关键词： 铁死亡   SIRT1   NAD   胶质瘤   ATF3  

摘要： 背景: 铁死亡是一种铁依赖性脂质过氧化物积累引起的细胞程序性死亡方式,铁死亡主要的生物学特征是细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)在铁离子存在下氧化细胞膜上的多不饱和脂肪酸形成有毒性的过氧化脂质,破坏细胞膜引起细胞死亡。通过诱导铁死亡来杀死肿瘤细胞是一种新型的肿瘤治疗方案。转录激活因子3(Activating transcription factor 3,ATF3)作为ATF/CREB转录因子家族的一员,可以抑制溶质载体家族7成员11(Solute carrier family 7member 11,SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)的转录进而参与铁死亡的发生。内质网应激途径可以激活ATF3,但目前尚不清楚是否有其他因素参与ATF3的激活。 沉默信息调节因子1(Silent information regulator 1,SIRT1)是一种去乙酰化酶,它通过消耗烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide,NAD+)从例如肿瘤抑制蛋白P53(Cellular tumor antigen P53,P53)、多聚ADP核糖聚合酶1(Poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP1)等靶蛋白中去除乙酰化氨基酸残基,在细胞生物学中发挥着多种重要作用,如炎症、代谢、氧化应激和细胞凋亡等。激活的SIRT1保护非肿瘤细胞免受由各种有害因素引起的铁死亡,例如SIRT1抑制由热应激引起的肺上皮细胞铁死亡,由缺血、缺氧导致的神经元细胞铁死亡以及由阿霉素诱导的心肌细胞铁死亡。从机制而言,SIRT1主要通过两种途径抑制铁死亡:一种是去乙酰化P53来抑制P53依赖性的SLC7A11下调,另一种则是去乙酰化核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid2-related factor2,NRF2)来驱动NRF2介导的GPX4上调。但是激活的SIRT1通过多种途径对肿瘤细胞产生有害影响。文献报道,SIRT1通过加重核因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)的核转位,促进了二甲双胍引起的乳腺癌细胞焦亡;SIRT1通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)来加重槲皮素诱导的肺癌细胞自噬性死亡;SIRT1也通过上调乙酰基转移酶10(N-Acetyltransferase 10,NAT10)来促进脱氧鬼臼毒素(Deoxypodophyllotoxin,DPT)诱导的胶质瘤细胞PARP1依赖性死亡。所以,SIRT1在胶质瘤细胞铁死亡中的作用和机制值得进一步研究。 作为经典的铁死亡诱导剂,RAS选择性致死化合物3(RAS-selective lethal compounds 3,RSL3)可以通过靶向抑制GPX4引发铁死亡。RSL3作为一种能够特异性诱导细胞发生铁死亡的化合物,在研究和开发新的肿瘤治疗药物中具有潜在价值。本课题组的前期研究中发现RSL3可以通过激活致死性自噬引起胶质瘤细胞死亡,在体内或体外均对胶质瘤细胞有一定的杀伤作用。所以,进一步探索RSL3诱导胶质瘤细胞铁死亡的机制,不仅能为铁死亡的分子机制研究提供参考,还可以为RSL3的临床应用提供理论依据。 目的: 采用U87,U251和U118人胶质瘤细胞系以及裸鼠皮下异位移植瘤模型,探究SIRT1在RSL3诱导胶质瘤细胞铁死亡过程中的作用和机制。 方法: ***-Orange荧光探针检测RSL3诱导胶质瘤细胞亚铁离子水平变化和使用DFO,FAC,SRT2183,EX527等抑制剂对RSL3诱导胶质瘤细胞亚铁离子水平变化的影响; 2.使用丙二醛含量检测试剂盒测定RSL3诱导胶质瘤细胞脂质过氧化水平变化和使用各抑制剂对RSL3诱导胶质瘤细胞脂质过氧化水平变化的影响; 3.乳酸脱氢酶释放实验检测RSL3诱导胶质瘤细胞死亡程度以及使用Fer-1,NAD+,SRT2183等抑制剂对RSL3诱导胶质瘤细胞死亡程度的影响; 4.蛋白印迹法(Western Blotting)检测RSL3处理胶质瘤细胞后SLC7A11,GPX4,转铁蛋白(transferrin,TF),转铁蛋白受体(transferrin receptor,TFR),SIRT1,ATF3,SIRT1活性调节因子(Active regulator of SIRT1,AROS)等蛋白水平的变化以及各抑制剂对上述变化的影响; 5.使用siRNA敲低SIRT1、ATF3和AROS的表达水平,研究它们对RSL3诱导胶质瘤细胞铁死亡相关指标变化的影响; 6.免疫荧光染色后,激光共聚焦显微镜下观

关键词： 噪声性耳聋   氧化应激   ATF3   NRF2   衣康酸二甲酯   噪声性耳聋   氧化应激   ROS   ATF3   ATF3   NRF2   抗氧化应激   噪声性耳聋   抗氧化应激   ATF3   NRF2   DI  

摘要： 目的:明确在噪声性耳聋(Noise induced hearing loss,NIHL)的小鼠模型中转录激活因子 3(Activated transcriptional factor 3,ATF3)的表达及定位,研究 ATF3 在NIHL的小鼠耳蜗中发挥的效应,并探究通过药物干预调节耳蜗ATF3的表达能否改善小鼠的听力水平。 方法:本研究通过听性脑干反应(Auditory brainstem response,ABR)检测了各组实验小鼠的ABR阈值以明确小鼠听力水平;通过电生理平台检测小鼠内淋巴电位(Endolymphatic potential,EP);通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot,WB)、组织及细胞免疫荧光等实验检测耳蜗或小鼠耳蜗毛细胞株HEI-OC1细胞中ATF3、核因子红系 2 相关因子 2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)、血红素氧合酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)和喹啉酮氧化酶 1(NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1)等分子的表达水平;通过细胞慢病毒转染构建沉默或过表达ATF3的细胞系进而验证ATF3在细胞模型中发挥的效应;通过H2O2刺激细胞构建细胞的氧化应激损伤模型;通过细胞活性检测试剂盒Cell Counting Kit-8(CCK8)检测各组细胞活性;通过流式细胞术检测细胞内活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)的水平和细胞凋亡的水平;通过核酸酶靶向切割和释放(Cleavage under target and release using nuclease,CUT&RUN)等一系列实验方法验证ATF3能否结合于NRF2的启动子区域;通过腹腔注射衣康酸二甲酯(Dimethyl itaconate,DI)构建DI预处理的小鼠模型。 结果:ATF3及抗氧化应激通路相关分子NRF2及其下游分子的表达在噪声暴露后的耳蜗和H2O2刺激的HEI-OC1细胞模型中均显著升高。沉默HEI-OC1细胞中ATF3的表达后增加了细胞对氧化性损伤的敏感性,细胞受刺激后胞内ROS水平显著升高而NRF2及其下游分子的表达显著降低。过表达细胞中ATF3的基因后改善细胞受到H2O2刺激的细胞活性,细胞中NRF2及其下游分子表达水平显著升高。细胞受H2O2刺激后结合于NRF2启动子区域的ATF3蛋白增加。DI可以上调小鼠耳蜗ATF3的表达,显著改善噪声暴露后小鼠的ABR阈值和维持小鼠耳蜗EP。细胞实验中,DI显著改善HEI-OC1细胞受H2O2刺激后的细胞活性,而在沉默ATF3表达的细胞中DI的保护作用消失。 结论:ATF3在噪声性耳聋中发挥耳保护作用,且这种保护效应可能是通过其入核结合于NRF2启动子区域在转录水平调控NRF2的表达实现。DI可以在体上调ATF3及NRF2/HO-1/NQO1等分子的表达并可能通过调节ATF3的表达改善NIHL小鼠的听觉生理功能。 第一部分:噪声性耳聋中ATF3的耳保护作用 目的:明确噪声暴露后小鼠耳蜗中ATF3的表达、分布以及其可能发挥的功能效应。 方法:本研究通过110dB的宽频噪声对小鼠进行2小时的噪声暴露构建NIHL小鼠模型;通过ABR检测了各组实验小鼠的ABR阈值以明确小鼠听力水平;通过RT-PCR、WB、组织及细胞免疫荧光等实验检测耳蜗或细胞中ATF3的表达水平及分布;通过ROS反应产物4-羟基巯基-2-壬烯酸(4-Hydroxynonenal,4-HNE)的免疫荧光染色检测耳蜗氧化应激水平;通过细胞活性检测试剂盒CCK8检测各组细胞活性;通过细胞慢病毒转染短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)构建沉默ATF3表达(shATF3)的细胞系进而验证ATF3在细胞模型中发挥的效应;通过二氢乙啶染色和流式细胞术检测细胞内活性氧簇ROS的水平和细胞凋亡的水平;通过ROS抑制剂NAC验证抑制ROS后shATF3细胞受H2O2刺激后的活性变化。 结果:110dB噪声暴露2小时后小鼠ABR阈值显著升高且小鼠获得永久性听力阈移,小鼠耳蜗中ATF3的mRNA水平和蛋白表达水平也均有显著升高,耳蜗冰冻切片的免疫荧光结果显示小鼠经噪声暴露后ATF3在外侧壁和螺旋神经节的表达均有升高,而升高最为显著的部位是基底膜。HEI-OC1细胞受H2O2刺激后细胞中ATF3的mRNA水平和蛋白表达水平也有显著升高,且细胞免疫荧光结果显示ATF3在细胞质和细胞核中的含量均显著升高,提示ATF3

关键词： 激素性股骨头坏死   铁死亡   MLKL   ATF3  

摘要： 【目的】 激素性股骨头坏死具体发病机制尚不清楚,目前缺乏有效的治疗方法。本研究拟通过收集激素性股骨头坏死患者股骨头组织进行转录组测序筛选关键基因、构建小鼠激素性股骨头坏死模型和Mlkl基因敲除的激素性股骨头坏死小鼠模型,探讨MLKL通过ATF3调控铁死亡在激素性股骨头坏死中的作用及机制,以期为激素性股骨头坏死的治疗提供新的靶点。 【方法】 1.转录组测序及验证 （1）首先,对患有激素性股骨头坏死（Steroid induced necrosis of femoral head,SONFH）和股骨颈或股骨头骨折患者的软骨和软骨下骨进行转录组测序,通过筛选差异表达的基因,从中挑选出与激素性股骨头坏死相关度较高的基因。 （2）运用Western Blot和QPCR等技术检测关键基因的表达,然后,进一步分析人体激素性股骨头坏死的关键因子和炎症指标以及SONFH分期之间的相关性。用PCR assay（炎症因子芯片）检测炎症因子的表达情况。 2.体内、体外实验分析Mlkl基因敲除对成骨细胞、破骨细胞及微血管内皮细胞的影响 （1）体内实验,本研究采用6周龄雄性C57小鼠和Mlkl基因敲除C57小鼠作为实验对象,利用泼尼松龙混悬液诱导小鼠激素性股骨头坏死模型。实验分为WT组（A）、SONFH组（B）和SONFH(Mlkl-/-)组（C）。通过HE染色和Mic ro-CT观察股骨头组织结构的变化,并利用茜素红染色和免疫组织化学（Immun ohistochemical,IHC）评估成骨细胞的活性。利用TRAc P染色和IHC评估破骨细胞情况。利用IHC检测对微血管内皮的影响。 （2）体外实验,分离WT组、SONFH组和SONFH(Mlkl-/-)组小鼠的骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）和骨髓源巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophage,BMMD）。利用流式细胞术鉴定BMSC。采用茜素红染色、QPCR和ELISA评估成骨细胞的骨形成能力。使用TRAc P染色、QPCR、免疫荧光和Western blot检测破骨细胞活性和骨吸收情况的相关指标。对人微血管内皮细胞（Human microvascular endothelial cell,HMEC）进行培养,用地塞米松（Dexamethasone,DEX）诱导,然后使用MLKL抑制剂进行干预,应用CCK8、Transwell、平板克隆、成管实验检测人微血管内皮细胞增值、转移以及成血管能力。 3.转录组测序及体内实验分析Mlkl基因敲除后对SONFH影响的具体机制 （1）对A组、B组和C组股骨头骨组织进行转录组测序,筛选差异表达关键基因,应用Western Blot、QPCR检测关键基因在SONFH中的表达。对临床患者血浆样本ATF3表达量与MLKL、血沉、C反应蛋白等做相关性分析。 （2）尾静脉注射ATF3特异的RNA干扰腺病毒对SONFH(Mlkl-/-)小鼠的A TF3的基因进行下调,用WB检测ATF3的表达、HE染色及Micro-CT观察对股骨头组织结构的影响。尾静脉注射ATF3过表达腺病毒对SONFH小鼠进行ATF3基因过表达;用铁死亡抑制剂Fer-1对SONFH(Mlkl-/-)小鼠进行铁死亡通路阻断;用HE染色及Micro-CT观察股骨头组织结构变化;用WB及ELISA检测铁死亡相关因子含量的变化、普鲁士蓝染色观察Fe2+蓄积、IF检测NOX1和HO-1表达;用IHC检测CD31、VEGF、VWF评价人微血管内皮细胞功能改善情况。 （3）采用CHIP实验分析ATF3和SLC7A11结合位点。 【结果】 1.人激素性股骨头坏死转录组测序结果及相关验证 （1）转录组测序结果:SONFH组与正常对照组（Normal组）比较,一共筛选出4131个显著差异表达基因,其中1802个上调基因,2329个下调基因。将4131个显著差异基因与铁死亡、焦亡和坏死性凋亡数据集交集分别得到69个、13个和24个共有基因。将上述三部分共有差异表达基因合集使用KOBAS（KEGG Orthology Based Annotation System）进行KEGG富集分析,结果表明有59条差异富集通路（p<0.05）,其中包括坏死性凋亡通路。上述24个差异共有基因与坏死性凋亡有关的基因进行PPI网络分析,关联节点较多的差异基因有 CASP1、RIPK3、BIRC3、MLKL、FAS、IFNGR1。 （2）应用股骨头组织进行QPCR验证6个关联点较多的差异基因中MLKL差异最大,并且MLKL在激素性股骨头坏死领域机制研究尚为空白,因此选择MLKL作为关键调节基因。WB和QPCR明确MLKL在人激素性

关键词： 砷   氧化应激   FTO   m6A修饰   ATF3  

摘要： 目的:砷是一种广泛分布在岩石、土壤、水和空气等自然环境中具有神经毒性的物质,通常以化合物形式存在。本课题组之前的研究发现砷可以调控FTO从而改变m6A修饰,并影响砷所致神经细胞氧化应激。本研究将继续探索FTO调节砷所致神经细胞氧化应激的详细机制。 方法:（1）将构建好的SH-SY5Y细胞分为对照组、砷处理组、FTO过表达（OE）组、FTOOE砷处理组,四个组用于转录组测序,根据转录组测序结果筛选出氧化应激相关基因ATF3,并采用Western blot、RT-q PCR、IF实验方法验证ATF3受砷和FTO的调控。（2）用构建FTOOE体外模型相同的方法构建FTO突变体（mut）模型（去除m6A去甲基化酶FTO的活性）,并用Western blot实验方法检测在FTO基因上进行m6A位点突变对ATF3蛋白表达和氧化应激指标HO-1、GCLM和γ-H2AX的影响。（3）用构建FTOOE体外模型相同的方法构建ATF3OE模型并用Western blot验证模型。使用si RNA（已通过RT-q PCR验证其敲低效果）敲低ATF3。随后采用Western blot检测ATF3的过表达和敲低对细胞氧化应激指标HO-1、GCLM和γ-H2AX的影响。（4）使用si RNA敲低YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、IGFBP1、IGFBP2和IGFBP3后检测ATF3的m RNA表达,筛选出参与砷调控ATF3的m6A修饰阅读蛋白YTHDC1,随后用Western blot实验方法检测敲低YTHDC1对ATF3蛋白表达和氧化应激指标HO-1、GCLM和γ-H2AX的影响。（5）用构建FTOmut模型相同的方法构建YTHDC1突变体模型（使YTHDC1失去与m6A结合的能力）和YTHDC1敲除（KO）模型,并用Western blot实验方法验证模型。随后用Western blot实验方法检测FTOKO细胞中敲低YTHDC1、FTOKO和YTHDC1KO细胞中转染YTHDC1突变体和野生型质粒后对ATF3蛋白表达的影响。（6）将7周龄,体重20-24g 10只雄性C57BL/6野生型小鼠随机分为对照组、砷处理组,每组5只。对照组饮用灭菌水,砷处理组小鼠饮用灭菌水配置的10mg/L砷溶液,持续3个月后杀鼠取脑皮层送代谢组测序,从差异代谢物中筛选出具有抗氧化效应的肌醇（MI）。根据细胞活力检测（MTS）结果选择MI合适的处理时间和浓度,随后用流式细胞术和Western blot实验方法检测MI对活性氧（ROS）和氧化应激指标HO-1和GCLM的影响。（7）构建MI染毒体内模型,将20只7周龄,体重20-24g 20只雄性C57BL/6野生型小鼠随机分为对照组、砷处理组、MI处理组和砷+MI处理组,每组5只。对照组饮用灭菌水;砷处理组小鼠饮用灭菌水配置的10mg/L砷溶液;MI组小鼠每日一次灌胃0.8mg/g MI;MI组和砷+MI组小鼠饮用灭菌水配置的10mg/L砷溶液并每日一次灌胃0.8mg/g MI,3个月的染毒结束后采用Y迷宫试验和Morris水迷宫试验以分别评估短期工作记忆和空间学习记忆。 结果:（1）筛选FTO参与砷所致神经细胞氧化应激的潜在下游基因:将对照组与砷处理组、砷处理组与FTOOE砷处理组的差异基因（DEGs）进行交集,得到17个基因,选择了其中与氧化应激相关的ATF3。Western blot、IF、RT-q PCR结果显示,ATF3的蛋白表达、荧光强度、m RNA在亚砷酸盐处理24h后呈剂量依赖性显著降低。（2）FTO参与了砷对氧化应激相关基因ATF3的调控:Western Blot、IF实验表明,敲除/过表达FTO显著增强/减轻了砷引起的ATF3蛋白表达降低和荧光强度减弱。在SH-SY5Y细胞中表达FTO突变体后发现,FTO在其m6A位点(FTOmut)的突变会导致ATF3蛋白表达显著降低,而HO-1蛋白表达显著升高。将FTO突变体质粒转染到FTOKO细胞中,发现ATF3蛋白表达无显著变化,而将FTO野生型质粒转染到FTOKO细胞中,发现ATF3蛋白表达显著升高。Me RIP-q PCR实验表明,砷处理增加了ATF3上的m6A修饰。（3）ATF3参与砷致神经细胞氧化应激过程:Western Blot实验表明,用si ATF3转染细胞会显著提高砷暴露下HO-1、GCLM和γ-H2AX的蛋白表达,而ATF3的过表达则会显著降低砷暴露下HO-1、GCLM和γ-H2AX的蛋白表达。（4）m6A阅读蛋白YTHDC1通过调节砷暴露后ATF3的表达介导氧化应激:si RNAs敲除YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、IGFBP1、IGFBP2和IGFBP3后发现,当敲

关键词： 肾细胞癌   NSUN6   转录调控   启动子   ATF3  

摘要： 研究背景 肾细胞癌被认为是致死率最高的泌尿系统肿瘤,约占全身恶性肿瘤的3%。其中,肾透明细胞癌作为最常见的肾癌病理亚型,肿瘤细胞体积较大,分化程度较好,早期癌症的恶性程度低,肿瘤生长速度较慢,患者的早期生存率相比于其他肾细胞癌是最高的。但由于缺乏早期临床诊断标志物,且肾透明细胞癌对化疗和放疗敏感度均较低,这使得部分患者不能早期得到根治。同时,针对晚期肿瘤的靶向药物也不多,选择较少,因此,晚期肾透明细胞癌的预后不佳,且容易出现转移和复发。 m5C修饰是指供体的一个活性甲基被添加到RNA胞嘧啶碱基的第5位碳原子,是广泛存在的一种RNA修饰。mRNA m5C修饰与各种生物过程有关,如维持mRNA的稳定性、剪接和核浆转运,DNA修复损伤和肿瘤增殖转移等。异常的mRNA m5C修饰与多种疾病的病因有关,包括动脉粥样硬化、自身免疫性疾病和癌症等。其中,NSUN6作为m5C甲基修饰酶的关键组分,在多个肿瘤中表达异常且与预后相关,但NSUN6在肾癌中的表达水平以及所受调控机制未知。 研究目的 分析NSUN6在肾细胞癌中的表达情况,与临床病理参数之间的相关性及其在肾细胞癌预后中的作用。克隆鉴定NSUN6基因启动子并寻找其核心功能区域,鉴定调控NSUN6启动子基本转录活性的关键转录因子,为揭示NSUN6基因的表达调控机制奠定基础。 研究方法 从TCGA数据库中获取肾细胞癌组织和癌旁组织的RNA-seq表达和生存数据,通过R语言分析NSUN6在肾细胞癌中的mRNA表达情况并采用Kaplan-Meier生存曲线分析NSUN6表达与患者预后之间的相关性;采用RT-q PCR和Western blot技术验证正常肾脏细胞,肾细胞癌细胞系以及临床肾细胞癌组织中NSUN6 mRNA和蛋白表达水平。通过PCR,双酶切和连接转化等实验技术构建NSUN6启动子区截断质粒,双荧光素酶报告基因实验初步确定NSUN6启动子的核心调控区域。在线转录因子网站预测结合NSUN6核心启动子区的潜在转录因子,双荧光素酶报告基因实验,RT-q PCR,Western blot和Ch IP等实验确证转录因子对NSUN6启动子区的调控功能。 研究结果 ***数据库结果显示NSUN6在肾透明细胞癌和肾乳头状细胞癌中的mRNA水平显著高于正常肾脏组织,而在肾嫌色细胞癌中则相反;Kaplan-Meier生存曲线结果表明NSUN6高表达组患者的预后情况低于正常对照组;RT-q PCR和Western blot技术证实NSUN6在肾癌细胞系和临床肾透明细胞癌组织中高表达。 2.经过PCR,双酶切,连接等实验成功构建NSUN6启动子区截断质粒,随后在293T,He La和769-P三个细胞中进行双荧光素酶报告基因,结果显示NSUN6启动子-74～-34bp区为调控基因转录活性的核心区域。 3.采用GTRD,JASPAR,PROMO和h TFtarget对核心转录区进行预测,初步推测CREB,ATF2和ATF3三个转录因子可能结合在核心调控。敲低三个转录因子后,确定ATF3是调控NSUN6启动子活性的关键转录因子。突变ATF3结合位点后NSUN6的转录活性明显下降。过表达和敲低ATF3后,NSUN6启动子的转录活性,mRNA和蛋白水平随之增高和下降。ChIP实验表明转录因子ATF3可以在体内与NSUN6结合。 研究结论 NSUN6在肾细胞癌中表达具有肿瘤特异性,其表达水平与患者的不良预后有关。NSUN6启动子区-74～-34bp是调控其转录活性的核心区域,通过生物信息学预测和si RNA初步确定转录因子ATF3是调控NSUN6转录活性的关键转录因子。通过定点突变和缺失突变,双荧光素酶报告基因,RT-q PCR,Western blot和ChIP等实验进一步证实ATF3可以正向调控NSUN6转录活性。

关键词： 肠缺血再灌注损伤   大波斯菊苷   纳米颗粒   铁死亡  

摘要： 目的:肠缺血再灌注损伤(Intestinal ischemia reperfusion injury,Ⅱ/RI)是一种临床常见疾患,发病机制复杂,治疗难度大。铁死亡是一种以铁依赖性脂质过氧化物过量积累引起细胞死亡为特征的细胞死亡途径,它参与调控多种生物学过程。大波斯菊苷(Apigenin-7-O-Glucoside,AGL)是一种天然黄酮类化合物,具有抗氧化和抗炎等多种药理作用,但未见其抗Ⅱ/RI的研究报道,且AGL水溶性差等问题也亟待解决。因此,本研究设计可包封AGL并靶向损伤肠组织的功能性纳米粒PDN@AGL,评价其抗Ⅱ/RI的药理学作用及分子机制,为AGL的深入开发和创新药物研制提供实验依据。 方法:(1)负载AGL纳米颗粒(PDN@AGL)的制备和评价 将DTPA与二癸胺合成名为DTPA-N10-10可消耗自由基的两亲分子,将消耗ROS的硫缩酮键和多巴胺与聚乙二醇(PEG)偶联,合成m PEG-TK-DA两亲分子,通过氢谱和质谱对DTPA-N10-10和m PEG-TK-DA进行结构表征,使用薄膜水化法将AGL包封在由DTPA-N10-10与m PEG-TK-DA合成的纳米颗粒PDN中,通过动态光散射仪(DLS)与紫外分光光度计(UV)检测PDN@AGL的稳定性和释药率,溶血实验检测DTPA-N10-10与m PEG-TK-DA生物相容性。 体外安全性评价中,IEC-6细胞孵育不同浓度PDN@AGL(3、6、12和24μg/mL)24小时,CCK-8法检测细胞活力、xCELLigence实时细胞分析系统检测细胞增殖曲线、Calcein/PI试剂盒检测活死细胞比例。体内急性毒性评价中,30只雄性C57BL/6小鼠随机分为Sham组和PDN@AGL给药组(2、4、8和16 mg/kg),尾静脉注射PDN@AGL 24小时后,H&E染色观察小鼠各个脏器组织病理变化,检测血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)水平,记录各组小鼠体重变化。体内慢性毒性评价中,18只雄性C57BL/6小鼠随机分为Sham组和PDN@AGL给药组(2和4 mg/kg),尾静脉注射PDN@AGL 30天后,H&E染色观察小鼠各个脏器组织病理变化,检测血清BUN、Cr、AST和ALT水平,记录各组小鼠体重变化。 (2)PDN@AGL抗Ⅱ/RI的药理学活性评价 体外活性评价中,IEC-6细胞孵育不同浓度PDN@AGL(3和6μg/mL)和PDN 24小时后,建立H/R(缺氧2小时复氧1小时)模型。CCK-8法检测细胞活力、ROS探针检测氧化应激水平、BODIPY 581/591 C11荧光染色检测细胞脂质过氧化水平、Fe Rhonox-1亚铁离子荧光探针检测细胞Fe2+水平、检测细胞线粒体膜电位变化、生物透射电镜观察线粒体损伤。 体内活性评价中,应用小动物活体荧光影像分析系统观察PDN@AGL体内分布情况,确定给药时间。30只雄性C57BL/6小鼠随机分为Sham组、Ⅱ/RI组、PDN@AGL(2和4 mg/kg)组和PDN组,缺血45分钟再灌注90分钟构建Ⅱ/RI模型,在构建Ⅱ/RI模型前24小时和6小时小鼠尾静脉注射PDN@AGL和PDN,激光散斑血流成像系统观察小肠微循环血流、免疫荧光染色观察小肠黏膜屏障损伤、H&E染色观察小肠组织病理损伤、血清SOD和ROS检测评价氧化应激水平、小鼠血清总铁和亚铁水平检测铁代谢水平、血清MDA水平检测和小肠4-HNE免疫组化染色考察脂质过氧化水平。 (3)PDN@AGL介导ATF3/SLC7A11通路抑制铁死亡抗Ⅱ/RI的作用机制 假手术组(Sham)组和Ⅱ/RI组小鼠小肠组织使用Illumina测序平台进行转录组测序(RNA-seq),以DEGseq软件筛选差异表达m RNA,确定与调节性死亡途径相关的差异基因ATF3及介导的SLC7A11/GPX4信号通路。体外实验中,IEC-6细胞孵育不同浓度PDN@AGL(3和6μg/mL)和PDN;体内实验中,30只小鼠随机分为Sham组、Ⅱ/RI组、PDN@AGL(2和4 mg/kg)组和PDN组。采用免疫荧光染色和Western blot法检测PDN@AGL对ATF3、SLC7A11和GPX4表达水平的影响。 结果:(1)在PDN@AGL制备中,氢谱和质谱检测结果表明,DTPA-N10-10与m PEG-TK-DA成功合成。与PDN和游离AGL相比,PDN@AGL吸收光谱证实AGL被封装在纳米颗粒内。PDN@AGL药物包封率(DEE)和载药量(DLC)分别约为36%和8.25%,平均直径约为115 nm。正常生理条件下PDN@AGL累积药物释放率为21.6%,ROS条件下为68.8%。DTPA-N10-10与m

关键词： 结直肠癌   HDAC7   ATF3   组蛋白乙酰化   转录调控  

摘要： 研究背景: 结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是仅次于乳腺癌和肺癌的全球第三大常见癌症,也是仅次于肺癌的第二大致命肿瘤。在过去几十年中,尽管诊断技术和治疗选择的进步显著提高了CRC患者的总体生存率,但目前全球CRC的发病率和死亡率仍呈逐年上升趋势,临床结果和远期预后不容乐观。CRC的发生发展主要归因于正常结肠组织中遗传和表观遗传改变的积累,但其潜在致病分子机制尚不明确。因此,深入研究CRC发病的分子机制,对于明确治疗靶点和诊疗策略具有十分重要的临床意义。 组蛋白的乙酰化和去乙酰化是一个由组蛋白乙酰转移酶(Histone Acetyltransferases,HATs)和组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase,HDACs)分别催化的动态可逆过程,组蛋白乙酰化水平的增加通常与癌基因表达激活相关,而较低组蛋白乙酰化水平与肿瘤抑制基因沉默相关。在人类中共存在18种不同的HDACs,可以进一步细分为4类:I类(HDAC1、2、3和8)、IIa类(HDAC4、5、7和9)、IIb类(HDAC6和10)、III类蛋白(SIRT1、2、3、4、5、6、7)和IV类(HDAC11)。HDAC7等IIa类HDACs通常具有较低的去乙酰化酶活性,但在多种人类恶性肿瘤中的表达显著增加,提示其可能通过去乙酰化酶非依赖性的方式在肿瘤细胞基因转录调控中发挥作用,但具体的分子机制仍然知之甚少。 激活转录因子3(Activating Transcription Factor 3,ATF3)是一种在细胞应激反应和基因调节中发挥重要作用的转录因子,属于ATF/环AMP反应元件结合蛋白家族。通常条件下,ATF3在细胞内处于较低本底表达水平,但在细胞应激反应条件下快速激活升高。既往报道表明,ATF3在CRC肿瘤标本中的表达低于癌旁组织,但另外报道显示ATF3在HT29结肠癌模型中表达水平较高并促进肿瘤生长和迁移,说明ATF3在介导基因转录方面可能具有正向调节或反向调节的双重调控作用功能,可能取决于CRC的细胞类型、组织背景和肿瘤发生的阶段。然而,ATF3在CRC发展过程中是否以及如何协调这些过程尚不明确。值得注意的是,研究显示,HDAC抑制剂(HDAC inhibitor,HDACi)处理CRC细胞系可以增加ATF3表达,导致细胞凋亡和迁移减少,表明HDACs蛋白可能参与ATF3水平的调节和CRC的发生发展。然而,IIa类HDACs,特别是HDAC7,参与调节ATF3表达及其下游CRC癌细胞信号传导通路的潜在分子机制需要进一步研究阐明。 研究目的: 探究HDAC7调控ATF3的自我导向转录的表观遗传机制,阐明HDAC7在CRC中的分子机制及作用,提示HDAC7可作为分子治疗靶点,为治疗CRC提供新思路。研究方法: HDAC7表达调控研究:利用TCGA数据库分析,HDAC7在CRC的表达和其对总生存期和无病生存期、不同分期的影响;利用RT-q PCR和Western Blot检测人类CRC组织样本中HDAC7表达。构建稳定敲低HDAC7的CRC细胞系,利用Ed U实验、流式细胞术、细胞集落形成能力试验、Transwell实验和裸鼠异种移植瘤模型检测HDAC7敲低对CRC细胞增殖、活力、周期、凋亡和迁移的影响;利用RNA-seq测序分析HDAC7在SW480细胞系中调控的关键基因以及下游信号通路变化,并利用RT-q PCR和Western-blot验证相关基因以及下游信号通路分子的表达变化。建立裸鼠细胞异种移植瘤模型验证HDAC7敲低降低肿瘤的增殖情况。 HDAC7调控ATF3转录研究:通过GEO和GEPIA数据库分析HDAC7和ATF3之间表达水平相关性的关系以及ATF3与CRC分期和预后的关系;利用RT-q PCR和Western-blot验证HDAC7与ATF3表达水平的负相关关系,HDAC7敲低或HDACi处理前后ATF3基因以及蛋白表达水平差异、以及ATF3调控的下游基因和蛋白水平的变化。 ATF3自我导向转录抑制/激活的双重作用机制研究:通过Co-IP实验检测ATF3、HDAC7与HDAC3的转录抑制复合体关系,染色质免疫共沉淀实验(Ch IP)检测HDAC7敲低或HDACi处理前后ATF3启动子或增强子上ATF3、H3K27ac、BRD4、RNA聚合酶II(RNA Pol II)等的富集情况,来确定ATF3在其基因位点上动态招募转录抑制因子或转录激活因子,从而调控自身基因的转录激活和抑制变化,并过表达(质粒)或敲低ATF3(si RNA),并用RTq PCR和Western Blot检测ATF3相关下游基因的变化。 抑制效果研究:利用泛HDACi SAHA和选择性靶向IIa类HDACi TMP269分别处理SW480细胞

关键词： 肝细胞癌   鸦胆子苦醇   ATF3   铁死亡  

摘要： 肝癌（liver cancer）是全球癌症死亡的第三大原因,发病率位居第六,它通常发生在患有慢性肝炎、病毒感染、酒精滥用或代谢综合征的患者中。其中,绝大多数的原发性肝癌是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）。尽管与明确的危险因素密切相关,但大多数肝细胞癌患者通常在晚期才被诊断出来。肝细胞癌的一线药物索拉非尼虽然具有一定的治疗效果,但它仍然存在药物耐药和毒副作用大的问题;且在接受索拉菲尼治疗的肝癌晚期患者中,患者的平均总生存期也仅有约10.7个月。因此,寻找一种更加高效安全的肝癌治疗药物,并明确其在肝癌治疗中的作用靶点和机制,仍然是患者和医生共同的祈愿。 鸦胆子苦醇（brusatol,BRU）是一种单体化合物,来源于传统中药鸦胆子,具有多种生物学效应。它已被证明能够减少疟疾病原体的复制、减轻炎症反应以及抵抗病毒入侵等。近年来,研究发现鸦胆子苦醇具有抗肿瘤活性,已被证实在多种肿瘤细胞中具有抑制作用,如非小细胞肺癌、结直肠癌和乳腺癌等。然而,在肝细胞癌方面的研究甚少,且其具体作用机制仍未完全阐明。。 铁死亡（ferroptosis）是一种依赖于铁离子的细胞死亡方式,这种细胞死亡主要是由过度积累的脂质过氧化物引起,具有严谨而独特的形态生化特征。其中形态特征包括线粒体外膜破裂、线粒体变小、线粒体嵴消失或减小等;生化特征主要包括铁离子和活性氧自由基的堆积、线粒体膜电位降低、丝裂原活化蛋白激酶激活、胱氨酸/谷氨酸反转运体受抑制、谷胱甘肽减少等。相比于正常细胞,肿瘤细胞对铁有更高的需求,因此被称为“铁成瘾”,这使得肿瘤细胞更容易发生铁死亡。因此,诱导铁死亡可能是一种新的肿瘤治疗策略。最近的研究表明,分子靶向药物索拉非尼可以通过抑制p62-Keapl-Nrf2信号通路,有效诱导肝癌细胞铁死亡,并取得杀伤肝癌细胞的效果。因此,进一步寻找可诱导肝癌细胞铁死亡的药物,探究其作用机制,有助于为肝细胞癌患者提供新的治疗策略。 激活转录因子3（ATF3）是ATF/c AMP响应元件结合（CREB）转录因子蛋白家族的成员之一,它通过与体内的共同DNA序列“TGACGTCA”结合,进而调控靶基因的转录。现有研究表明ATF3可作用于铁死亡重要基因SLC7A11的启动子区域,抑制其转录活性,从而诱导细胞铁死亡的发生。鸦胆子苦醇是否可以通过调控肝癌细胞内ATF3的表达进而诱导肝癌细胞的铁死亡?目前尚未见报道。 因此,本研究将探究鸦胆子苦醇对肝癌细胞铁死亡的影响及具体作用机制,并探讨ATF3在其中可能发挥的作用。 目的 本文以人肝癌细胞系MHCC-97H、Hep G2和MHCC-97H异种移植瘤裸鼠模型为主要研究对象,通过应用生物信息学技术,探讨鸦胆子苦醇诱导肝癌细胞铁死亡的可能性及潜在的作用机制。 方法 1.利用CCK-8法评估不同浓度鸦胆子苦醇对人肝癌细胞系（MHCC-97H和Hep G2）和正常肝细胞（MIHA）活力的影响,并确定在不同处理时间下鸦胆子苦醇对肝癌细胞系的IC50值;通过克隆形成实验评估鸦胆子苦醇对肝癌细胞增殖的影响。 2.鸦胆子苦醇处理Hep G2细胞后进行转录组测序分析,提取出差异表达基因,进行KEGG分析、GO分析和GSEA分析。 3.铁死亡相关生化实验验证鸦胆子苦醇和铁死亡抑制剂Fer-1单独或联合处理对肝癌细胞的存活率、ROS、GSH、MDA和Fe2+水平的影响。Western blot实验检测鸦胆子苦醇和铁死亡抑制剂Fer-1单独或联合处理对肝癌细胞铁死亡相关蛋白表达的影响。 4.利用多个转录组数据集（Ferr Db,TCGA和GEO）提取差异表达基因,结合随机森林树算法筛选鸦胆子苦醇的靶基因;使用GEPIA和UALCAN数据库验证ATF3在肝癌组织中的表达水平;使用ROC曲线和KMplot数据库验证ATF3在肝癌患者中的诊断价值和对生存预后的影响。RT-q PCR、Western blot和免疫荧光实验检测鸦胆子苦醇对肝癌细胞中ATF3表达水平的影响。 5.基于Ch IP-Altal数据库中的Ch IP-seq数据验证ATF3可能调节转录的基因;分子对接实验验证鸦胆子苦醇和ATF3蛋白质的对接活化能。敲低ATF3验证ATF3对铁死亡相关生化指标和关键蛋白（SLC7A11和GPX4）的影响。 6.构建MHCC-97H异种皮下移植瘤裸鼠模型,随后记录裸鼠体重和瘤体体积的变化;停止给药后,取出瘤体进行称重并拍照;HE染色观察鸦胆子苦醇对裸鼠瘤体及肝、肾组织结构的影响;免疫组化观察鸦胆子苦醇对裸鼠瘤体中Ki67和GPX4表达的影响;GSH和MDA实验检测鸦胆子苦醇在体内对铁死亡相关生化指标的影响;Western blot验证鸦胆子苦醇对裸鼠瘤体铁死亡相关蛋白的影响。 结果 1.鸦胆