关键词：
七氟烷
铁死亡
内质网应激
ATF3
过氧化氢
神经发育毒性
摘要：
研究背景:随着麻醉和外科手术技术的快速进步和发展,越来越多的婴幼儿及孕产妇接受麻醉和手术治疗。人类的神经系统在胎儿妊娠末期至婴幼儿出生后2～3年内是发育的重要时期,发育期大脑极易受到包括全麻药物在内的各种因素的干扰和影响,可能产生发育脑神经毒性损伤。大量动物研究和临床数据表明,在生命发育的早期阶段暴露吸入麻醉药七氟烷、异氟烷能够引起婴幼个体未成熟大脑产生广泛的神经病理性改变,导致长期的行为学异常和神经认知功能损害。因此,探讨吸入麻醉药的神经发育毒性作用及其机制成为麻醉学乃至神经科学急需解决的问题。研究表明导致神经元死亡是吸入麻醉药诱导发育脑神经毒性的主要特征,但具体机制不清。铁死亡（ferroptosis）是细胞程序性死亡的一种形式,其特征是细胞内亚铁离子(Fe2+)增加,积聚的Fe2+能够与过氧化氢（H2O2）通过芬顿反应生成羟基自由基,进而对多不饱和脂肪酸（PUFA）产生脂质过氧化损伤。研究证实,铁死亡不仅介导心脏、肝脏和肾脏等器官损伤的细胞死亡过程,还与多种神经疾病的细胞死亡相关。内质网不仅是细胞内蛋白质合成、修饰、折叠加工的场所,也是驱动脂质过氧化的中枢枢纽。细胞感受内外环境的伤害刺激后,可引起内质网应激,其中PERK/ATF4通路活化与铁死亡的发生密切相关。作为一种应激反应因子,激活转录因子3（ATF3）在细胞受到多种伤害性刺激时迅速表达,进而调控相关靶基因转录激活或抑制。在内质网应激情况下,PERK/ATF4通路活化能够进一步激活ATF3,在多种形式的细胞死亡,包括细胞凋亡、自噬、铁死亡中起重要作用。目前,七氟烷能否诱导发育脑神经元铁死亡仍未明确。内质网应激介导的ATF3活化在七氟烷诱导的发育脑神经元铁死亡过程中作用如何,其调控细胞内铁离子稳态失衡的机制是什么,以及脂质过氧化损伤级联通过什么途径被激活尚不清楚。研究目的:（1）探究七氟烷能否诱导发育脑神经元铁死亡。（2）探究内质网应激介导的ATF3活化在七氟烷诱导发育脑铁死亡过程中可能的作用机制,为吸入麻醉药的神经发育毒性作用提供一种潜在的防治策略。研究方法:（1）HT22小鼠海马神经元细胞和大鼠原代海马神经元分别给予2%、4%、8%七氟烷处理6 h、12 h、24 h后,采用MTT法检测细胞的活力,LDH释放实验检测细胞的死亡率,应用铁离子和丙二醛（MDA）检测试剂盒检测神经元细胞内Fe2+浓度和MDA含量,应用光学显微镜观察神经元细胞的形态变化,应用透射电镜观察神经元细胞线粒体形态的变化,应用蛋白印迹法检测神经元细胞内铁离子代谢相关蛋白包括转铁蛋白受体（TFR）、转铁蛋白（TF）和铁转运蛋白（FPN）的表达。神经元细胞分别给予铁螯合剂去铁胺（DFO）(100μmol/L),抗氧化剂Fer-1（50μmol/L）、Lip-1（10μmol/L）、Vit E（100μmol/L）、GSH（2.5 mmol/L）或等量生理盐水预处理1 h,然后分别给予4%、8%七氟烷处理24 h后,检测细胞的生存率和死亡率及神经元细胞内Fe2+浓度和MDA含量。（2）HT22小鼠海马神经元细胞和大鼠原代海马神经元分别给予4%、8%七氟烷处理6～24 h,应用H2O2试剂盒检测神经元细胞内H2O2含量。神经元细胞分别给予GSH（2.5 mmol/L）或生理盐水预处理1 h,然后给予七氟烷处理,应用铁离子和过氧化氢试剂盒检测神经元细胞内Fe2+浓度和H2O2含量,应用蛋白印迹法检测神经元细胞内TFR、TF和FPN的表达。神经元细胞给予H2O2（500μmol/L）处理24 h后,检测神经元细胞内死亡率、神经元细胞内Fe2+浓度和MDA含量及TFR、TF和FPN的表达。（3）HT22小鼠海马神经元细胞和大鼠原代海马神经元给予4%、8%七氟烷处理6～24 h后,应用蛋白印迹法检测神经元细胞内ATF3的表达,应用共聚焦显微镜检测神经元细胞核内ATF3的聚集。神经元细胞应用si RNA沉默ATF3基因,再给予8%七氟烷处理24 h后,检测细胞的死亡率,应用铁离子、过氧化氢和MDA试剂盒检测神经元细胞内Fe2+、H2O2和MDA含量,应用蛋白印迹法检测神经元细胞内TFR、TF和FPN的表达。（4）HT22小鼠海马神经元细胞和大鼠原代海马神经元分别给予4%、8%七氟烷处理6～24 h后,应用蛋白印迹法检测神经元细胞内质网应激相关蛋白GRP78、PERK和ATF4的表达。神经元细胞给予内质网应激抑制剂4-PBA（250μmol/L）、PERK抑制剂GSK2606414（1μmol/L）或生理盐水预处理1 h,然后给予8%七氟烷处理24 h后,检测细胞的死亡率,应用铁离子、过氧化氢和MDA试剂盒检测神经元细胞内Fe2+、H2O2和MDA含量,应用蛋白印迹法检测神经元细胞GRP78、PERK、ATF4、A
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