/复氧(HR)处理,共分为6组:HG+HR组、NG+HR组、HG+sham组、NG+MN+HR组、HG+Ad-ATF3-shRNA+HR组和HG+Ad-GFP-shRNA+HR组;荧光显微镜及细胞流式技术测定腺病毒的转染效率;CCK-8实验检测细胞活性;流式细胞仪检测H92C细胞凋亡水平;qRT-PCR检测Bcl-2、Bax水平;Westernblot检测ATF3及信号通路相关蛋白表达;(2)动物实验:雄性SD大鼠以高脂饲料喂养联合40 mg/kg链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射,构建糖尿病大鼠模型;重组腺病毒载体转染3 d后,结扎冠状动脉左前降支30 min缺血,再灌注3 h,构建缺血再灌注损伤模型;动物实验共分为6组:NM+IR组、DM+IR组、DM+NS+sham组、DM+NS+IR组、DM+Ad-ATF3-shRNA+IR组和DM+Ad-GFP-shRNA+IR组;荧光显微镜观察腺病毒转染效率;TTC染色测定心肌梗死面积;HE、免疫组化染色评估心肌凋亡情况;全自动生化分析仪检测血清心肌酶CK、CK-MB、LDH;qRT-PCR检测Bcl-2、Bax的表达水平;Westernblot检测ATF3及信号通路相关蛋白表达。结果:细胞实验:(1)腺病毒成功转染H9C2细胞:荧光显微镜下,随腺病毒MOI值增加,绿色荧光蛋白表达增强。(2)HR及HG均可诱导H9C2细胞ATF3表达上调:与HG+Sham组相比,HR后ATF3表达量显著升高,与NG+HR组细胞相比,HG+HR组ATF3表达量升高更为明显,转染Ad-ATF3-shRNA后其表达显著下降(P<0.05)(3)ATF3下调可增加心肌细胞活性:与HG+Sham组相比,HG+HR组细胞活性显著降低;与NG+HR组相比,HG+HR组活力降低更为明显;转染Ad-ATF3-RNAshRNA后,心肌细胞细胞活性较Ad-GFP-shRNA组升高(P<0.05)。(4)ATF3下调可减轻HR诱导的凋亡反应:结果显示,与NG+HR相比,HG+HR组心肌细胞凋亡率增加,Bax的基因表达升高更为明显,Bcl-2的表达降低;与HG+Sham组相比,HG+HR组心肌细胞凋亡率增加,Bax的表达升高,而Bcl-2的表达降低;与HG+Ad-GFP-shRNA组相比,转染Ad-ATF3-shRNA后,心肌细胞凋亡水平下降,Bax的表达降低,而Bcl-2的表达升高(P<0.05)。(5)ATF3下调可激活MAPK信号通路:Western blot实验结果显示,HR诱导心肌细胞中MAPK信号通路相关蛋白ERK1/2的磷酸化水平降低;ATF3下调促进ERK1/2的磷酸化(P<0.05),而对JNK和p38的磷酸化水平无明显影响。动物实验:(1)成功建立糖尿病大鼠模型,共有90只大鼠随机血糖值>15 mmol/L;(2)腺病毒成功转染至大鼠心肌:腺病毒转染大鼠心肌后,可见明显绿色荧光表达;(3)与DM+Sham组相比,DM+IR组ATF3蛋白表达量升高,与NM+IR组相比,DM+IR组ATF3升高更明显,转染Ad-ATF3-shRNA后表达下降(P<0.05),(4)ATF3下调减轻大鼠MIRI:TTC染色结果显示,与NM+IR组相比,DM+IR组心肌梗死面积增加;与DM+Ad-GFP-shRNA+IR组相比,DM+Ad-ATF3-shRNA+IR组心肌梗死面积降低。HE染色提示,与DM+sham组相比,DM+IR组可见心肌纤维排列紊乱、细胞水肿、肌纤维断裂及大量炎性细胞浸润,DM+Ad-ATF3-shRNA+IR组损伤减轻。与DM+Sham组相比,DM+IR组LDH、CK和CK-MB升高,DM+IR组与NM+IR组相比,LDH、CK和CK-MB升高更明显,转染Ad-ATF3-shRNA后LDH、CK和CK-MB降低(P<0.05)。(5)ATF3下调减轻MIRI诱导的凋亡:TUNEL染色结果显示,与DM+Sham组相比,DM+IR组TNUEL阳性细胞比例增多,与NM+IR组相比,DM+IR组心肌细胞中TUNEL阳性细胞增多更明显。转染Ad-ATF3-shRNA后,TUNEL阳性细胞数减少(P<0.05)。(6)ATF3下调促进MIRI诱导的MAPK信号转导:与DM+Sham组相比,MIRI后

关键词： 动脉粥样硬化   ATF3   炎症反应   NF-κB信号通路   冠心病猝死  

摘要： 目的:转录激活因子3（Activating transcription factor 3,ATF3）是响应动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）刺激而激活的早期应答基因之一,可能是抑制动脉粥样硬化进展的重要因子。本研究通过在人冠状动脉粥样硬化斑块内检测ATF3及相关因子表达,并在体内外敲低ATF3的表达,探讨ATF3在动脉粥样硬化中的作用及其与炎症反应的关系。方法:（1）人体标本实验:收集贵州医科大学法医学院/法医司法鉴定中心尸检案例冠脉组织标本90例,分为:机械性损伤致急速死亡同时患有冠心病32者（CHD组）,冠心病猝死者36例（SCD组）,对照组22例（Con组）。HE染色观察冠脉血管组织病理学结构改变,并测量冠脉血管内膜厚度、纤维帽厚度、坏死灶厚度及血管腔狭窄程度以评估血管结构变化;免疫荧光双标法观察斑块内ATF3和CD68的表达;免疫组织化学（IHC）及Western Blot法检测冠脉血管ATF3、炎症因子（CD45、IL-1β、TNF-α）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）及血管细胞粘附分子（VCAM1）蛋白的表达及分布;Pearson相关系数法分析病变组ATF3蛋白表达与结构相关指标,ATF3蛋白表达与炎症因子间相关性,探讨ATF3基因与动脉粥样硬化斑块内炎症反应及其结构稳定性间的关系。（2）动物实验:将32只8-9周龄SPF级载脂蛋白基因敲除(Apo E-/-)小鼠分为Con组、AS组、AAV9-e GFP及AAV9-ATF3组,每组8只,适应喂养一周后,Con组予以普通饲料,其余各组小鼠均予以高脂饲料。所有小鼠继续饲养12周后,AAV9-ATF3基因敲除组尾静脉注射5×1011vg/100μl/只的AAV9-ATF3病毒,AAV9-e GFP组尾静脉注射5×1011vg/100μl/只的AAV9-e GFP空载病毒,Con组及AS组100μl/只生理盐水尾静脉注射。Con组予以普通饲料喂养,其余各组高脂喂养,所有小鼠继续喂养5周后麻醉处死,取小鼠胸主动脉近主动脉弓处供病理切片用,剩余的小鼠主动脉弓、胸主动脉、腹主动脉至肾动脉分叉处的血管组织-80℃冻存供蛋白提取。小鼠主动脉大体及横断面油红O染色检测小鼠主动脉内膜脂质沉积;HE染色观测小鼠主动脉斑块面积改变;荧光显微镜观察AAV9携带的e GFP转染小鼠主动脉斑块情况;免疫组织化学及Western Blot法检测小鼠主动脉ATF3、炎症相关因子（CD45、CD68、IL-1β、TNF-α和VCAM1、MMP-2、MMP-9）、NF-κB信号通路相关因子(IKKβ、p-IKKα/β（Ser176/180）、NF-κB P65及p-NF-κB P65（Ser536）)蛋白表达变化。（3）细胞实验:采用siRNA干扰,靶向敲低THP-1细胞ATF3表达,160nmo1/ml佛波酯（PMA）诱导THP-1细胞成为巨噬细胞,并进一步用80ng/L氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）诱导建立泡沫细胞模型。油红O染色鉴定泡沫细胞脂质沉积;Western Blot法检测ATF3基因敲低效率、NF-κB信号通路相关因子(IKKβ、p-IKKα/β（Ser176/180）、NF-κB P65及p-NF-κB P65（Ser536）)蛋白表达变化。结果:（1）人体冠脉实验:从Con组、CHD组到SCD组,冠脉血管内膜厚度和坏死灶厚度逐渐增厚,管腔狭窄程度增加（P<0.05）,而SCD组纤维帽较CHD组变薄（P<0.05）;免疫组织化学结果显示,在Con组冠脉血管内膜炎症因子（CD45、IL-1β及TNF-α）、VCAM1和MMP-9几乎未见表达,而在CHD组和SCD组AS斑块内,上述蛋白表达水平增高（P<0.05）,且SCD组较CHD组更高（P<0.05）,Western Blot也证明了上述结果（P<0.05）;免疫荧光结果显示,在AS斑块内,ATF3和CD68呈现部分共表达;免疫组化及Western Blot还显示,与Con组相比,CHD组和SCD组ATF3表达水平增高（P<0.01）,而SCD组中ATF3蛋白表达反而低于CHD组（P<0.01）;相关性分析结果显示,CHD组和SCD组AS病灶内ATF3蛋白水平与冠状动脉内膜厚度、坏死核心厚度呈负相关（P<0.01）,与纤维帽厚度呈正相关（P<0.01）,而与管腔狭窄程度无相关关系（P>0.05）;CHD组和SCD组AS斑块内ATF3蛋白水平与炎症因子（CD45、IL-1β及TNF-α）、MMP-9及VCAM1蛋白表达分别呈负相关关系（P<0.01）。（2）动物实验:冰冻切片荧光显微镜观察小鼠主动脉斑块,AAV9携带的e GFP呈不均匀广泛分布的绿色荧光表达,转染率约8%,这提示AAV9成功转染小鼠主动脉;IHC和Wes

关键词： 肺纤维化   内质网应激   线粒体稳态   肺泡上皮细胞   ATF3   PINK1  

摘要： 目的:肺纤维化是一种少见的间质性肺疾病,预后较差,治疗有限。团队前期研究发现,陈皮碱性提取物(Citrus Alkaline Extracts,CAE)能够发挥抗肺纤维化的作用,对肺成纤维细胞有明显抑制作用,但其抗肺纤维化的分子机制仍不完全明确,尤其对肺泡上皮细胞(Alveolar Epithelial Cell,AEC)的作用还有待探索。本研究首先进一步完成对CAE主要成分的鉴定,随后验证CAE对博来霉素(Bleomycin,BLM/Bleo)诱导的小鼠肺纤维化模型的治疗作用,之后利用组织样本及AECⅡ,体内体外探讨CAE对内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress,ERS)、ATF3/PINK1信号通路以及线粒体稳态的调节作用,最后探索AEC Ⅱ和肺成纤维细胞间的交互作用及可能参与这个过程的细胞介质。方法:***的制备、鉴定和质控:利用95%乙醇反复煎煮陈皮饮片,通过过滤、浓缩、分散、调酸、调减、萃取等步骤从陈皮乙醇煎液中提取黄色粉末CAE;通过UPLC-ESI-MS/MS对CAE进行检测并完成质量控制,获得CAE总离子流图,提取保留时间、母离子分子量、子离子分子量、相对分子质量、峰强度等信息,利用植物次生代谢物数据库Metware对CAE二级谱进行智能匹配完成物质定性分析,采用多反应监测模式检测物质相对含量完成相对定量分析;***诱导小鼠肺纤维化模型:将120只小鼠分为空白组、腰穿针气管插管模型组、留置针气管插管模型组和气管切开模型组,分别利用腰穿针气管插管造模法、留置针气管插管造模法和气管切开造模法注射BLM诱导肺纤维化模型,观察小鼠一般情况,通过H&E和Masson染色观察肺组织病理学改变,并通过ELISA检测肺组织羟脯氨酸水平;***对小鼠肺纤维化的抑制作用:将50只小鼠分为空白组、模型组、CAE低剂量组(32 mg/kg/d)、CAE中剂量组(64 mg/kg/d)和CAE高剂量组(96 mg/kg/d),利用腰穿针气管插管法气管注射BLM诱导肺纤维化模型,并分别以不同浓度CAE的CMC-Na溶液灌胃21天,通过H&E、Masson以及天狼星红染色观察小鼠肺组织病理学改变,并通过Western Blot检测肺组织胶原沉积水平;***缓解AEC Ⅱ中ERS调控ATF3/PINK1通路:通过Western Blot检测ERS相关蛋白以及ATF3、PINK1在肺组织中的表达情况,通过免疫荧光观察肺组织中ERS标志物BiP以及ATF3、PINK1的变化及重叠情况,再通过免疫荧光观察肺组织中AEC Ⅱ标志物SPC以及ATF3、PINK1的变化及重叠情况;之后将A549细胞分为空白组,模型组,CAE低剂量组(50 μg/mL),CAE中剂量组(100μg/mL)、CAE高剂量组(200 μg/mL)和阳性对照组(TUDCA,5 μg/mL),利用衣霉素(Tunicamycin,TM,2μg/ml)干预 12 h 建立 ERS模型,分别用含不同浓度CAE的培养基干预48 h,通过Western Blot检测ERS相关蛋白以及ATF3、PINK1在A549细胞中的表达情况,再通过免疫荧光观察A549细胞中BiP以及ATF3、PINK1的变化及重叠情况;***通过ATF3/PINK1通路调控AEC Ⅱ线粒体稳态:首先通过JC-10检测A549细胞的线粒体膜电位水平,再通过ROS检测试剂盒检测A549细胞的ROS水平,从而观察A549细胞线粒体功能;之后通过shRNA质粒对A549细胞的ATF3及PINK1进行基因沉默,并再次通过JC-10和ROS检测试剂盒检测A549细胞的线粒体膜电位及ROS水平,从而观察A549细胞线粒体功能;***通过调控AEC Ⅱ影响肺成纤维细胞:A549细胞经TM和CAE干预后,更换不含CAE的低血清培养基继续培养72 h,收集细胞上清干预MRC5细胞,通过Western Blot检测MRC5细胞的胶原水平,并通过ELISA检测细胞上清中TGF-β1、IL-6及IL-10的水平。结果:***的制备、鉴定和质控:CAE为黄色粉末,平均产量约1.56 mg/kg;通过UPLC-ESI-MS/MS鉴定出315种物质,包括143黄酮类物质和32种生物碱类物质,其中80种物质的一级结构和二级结构完全匹配,可以确定为CAE的活性成分,包括47黄酮类物质和5种生物碱类物质,其中具有代表性的黄酮类物质有桔皮素、川陈皮素、芸香柚皮苷、新橙皮苷、甜橙素、橙皮苷,具有代表性的生物碱类物质有辛弗林、枸橼苦素Ⅰ、扁平桔碱Ⅰ、芽子碱;不同批次CAE样本间无明显差异;***诱导小鼠肺纤维化模型:在腰穿针气管插管模型组、留置针气管插管模型组和气管切开模型组三组中,气管切开模型组体

关键词： 南方红豆杉   非小细胞肺癌   细胞凋亡   转录激活因子3(ATF3)   Hippo-YAP信号通路  

摘要： 目的 观察南方红 豆 杉水提物(aqueous extract of Taxus Chinensis ***,AETC)对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞系的增殖抑制作用,并深入研究其通过激活转录因子3(activating transcription factor 3,ATF3)介导的 Hippo-YAP 信号通路促进NSCLC细胞系凋亡的机制研究,为AETC临床治疗肺癌提供基础研究依据,为NSCLC的治疗提供新靶点。方法1.运用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法及流式细胞仪检测不同浓度及作用时间的AETC对NSCLC细胞系增殖和凋亡的作用;Western blot技术检测凋亡蛋白cleaved caspase 3、cleaved caspase 8、cleaved caspase 9和 cleaved PARP 的表达。2.普通转录组测序分析AETC对NSCLC细胞系促凋亡作用的靶点,明确ATF3是上调的差异表达基因,并用western blot、qRT-PCR和免疫荧光技术加以验证。3.采用慢病毒转染构建ATF3基因敲减稳转细胞株,运用western blot、qRT-PCR、免疫荧光、TUNEL染色检测ATF3基因敲减对caspase蛋白酶表达和AETC促NSCLC凋亡作用的影响。4.采用western blot、TUNEL染色检测AETC对Hippo-YAP信号通路关键蛋白(MOB1、p-MOB1、p-YAP(Ser397)、p-YAP(Ser127))的影响,YAP 抑制剂验证 AETC是通过激活Hippo信号通路促进NSCLC细胞凋亡。5.采用western blot、TUNEL染色检测AETC对ATF3基因敲减的NSCLC细胞株Hippo-YAP 信号通路中 MOB1、p-MOB1、p-YAP(Ser397)、p-YAP(Ser127)等蛋白表达的影响。6.构建NSCLC荷瘤裸鼠,采用AETC灌胃处理14天,观察荷瘤裸鼠一般情况,每隔两日测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线;14天后剖取肿瘤,称重并计算抑瘤率。Western blot 检测裸鼠肿瘤组织中 ATF3、MOB1、p-MOB1、p-YAP(Ser397)、p-YAP(Ser127)以及凋亡蛋白的表达情况。免疫组化检测ATF3、YAP的表达和定位,TUNEL染色检测肿瘤组织凋亡情况。结果 ***-8显示AETC能抑制NSCLC细胞增殖,呈现时间、剂量依赖性。流式细胞仪检测显示AETC增加H1975和A549细胞的凋亡率,Western blot结果提示AETC能增加NSCLC细胞凋亡蛋白cleaved caspase 3/8/9和cleaved PARP的表达。2.普通转录组测序结果显示AETC干预H1975和A549细胞后,前者有119个基因上调,20个基因下调;后者由796个基因上调,666个基因下调。其中,ATF3基因在两细胞中均显示为表达上调的差异基因,前者上调1.61倍,后者上调4.13倍。Western blot、qRT-PCR和免疫荧光检测结果与转录组测序结果一致。*** blot、qRT-PCR和免疫荧光检测H1975和A549 ATF3基因敲减慢病毒稳转细胞株中ATF3表达情况,结果显示与si-NC组相比,si-ATF3组ATF3蛋白和mRNA表达明显减弱,部分凋亡蛋白表达降低。si-ATF3和si-ATF3+AETC组相比,ATF3蛋白和mRNA表达无改变,凋亡蛋白表达也无改变。TUNEL染色显示的凋亡情况与western blot结果一致。*** blot检测结果显示AETC干预后,H1975和A549细胞中p-MOB1、p-YAP(Ser397)、p-YAP(Ser127)均明显上调,YAP抑制剂能显著增加AETC对NSCLC细胞中凋亡蛋白的表达,TUNEL染色结果也显示YAP抑制剂能增加AETC促凋亡的能力。*** blot检测ATF3基因敲减慢病毒稳转细胞株中Hippo通路表达情况,结果显示:在H1975细胞中,与si-NC组相比,si-ATF3组p-MOB1和p-YAP(Ser397)蛋白表达明显下降;si-ATF3组和si-ATF3+AETC组相比,p-MOB1和p-YAP(Ser397)蛋白表达无差异。在A549细胞中,与si-NC组相比,si-ATF3组p-MOB1、p-YAP(Ser127)和p-YAP(Ser397)蛋白表达明显下降,si-ATF3组和si-ATF3+AETC组相比,上述蛋白表达无差异。6.各组荷瘤裸鼠一般情况无差异;相较于对照组,AETC低、高剂量组肿瘤生长明显减慢,瘤重明显减

关键词： 弥漫性大B细胞淋巴瘤   激活转录因子3   p53   预后   增殖   多柔比星  

摘要： 目的探讨激活转录因子3(Activating Transcription Factor 3,ATF3)与弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B-cell Lymphoma,DLBCL)患者临床病理学特征及预后之间的关系;探讨ATF3对DLBCL细胞增殖能力的影响以及不同ATF3表达水平对DLBCL细胞药物敏感性的影响,及其可能的分子机制。方法应用免疫组织化学染色方法检测119例DLBCL患者肿瘤组织中ATF3及突变型p53(Mutant Type Tumor Protein 53,mutp53)蛋白的表达水平;建立稳定高表达ATF3及低表达ATF3的活化B细胞样(Activated B-cell-like,ABC)DLBCL TMD8细胞株和生发中心B细胞样(Germinal center B-cell-like,GCB)DLBCL BJAB细胞株,应用RT-PCR及Western Blot方法鉴定ATF3表达水平;CCK8细胞增殖实验检测不同ATF3表达水平对DLBCL细胞体外增殖能力的影响,RT-PCR检测48小时体外培养后不同ATF3表达水平的DLBCL细胞中BCL2、P21、RELA等基因m RNA的表达情况;多柔比星(Doxorubicin,DOX)化疗药物敏感实验研究不同ATF3表达水平下DLBCL细胞对DOX的耐药性。结果119例DLBCL患者中ATF3阳性表达38例(38/119,31.93%),阴性表达81例(81/119,68.07%),mutp53阳性表达43例(43/119,36.13%),阴性表达76例(76/119,63.87%),ATF3蛋白表达与p53蛋白表达水平之间具有显著统计学意义(P<0.05),ATF3蛋白表达水平与患者临床分期之间的相关性具有显著统计学意义(P<0.05),与性别、年龄、IPI评分、Hans分型之间无显著相关性(P>0.05),生存分析显示ATF3蛋白阳性表达者较ATF3蛋白阴性表达者的总体生存时间显著缩短(P<0.05);细胞增殖实验显示BJAB细胞组体外增殖活性显著高于TMD8组细胞,与对照组相比,ATF3表达水平上调后TMD8和BJAB细胞体外增殖活性均显著增高,ATF3表达水平下调后TMD8和BJAB细胞体外增殖活性均显著降低,各组差异均具有统计学意义(P<0.05);在各组细胞进行48小时体外培养后,RT-PCR分析显示ATF3表达上调后,TMD8细胞组中BCL2、RELA、HER2、P21表达水平升高,BJAB细胞组中P21、BCL2、HER2、RELA、PDCD5、CASP3、BIRC5表达水平升高;ATF3表达下调后,TMD8细胞组中HER2、CDKN2A、CCND-1表达升高,BJAB细胞组中CASP3、HER2表达升高;加入DOX药物后,下调TMD8和BJAB细胞内ATF3的表达水平后,两组肿瘤细胞存活数量均较对照组减少,上调ATF3表达水平后,两组肿瘤细胞存活数量均多于对照组,TMD8组细胞存活情况优于BJAB组。结论DLBCL中ATF3表达水平与p53蛋白表达呈正相关;ATF3的表达水平可作为DLBCL患者的预后指标;上调ATF3表达可增加DLBCL细胞体外增殖活性及对DOX的耐药性,并可能通过调节BCL2、RELA、HER2等基因参与调控DLBCL肿瘤细胞体外增殖及耐药的过程。

关键词： 砷中毒   支气管上皮细胞   恶性转化   转录因子  

摘要： 砷作为一种广泛存在自然界于的化合物，具有双重作用，即可致癌又可抑癌，肺作为砷毒性作用的靶器官之一，在地方砷等一些砷污染严重的地区，肺癌发病率极高;目前砷引起肺部病变的机理较复杂，还未被完全阐明;关于砷化物在诱导支气管上皮细胞发生恶性转化的研究内容还不完善，而转录因子ATF3在在肿瘤的形成与发展过程中发挥着重要作用，但在肺癌中的相关机制尚未研究阐明。　　目的：建立砷暴露和ATF3敲除支气管上皮细胞恶性转化模型，明确ATF3在砷致恶性转化中的作用及与恶性程度的相关性，并探讨分子机制，为全面了解砷对机体的影响提供理论基础，为寻找砷中毒早期生物学标志和防治新方法提供新思路。　　方法：（1）将人支气管上皮（BEAS-2B）细胞（WT）和ATF3敲除BEAS-2B细胞（ATF3KO）在含0.25μM NaAsO2的培养基中连续培养六个月，在恶性转化的不同阶段（2、4、6个月）检测ATF3表达情况及软琼脂克隆形成能力，并将砷暴露六个月后发生恶性转化的细胞进行裸鼠成瘤实验;（2）通过MTT实验、平板克隆形成实验、细胞周期检测、划痕实验、Transwell检测、细胞凋亡实验、real time RT-PCR、Western Blot等，比较四组细胞，即WT、ATF3KO、恶性转化的WT（WT-AsT）和恶性转化的ATF3KO（ATF3KO-AsT）细胞的增殖能力、凋亡抵抗能力、迁移能力和EMT情况。（3）提取WT和WT-AsT细胞的总RNA，利用真核有参转录组测序技术，寻找参与砷致恶性转化的通路。后通过real time RT-PCR、Western Blot、ELISA等，检测这些通路在四种细胞中的激活情况。　　结果：（1）长期低剂量砷暴露会增加ATF3表达，但ATF3缺失促进砷致支气管上皮细胞发生恶性转化。（2）ATF3敲除的恶性转化细胞具有更强的增殖能力、凋亡抵抗能力及迁移能力。（3）炎症信号通路、PI3K/AKT通路、JAK/STAT3通路等在砷致恶性转化过程发生了显著变化，而ATF3敲除的恶性转化细胞炎症因子IL-6、IL-8等表达升高，AKT和STAT3的磷酸化水平升高。　　结论：ATF3在砷致恶性转化中起到抑制作用，且与恶性转化细胞的恶性程度呈负相关。ATF3可通过减轻长期砷暴露过程中的慢性炎症水平以及下游的PI3K/AKT和JAK/STAT3信号通路的激活，起到抑制肺癌癌变的作用。

关键词： 胰腺癌   益康唑   自噬   凋亡   ATF3   ID1   AKT/mTOR通路  

摘要： 目的:胰腺癌因其极高的死亡率被称为“癌中之王”,其发病率位于所有恶性肿瘤的第九位,但其造成的肿瘤相关性死亡却高居第四位,死亡率近乎于其发病率。近年来胰腺癌的发病率逐年攀升,据估计在2030年将成为第二大致死性恶性肿瘤。胰腺癌的诊治水平发展有限,即使经过治疗的胰腺癌病人五年死亡率依然高于90%。并且胰腺癌细胞具有天然的放射治疗抗性和化疗耐药现象,因此临床上迫切需要有效的胰腺癌治疗手段。老药新用因其研发周期短、投入低的特点成为近年来开发抗肿瘤新药的重要方法之一,据报道益康唑具有良好的抗肺癌、胃癌和乳腺癌活性,但其是否能杀伤胰腺癌细胞及其具体的分子机制目前仍未完全阐明。因此在本文中我们探究了益康唑对胰腺癌的杀伤作用及其分子机制。 材料和方法:利用MTT法检测细胞活力;克隆形成、软琼脂克隆形成和Ed U细胞增殖实验检测细胞增殖水平;LDH释放实验检测细胞毒性;蛋白免疫印迹实验检测益康唑处理后目标蛋白表达水平改变;免疫荧光染色检测自噬标志物LC3变化;裸鼠荷瘤模型检测益康唑体内抗肿瘤活性;免疫组织化学染色检测动物组织中目标蛋白表达水平变化;流式细胞术检测细胞凋亡水平;LC3和LAMP2共定位检测融合情况;串联质粒GFP-RFP-LC3斑点颜色检验自噬流通畅程度;免疫沉淀实验验证蛋白之间相互作用;RNA-sequence寻找受益康唑调控重要通路及分子;q RT-PCR检测目标因子转录水平变化;核质分离检测目标分子细胞内定位;构建过表达质粒或使用si RNA介导的敲降干扰目标分子探究其生物学功能。 结果:益康唑显著抑制胰腺癌细胞系PANC-1和MIA-Pa Ca-2的生长,并呈剂量依赖性,其半抑制浓度(IC50)为25μM左右。克隆形成、软琼脂克隆形成、Ed U增殖实验、LDH释放实验等也得到相同的结论即益康唑具有一定的抗胰腺癌活性。益康唑在裸鼠移植瘤模型中也具有抑制胰腺癌活性,并且未对主要脏器造成明显病理损伤。益康唑处理后,胰腺癌细胞中剪切型caspase3和PARP的表达水平升高,联合凋亡抑制剂z VAD-FMK可抑制益康唑的生长抑制作用,并且流式细胞术检测到的凋亡细胞增加,说明益康唑诱导胰腺癌细胞发生凋亡。益康唑可以升高胰腺癌细胞系内自噬相关蛋白LC3-II、ATG5、Beclin1、p62表达水平,并促进Beclin1与Bcl-2解离以及Beclin1与ATG14L结合,通过免疫荧光也能观察到LC3斑点在益康唑处理后显著增加。联用自噬起始抑制剂3-MA或敲低自噬关键基因ATG5/BECN1后,益康唑不能再诱导LC3 II的积累。益康唑处理后,自噬泡标志物LC3与溶酶体标志物LAMP2共定位减少,GFP-RFP-LC3串联质粒中黄色斑点增加,成熟型CTSD与CTSB表达水平均降低,泛素化水平升高,说明益康唑通过干扰自噬体与溶酶体的融合以及抑制溶酶体酶的活性阻滞自噬流。MTT和克隆形成实验证明阻断自噬起始可降低益康唑对胰腺癌细胞的杀伤作用,而阻断自噬下游可增强益康唑的生长抑制作用。益康唑下调p-AKT及p-m TOR水平,持续激活型AKT(CA-AKT)可抑制益康唑诱导的LC3 II积累。益康唑上调胰腺癌细胞中ATF3转录水平及蛋白表达水平。ATF3上调在益康唑抑制p-AKT活化和自噬过程中发挥关键作用。过表达ATF3显著抑制AKT活化并促进LC3 II积累,而敲低ATF3能减弱益康唑诱导的LC3 II积累和细胞杀伤活性。益康唑除了导致胰腺癌细胞系内ATF3水平升高,也导致其入核增多。益康唑可以抑制胰腺癌细胞内ID1的m RNA水平及蛋白水平。ID1是ATF3的转录抑制下游,过表达ATF3导致细胞内ID1水平降低,敲降ATF3导致细胞内ID1水平升高。ID1在胰腺癌细胞内激活AKT活性,过表达ID1导致p-AKT水平升高,敲降ID1导致细胞内p-AKT水平降低。ATF3在胰腺癌组织中表达降低,通过免疫组织化学方法比较癌旁组织与胰腺癌组织中的ATF3水平,发现其表达与临床病理特征、病人预后存在相关性。MEK抑制剂曲美替尼可激活胰腺癌细胞内通畅的保护性自噬。益康唑联用曲美替尼可阻断其原本的自噬流,增强曲美替尼的药物敏感性。 结论:益康唑在体内外均有良好的抗胰腺癌活性并能够诱导细胞凋亡。益康唑促进胰腺癌细胞内自噬起始复合物的形成,并干扰自噬泡与溶酶体融合、降低溶酶体酶活性阻滞自噬流,导致细胞内自噬体积累。益康唑诱导的自噬体累积具有细胞毒性。益康唑通过抑制AKT/m TOR通路激活自噬起始。益康唑诱导的ATF3上调在其诱导自噬及抗胰腺癌活性中发挥重要作用。益康唑通过ATF3/ID1轴调控AKT/m TOR通路活性。益康唑阻滞自噬流,与MEK抑制剂曲美替尼连用,通过干扰其保护性自噬增强曲美替尼的细胞杀伤性。

摘要： Cancer is a systemic disease able to reprogram the bone marrow (BM) niche towards a pro-tumorigenic state. The timing in which BM cells start to sense the development of distant tumours and the molecular players involved in cancer-adapted immune response are largely unknown. In this context, by using the MMTV-NeuT mammary carcinoma mouse model, we have recently described the BM hematopoietic and stromal changes that support the initial steps of mammary transformation and identified the Activating transcription factor 3 (Atf3) among the genes significantly up modulated during the transcriptional reprogramming of the BM hematopoietic niche, at both early and late stages of disease. Additionally, Atf3 expression in the BM perfectly correlated with the pathologic disease score. These data supported the need to further investigate the role of Atf3 during the BM emergency haematopoiesis associated with tumour progression. In order to identify in which specific BM cell populations Atf3 was more expressed, we checked ATF3 activation in different progenitor and mature immune cell subsets starting from early stages of mammary gland transformation and along tumour progression. Taking advantage of two mouse models of luminal breast cancer, we demonstrated, extending previous observations, that ATF3 induction during cancer progression is a multistep process characterized by its activation in two different subsets of BM myeloid cells. At early time point we observed high ATF3 expression and nuclear localization in common myeloid progenitor cells (FcγR+) localized in proximity of the vascular niche. This feature was maintained at invasive stage of mammary transformation, when ATF3 became also expressed in mature monocyte/macrophage cells. Of note, the nuclear localization of ATF3 was associated with the formation of myeloid progenitor clusters in the BM of tumour-bearing mice and its overexpression in progenitor cells drove the expansion and the differentiation of monocyte/macroph

关键词： 乳腺癌   ATF3   预后  

摘要： 目的:探讨ATF3在乳腺癌组织中的表达及其临床意义。方法:选取2016年1月至2016年12月经由病理学确诊并行乳腺癌根治术的66例患者的肿瘤组织和癌旁组织标本的新鲜标本以及病理组织学切片并收集患者临床病理资料。采用RT-q PCR方法检测乳腺癌及癌旁组织中ATF3 m RNA的相对表达量;采用免疫组织化学法检测ATF3在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达情况,应用Spearman相关系数及Cox回归模型分析ATF3表达水平与临床病理因素及预后之间的关系。结果:RT-q PCR结果显示:与癌旁组织相比,乳腺癌组织中ATF3 m RNA相对表达量明显升高。与癌旁组织相比,ATF3在乳腺癌组织的mi RNA表达量为癌旁乳腺组织的2.773倍,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组化结果表明:ATF3在乳腺癌组织中表达明显高于癌旁组织;Spearman相关分析显示ATF3高表达与乳腺癌的临床病理分期、淋巴结转移、组织学分级、Ki67表达分呈正相关,与HER-2表达、P53表达无相关性;Cox单因素及多因素回归分析模型显示ATF3高表达是决定乳腺癌患者预后的独立风险因素。结论:乳腺癌组织中转录激活因子3(ATF3)的表达明显高于癌旁组织且ATF3高表达与乳腺癌的淋巴结转移、临床病理分期、组织学分级、Ki67表达分呈正相关,与HER-2表达、P53表达无相关性。ATF3高表达是决定乳腺癌患者预后的独立风险因素。