关键词：
食管鳞癌
铁死亡
SLC7A11
ATF3
放射敏感性
摘要：
背景:食管癌是最常见的恶性肿瘤之一,是全球第六大癌症相关死因。食管癌病理分为食管鳞癌和腺癌。食管腺癌在北美和西欧较为常见,食管鳞癌是亚洲最常见的病理类型,预后较差。目前的治疗方法主要包括手术、放疗、化疗。食管癌早期症状不明显,约有30-50%的患者在确诊时丧失手术机会,多采取以放疗为主的综合治疗。随着放疗技术和药物的发展,食管癌的生存有所提高,但总体5年生存率仍较低。治疗失败的主要原因包括局部未控和复发,肿瘤细胞的放射抵抗是影响放疗疗效的主要生物学因素之一。因此寻找新的治疗方式或者药物,特别是放疗增敏剂来增加ESCC放射敏感性提高放疗疗效已成为当务之急,也是放疗界研究的热点。射线通过损伤DNA,诱导肿瘤细胞出现凋亡、坏死,是射线杀伤肿瘤的主要机制之一,但由于DNA修复途径的激活和凋亡抵抗而出现辐射抵抗。因此,通过其他非凋亡死亡途径使癌细胞对射线敏感,对肿瘤治疗有很大价值。铁死亡,一种铁离子依赖的、致死性脂质过氧化物堆积、浆膜上多不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸磷脂耗尽为特点的调节性死亡,可以被GPX4,Nrf2,TFR1,SLC7A11等关键基因调节。最近研究发现,放射可诱导人纤维肉瘤HT1080细胞、肺腺癌细胞发生铁死亡,但在这两种肿瘤细胞中放射诱导细胞发生铁死亡的分子机制却完全不同。在人纤维肉瘤HT1080细胞中放射通过激活ATM,抑制SLC7A11蛋白表达,限制细胞摄取胱氨酸并减少谷胱甘肽合成,增加脂质过氧化损伤介导铁死亡。在肺癌细胞系H460、A549中,其机制为放射诱导ACSL4蛋白表达,导致脂质过氧化物堆积来促进铁死亡,且放射后出现SLC7A11、GPX4蛋白表达增高,发生负反馈调节,促进肿瘤细胞生存。同时有研究发现经放射后,MCF-7和UMRC6细胞系中不能检测到铁死亡标志基因PTGS2表达增加。用铁死亡诱导剂处理860种肿瘤细胞系,发现不同细胞对于铁死亡诱导剂的的敏感性有很大差异。SLC7A11为溶质载体家族成员之一,作为跨膜蛋白介导胱氨酸入胞,参与GSH合成,保护细胞免受氧化应激损伤。SLC7A11是铁死亡通路中的关键基因,通过参与GSH合成、脂质过氧化物的氧化还原调控铁死亡。抑制SLC7A11可以触发铁死亡。SLC7A11广泛高表达于肺癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤,在肿瘤的发生、发展和侵袭转移中发挥重要作用。ATF3是ATF/CREB转录因子家族中的一员,是一个已知的氧化应激反应基因。其表达可被多种细胞应激迅速诱导,包括DNA损伤、氧化应激和细胞损伤。目前仅在人纤维肉瘤HT1080细胞中发现ATF3通过与转录激活因子竞争BS-1/BS-2的结合来抑制SLC7A11启动子,抑制SLC7A11蛋白表达,在Erastin诱导HT1080细胞铁死亡中发挥作用。目前铁死亡在放射介导的ESCC细胞死亡中作用不明确,具体的分子机制不清楚,通过靶向铁死亡通路,增加ESCC细胞放射敏感性,改善食管癌预后具有很大的研究价值。本研究将从细胞、代谢、分子水平多角度去验证放射可以诱导食管鳞癌细胞发生铁死亡,通过系列实验探索和证明放射是通过上调ATF3表达来抑制SLC7A11表达,介导ESCC细胞铁死亡;并验证靶向SLC7A11的铁死亡诱导剂对ESCC细胞具有放射增敏作用。为深入了解放射诱发铁死亡的机制,和靶向铁死亡增加食管鳞癌放射敏感性提供理论依据,促进肿瘤的个体化和精准治疗。目的:1、证明放射可诱导食管鳞癌细胞发生铁死亡;2、证明放射是通过上调ATF3表达来抑制SLC7A11表达,介导ESCC细胞铁死亡;3、证明靶向SLC7A11的铁死亡诱导剂可作为潜在的放射增敏剂;4、验证食管鳞癌病理样本中ATF3与SLC7A11蛋白表达相关性、与放疗预后关系。方法:1、在含有ESCC细胞系KYSE150、TE1细胞的培养孔中加入铁死亡抑制剂(Ferr-1、Lipr-1、DFO)、凋亡抑制剂(V-ZAD)、坏死抑制剂(Necr-1)后给予照射、培养一定时间后使用CCK-8检测细胞活性,计算不同死亡抑制剂对放射后细胞活性的影响,反映铁死亡、凋亡、坏死在放射后细胞死亡中所占比例;并通过铁死亡抑制剂联合照射后克隆形成实验再次验证。2、通过C11-Bodipy染色、流式技术检测细胞中脂质ROS水平变化、谷胱甘肽检测试剂盒检测照射前后、基因干扰ATF3、SLC7A11蛋白表达的细胞中总GSH水平变化。3、通过real-time PCR、Western blot检测放射后食管鳞癌细胞KYSE150、TE1中铁死亡关键基因PTGS2、SLC7A11、GPX4、ACSL4、LPCAT3等基因变化、SLC7A11上游转录因子Nrf2、ATF4、TP53、ATF3基因变化,探索放射诱导食管鳞癌铁死亡潜在的分子机制。4、通过慢病毒干扰SLC7A11表达构建KYSE150-
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