关键词： ESCRT   exosome   GSDMD   inflammasome   IQGAP1  

摘要： IL-1 beta can exit the cytosol as an exosomal cargo following inflammasome activation in intestinal epithelial cells (IECs) in a Gasdermin D (GSDMD)-dependent manner. The mechanistic connection linking inflammasome activation and the biogenesis of exosomes has so far remained largely elusive. Here, we report the Ras GTPase-activating-like protein IQGAP1 functions as an adaptor, bridging GSDMD to the endosomal sorting complexes required for transport (ESCRT) machinery to promote the biogenesis of pro-IL-1 beta-containing exosomes in response to NLPR3 inflammasome activation. We identified IQGAP1 as a GSDMD-interacting protein through a non-biased proteomic analysis. Functional investigation indicated the IQGAP1-GSDMD interaction is required for LPS and ATP-induced exosome release. Further analysis revealed that IQGAP1 serves as an adaptor which bridges GSDMD and associated IL-1 beta complex to Tsg101, a component of the ESCRT complex, and enables the packaging of GSDMD and IL-1 beta into exosomes. Importantly, this process is dependent on an LPS-induced increase in GTP-bound CDC42, a small GTPase known to activate IQGAP1. Taken together, this study reveals IQGAP1 as a link between inflammasome activation and GSDMD-dependent, ESCRT-mediated exosomal release of IL-1 beta.

关键词： IQGAP1   顺铂   化疗耐药   凋亡   食管鳞状细胞癌  

摘要： 本文旨在研究含IQ模序的GTP酶激活蛋白1(IQ motif containing GTPase-activating protein 1,IQGAP1)过表达或基因干扰是否影响食管鳞癌细胞对顺铂化疗的敏感性。质粒转染构建IQGAP1高表达和基因干扰的稳定细胞系,并采用Western blot进行鉴定。然后,采用不同浓度(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L)的顺铂处理细胞,通过3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑蓝[3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]法检测IQGAP1高表达、IQGAP1基因干扰和相应对照细胞的活力,通过4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-Diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色和流式细胞技术检测细胞凋亡率,Western blot检测凋亡相关蛋白的表达。结果显示,IQGAP1高表达和基因干扰的稳定细胞系成功建立。在不同浓度的顺铂处理后,MTT结果表明,IQGAP1高表达细胞活力明显高于对照细胞(P<0.05);而IQGAP1基因干扰细胞活力明显低于对照细胞(P<0.05)。DAPI染色和流式细胞检测结果显示,IQGAP1高表达细胞凋亡率明显低于对照细胞(P<0.05),IQGAP1基因干扰细胞凋亡率明显高于对照细胞(P<0.05)。Western blot结果表明,IQGAP1高表达细胞的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3酶原(pro-cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Procaspase-3)和多聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)原带表达水平均高于对照细胞,裂解PARP(cleaved-PARP)的表达水平低于对照细胞,IQGAP1基因干扰细胞的Procaspase-3和PARP原带表达水平均低于对照细胞。研究结果表明,IQGAP1过表达影响凋亡抑制食管鳞癌细胞对顺铂的敏感性,提示IQGAP1过表达是导致顺铂在食管鳞癌细胞中产生耐药的重要机制。干扰IQGAP1表达后能提高食管鳞癌细胞对顺铂化疗的敏感性,提示IQGAP1可能是提高食管鳞癌化疗敏感性的重要治疗靶点。

关键词： 细胞迁移   HCLS1相关蛋白X-1   IQGAP1蛋白   分子机制  

摘要： 细胞迁移是一个高度协调的过程，需要细胞骨架、细胞膜和细胞外基质粘附之间的协调作用。我们之前的研究表明，HCLS1相关蛋白X-1（HCLS1-associated protein X-1，Hax1）能与微管末端结合蛋白2（End-binding protein2，EB2）相互作用，这种相互作用可调节角质形成细胞中的细胞迁移。然而，对其潜在的调控机制尚不清楚。本研究发现敲低Hax1能显著导致MCF7（E-cadherin阳性）的集体迁移受损，而对MDA-MB-231（E-cadherin阴性）没有影响。通过进一步对Hax1潜在的相互作用分子进行蛋白质谱鉴定研究，发现Hax1能通过与含IQ基序的GTPase激活蛋白1（IQ motif-containing GTPase-activating protein1，IQGAP1）相互作用，连接动态微管，通过微管生长靶向到细胞-细胞粘附处和局灶粘附（Focal Adhesion，FA）来调节细胞迁移。　　IQGAP1是一个多结构域支架蛋白，是通过对细胞内Hax1的结合复合物进行亲和纯化结合液相色谱串联质谱（Liquid Chromatograph Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）技术鉴定而筛出的。免疫共沉淀实验揭示，Hax1的C端区域和IQGAP1的RasGAP C端结构域（RasGAP C-terminus，RGCT）是其相互作用的最关键结合决定因素。Hax1与IQGAP1的相互作用对于MCF7细胞的集体迁移和单细胞迁移都是必不可少的。进一步研究表明，这种相互作用对于维持有效的细胞与细胞间粘附至关重要。敲低Hax1不仅稳定了局灶粘附，还抑制了IQGAP1在FAs中的累积，进而降低了FAs的周转。在MCF7细胞内，使用膜渗透性TAT-RGCT-GFP肽干扰Hax1与IQGAP1的相互作用，使细胞-细胞粘附受损，抑制细胞集体迁移的同时，也能使细胞与细胞外基质的局灶粘附受损，抑制单个细胞的迁移。　　因此，我们的发现揭示了Hax1与IQGAP1之间的一种新的相互作用关系，表明Hax1与IQGAP1的互作在细胞间粘附和局灶粘附的重要作用，进而影响细胞迁移。　　目的：　　1.确定Hax1和IQGAP1的相互作用关系。　　2.揭示两者相互作用对细胞集体迁移的具体分子作用机制。　　3.揭示两者相互作用对单个细胞迁移的具体分子作用机制。　　方法：　　***1对MCF7，MDA-MB-231细胞迁移的影响　　分别对两种细胞进行siHax1转染，待细胞长成单层后，细胞划痕实验检测伤口愈合情况，WB检测Hax1敲低结果。同时活细胞成像检测相同处理细胞的单个细胞运动水平。　　***1特异性结合伙伴的鉴定　　利用亲和纯化结合LC-MS/MS技术，从转染HA-Hax1的HEK293T细胞中分离出抗HA的Hax1与其相互作用蛋白的免疫复合物。纯化后的Hax1相互作用蛋白用SDS-PAGE进行分离，考马斯亮蓝染色检测及质谱分析。通过内源性免疫共沉淀，外源性免疫共沉淀验证Hax1与特异性结合伙伴的结合情况。免疫荧光观察二者在细胞中的共定位情况。　　3.免疫共沉淀鉴定Hax1与IQGAP1的关键结合结构域　　根据Hax1、IQGAP1结构特征，构建不同的截断或缺失突变体。转染293T细胞，通过外源性免疫共沉淀实验，找到Hax1与IQGAP1结合的关键结构域。　　4.证明Hax1是将IQGAP1招募到微管和迁移细胞前沿的关键　　在MCF7细胞中外源性表达HcRed-Hax1，免疫荧光检测其与内源性IQGAP1和微管（Microtubule，MT）三者的共定位情况。通过使用Nocodazole解聚微管、敲低Hax1处理细胞，免疫荧光观察IQGAP1与MTs的共定位情况。MT pulldown实验进一步检测IQGAP1、Hax1、MTs三者的潜在关系。　　***1与IQGAP1相互作用对细胞集体迁移的影响　　在MCF7细胞划痕实验中单独或同时敲低Hax1和IQGAP1，观察划痕伤口的愈合情况，检测Hax1与IQGAP1是否通过相同通路影响细胞集体迁移。Hax1敲低后回补与IQGAP1结合的关键结构域，细胞划痕实验观察相对迁移率是否能补救，检测Hax1与IQGAP1的相互作用对集体迁移的影响。　　WB检测单独或同时敲低Hax1和IQGAP1后，细胞内E-钙粘蛋白（E-cadherin）的表达水平有无变化。免疫荧光观察Hax1敲低后，细胞-细胞粘附处或划痕伤口细胞连接处，IQGAP1与E-cadherin的共定位情况。关键结构域回补实验检测Hax1-CT的回补能否挽救IQGAP1与E-cadherin的共定位。　　***1与IQGAP1相互作用对单细胞迁移的影响　　免疫荧光观察Hax

关键词： 甲状腺癌细胞   ZC3H13   IQGAP1   细胞增殖   甲基化  

摘要： 研究背景和目的:甲状腺癌是内分泌肿瘤中最常见的肿瘤,发病率连年攀升,尽管甲状腺癌在长期生存方面预后良好,但PTC仍有相当高的复发率,晚期PTC中转移性复发的诊断和治疗仍然是一个挑战。基于分子机制的研究有望帮助诊断和治疗PTC。因此,探讨PTC的分子病理机成为甲状腺癌诊断和治疗领域十分重要的问题。m6A甲基化是一种常见的真核生物RNA表观遗传修饰,影响m RNA稳定性、剪接、输出和翻译来调节m RNA动力学,不仅参与调控编码RNAs,也可以修饰长链非编码RNA。该修饰过程是使RNA中腺嘌呤（A）碱基的第6位N元素甲基化,与可以识别RNA上m6A甲基化位点的“甲基化识别酶”YTH家族蛋白1/2/3、胰岛素样生长因子2 m RNA结合蛋白1/2/3和常见的“甲基转移酶”如:甲基转移酶样因子3、RNA结合基序蛋白15等形成的甲基转移酶复合体的催化相关;该过程已经在多篇文章中被报道称与肿瘤的发展预后和治疗相关,而ZC3H13（含有锌指CCCH结构域蛋白13）是负责m6A安装的m6A"writer",与RNA代谢和胚胎干细胞更新有关。ZC3H13在多种肿瘤中发挥着重要的作用,影响肿瘤的发展和诊疗,但是其在甲状腺癌中的作用还未明确。本研究首先通过WB测定了甲状腺癌细胞中ZC3H13的表达水平,并且通过体外实验探索ZC3H13对甲状腺癌细胞增殖侵袭能力的影响。其次通过生物信息学分析,我们发现IQGAP1 m RNA上存在多个m6A甲基化位点,并且通过体外实验进一步验证ZC3H13与IQGAP1 m RNA的关系以及ZC3H13通过IQGAP1 m RNA对甲状腺癌细胞的增殖的影响。最终明确ZC3H13调控IQGAP1m RNA的具体机制。本研究为甲状腺癌的诊断和新型药物靶点提供了新的研究思路。方法:1、临床水平蛋白印迹法检测ZC3H13、IQGAP1及其他相关蛋白表达情况;q RT-PCR检测ZC3H13、IQGAP1的m RNA水平。2、细胞水平分别使用CCK-8测定法、跨井迁移法和侵袭测定法测定甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力变化。3、动物水平建立体内裸鼠异种移植瘤模型,通过LV-NC,LV-ZC3H13,LV-ZC3H13+si-YTHDF2三组体内验证ZC3H13过表达通过降低IQGAP1对肿瘤生长的抑制作用。4、分子水平首先使用Me RIP q PCR评估IQGAP1 m RNA的m6A水平,其次在放线菌素D（一种RNA聚合酶抑制剂）存在下观察到ZC3H13对IQGAP1 m RNA稳定性的影响,通过RIP分析探讨YTHDF2和IQGAP1 m RNA之间的相互作用。5、生物信息学UALCAN和GEPIA网络资源在线分析ZC3H13的表达情况,使用UALCAN研究ZC3H13表达与临床病理的关系。结果:1、ZC3H13在PTC细胞系BCPAP、KTC-1、k1、HTH83和TPC-1中的表达降低。2、ZC3H13的过表达抑制PTC细胞的增殖、侵袭和迁移,而敲除ZC3H13增强了PTC细胞的增殖、侵袭和迁移能力。3、ZC3H13过表达抑制了IQGAP1的表达,但ZC3H13敲除增强了IQGAP的表达。在ZC3H13过表达的PTC细胞中,IQGAP1 m RNA的m6A水平升高,IQGAP1 m RNA的表达随着放线菌酮D处理时间的增加而降低。YTHDF2比Ig G富集了更多的IQGAP1 m RNA,并且YTHDF2的敲除逆转了ZC3H13过表达对IQGAP1 m RNA稳定性的影响。4、ZC3H13的过表达抑制了肿瘤生长,而IQGAP1的过表达可以逆转ZC3H13过表达对肿瘤生长的抑制作用。结论:1、ZC3H13在PTC中低表达2、ZC3H13抑制KTC-1和TPC-1细胞的增殖、侵袭和迁移,反之ZC3H13的敲除促进BCPAP和TPC-1细胞的增殖、侵袭和迁移3、ZC3H13通过m6A修饰调节IQGAP1 m RNA的稳定性4.、ZC3H13过表达通过降低IQGAP1表达水平从而对肿瘤生长的抑制作用

关键词： 细胞角蛋白19   肝细胞癌   非经典WNT通路   β-catenin   IQGAP1  

摘要： 目的: 肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种在组织形态学及分子机制上都具有极大异质性的肿瘤,目前临床上针对HCC的分子分型和靶向治疗仍极具挑战性。其中,细胞角蛋白19（cytokeratin 19,CK19）表达阳性的HCC被认为是一个特殊亚型。CK19作为一个经典的上皮标记物,常用于病理诊断中肿瘤来源的鉴别。在原发性肝癌中,CK19免疫组化染色常被用于区分HCC和肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）。然而,临床研究发现,也有少部分HCC可以异常表达CK19,且其阳性表达与肿瘤转移、耐药、复发相关,与患者预后不良密切相关。文献回顾发现大多数研究都将CK19作为一个干性标记物和恶性转化的结局指标,其阳性表达的原因和作用机制仍不清楚。事实上,细胞角蛋白作为细胞中的“桥梁”分子,常参与细胞骨架重排、应激保护、物质转运等关键的生物学过程,对于细胞存活和恶性转化十分重要。因此,明确CK19在HCC中异常阳性表达的生物学作用及分子机制,积极探索相应的治疗策略,对于改善HCC患者的预后具有极大价值。 材料和方法: 1、HCC中CK19的表达及其与临床病理特征和预后的相关性:收集299例人HCC组织样本,免疫组化检测CK19表达情况,并以阳性率5%为界值分为CK19阴性和阳性组,进行两组间临床病理特征相关性分析及预后分析。 2、干预CK19对HCC细胞系恶性表型的影响:构建敲低及稳定过表达CK19的HCC细胞系,进行细胞体外功能实验（CCK-8、克隆形成、EdU染色、划痕、Transwell、干细胞成球、高内涵成像）及裸鼠体内成瘤实验,观察过表达CK19对HCC细胞生物学行为的影响,WB检测相关分子水平。 3、选择CK19灶阳HCC病例进行空间转录组测序,分析筛选同一组织样本中CK19阴性/阳性区域差异基因;进一步对阴性对照组和CK19过表达组HCC细胞系进行转录组测序,筛选差异基因并进行富集分析确定过表达CK19影响的信号通路,WB、G-LISA等方法验证关键分子及下游信号改变。 4、Co-IP联合质谱分析确定CK19结合蛋白并确定结合位点:利用过表达CK19肝癌细胞系,进行Co-IP实验并进行质谱分析及Duolink PLA实验、免疫荧光染色等,明确与CK19结合的蛋白,并检测两者结合导致的相关蛋白水平或定位改变。 5、肝脏特异性过表达CK19小鼠模型体内验证其功能和机制:构建肝细胞特异性过表达CK19小鼠(Alb-Cre:Krt19LSL/LSL),观察过表达CK19对肝脏的影响;DEN+CCl4诱导Krt19LSL/LSL和Alb-Cre:Krt19LSL/LSL小鼠发生HCC,观察过表达CK19对小鼠肝癌成瘤率及病理学改变;DEN+CCl4诱导Krt19LSL/LSL成瘤后使用AAV-TBG-Cre在HCC细胞中强制性过表达CK19,观察过表达CK19对肿瘤进展情况。 6、药物敏感性实验寻找CK19阳性HCC潜在的治疗靶点:使用CCK-8、流式细胞术等检测经典与非经典WNT通路抑制剂对CK19阳性和阴性细胞的抑制效应;同时建立NOD/SCID同源小鼠移植瘤模型,观察非经典WNT通路抑制剂对CK19阳性HCC细胞耐药的影响。 结果: 1、组化检测299例手术切除HCC组织中CK19蛋白表达发现CK19阳性率为28.4%,以局部灶阳为主（94%）,假腺样型阳性率最高（37.5%）。CK19表达情况与患者临床病理特征进行相关性分析发现,CK19阳性表达与肿瘤大小、PD-L1高表达、瘤栓形成及肿瘤细胞低分化显著相关。生存分析发现肿瘤大小、癌栓形成、有无MVI以及CK19阳性表达与HCC患者更短的总体生存相关,且CK19阳性与更短的无进展生存相关,与较差的索拉菲尼响应相关。多因素COX回归分析提示CK19阳性表达、肿瘤大小、癌栓形成可以作为独立的预后危险因素。 2、使用siRNA和慢病毒包装过表达质粒分别构建敲低和稳定过表达CK19的肝癌细胞系,通过CCK-8、平板克隆、划痕、Transwell、高内涵成像及干细胞成球体外实验,观察到CK19能促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭,而对肿瘤干细胞成球没有明显的促进作用。利用稳定过表达CK19的Huh7细胞系,进一步建立裸鼠皮下及肺转移移植瘤模型,发现过表达组肿瘤细胞较对照组在体内增殖活性更高,成瘤生长更快,且更容易形成肺转移灶。 3、人肝癌组织多重免疫荧光染色发现,CK19阳性细胞与EpCAM、SOX9阳性细胞并不完全重合。圈选42个ROI（22个CK19阳性区域vs.20个CK19阴性区域）进行空间转录组测序,并对439个差异表达基因进行GSEA富集分析,结果提示CK19阳性肿瘤细胞中

关键词： IQGAP1   食管鳞癌   紫杉醇   化疗耐药   铁死亡  

摘要： 目的:1.研究IQGAP1(IQ motif containing GTPase activating protein)在食管鳞癌组织中的表达及与预后的关系;2.研究IQGAP1对紫杉醇耐药的影响;3.研究IQGAP1对食管鳞癌细胞铁死亡的影响;4.研究IQGAP1通过调控食管鳞癌细胞铁死亡影响紫杉醇耐药;5.研究IQGAP1通过靶向YAP1(Yes-associated protein 1)调控铁死亡影响紫杉醇耐药的机制。方法:1.生信及临床样本分析IQGAP1的表达与预后的关系(1)使用TIMER(tumor immune estimation resource)数据库分析IQGAP1基因在泛癌中的表达;通过Xena网站下载TCGA(the cancer genome atlas)数据,分析IQGAP1在食管癌及癌旁正常组织中的差异表达,并绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线评估IQGAP1区分食管癌与癌旁正常组织的能力。(2)收集临床100例食管鳞癌患者的癌组织,69例癌旁正常组织及其临床相关病理特征信息,通过免疫组化检测IQGAP1蛋白在癌和癌旁正常组织中的表达差异;绘制ROC曲线评估IQGAP1区分食管鳞癌与癌旁正常组织的能力;并分析其表达水平与临床病理特征的关系;进一步根据生存数据绘制K-M(Kaplan-Meier)生存曲线和森林图,通过COX回归分析IQGAP1表达与预后的关系。***1对紫杉醇诱导的食管鳞癌细胞存活和死亡的影响(1)通过将GFP-IQGAP1质粒和对照组空载质粒稳定转染到EC9706细胞中构建IQGAP1高表达细胞系,IQGAP1短发夹RNA(small hairpin RNA,sh RNA)质粒和阴性对照组空载质粒稳定转染到KYSE150细胞中构建IQGAP1基因干扰细胞系,并采用Western blot实验鉴定IQGAP1的表达水平。(2)采用不同浓度的紫杉醇分别处理IQGAP1高表达和对照细胞,以及基因干扰细胞和对照细胞,MTT实验检测食管鳞癌细胞活力;克隆形成及碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色实验分别检测食管鳞癌细胞增殖和死亡情况。***1对食管鳞癌细胞铁死亡的影响使用GSEA(gene set enrichment analysis)软件分析食管鳞癌中IQGAP1基因的富集通路;通过二氢乙锭(dihydroethidium,DHE)染色检测IQGAP1高表达或基因干扰对食管鳞癌细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的影响;通过丙二醛(malondialdehyde,MDA)和还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)试剂盒分别检测IQGAP1对食管鳞癌细胞MDA和GSH水平的影响;通过Western blot实验检测IQGAP1对食管鳞癌细胞铁死亡相关蛋白谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、溶质载体家族7成员11(recombinant solute carrier family 7,member 11,SLC7A11)表达水平的影响。***1通过调控食管鳞癌细胞铁死亡影响紫杉醇耐药的研究采用铁死亡诱导剂(RSL3)或铁死亡抑制剂(ferrostain-1,Fer-1)作用于紫杉醇诱导的IQGAP1高表达或基因干扰细胞系,并通过上述方法分别检测食管鳞癌细胞存活、增殖和死亡情况,以及ROS、MDA、GSH水平和铁死亡相关蛋白的表达水平。***1通过靶向YAP1调节铁死亡影响紫杉醇耐药的机制首先通过Western blot检测IQGAP1高表达或基因干扰对食管鳞癌细胞YAP1表达的影响,TIMER数据库分析IQGAP1与YAP1在食管癌中的表达相关性;随后采用YAP抑制剂(Verteporfin,VP)作用于IQGAP1高表达细胞系,通过Western blot实验检测VP对紫杉醇干预的IQGAP1高表达食管鳞癌细胞中YAP1表达的影响;并通过上述方法分别检测食管鳞癌细胞存活、增殖和死亡情况,以及ROS、MDA、GSH水平和铁死亡相关蛋白的表达水平。结果:1.生信及临床样本分析IQGAP1的表达与预后的关系(1)TIMER数据库分析显示,IQGAP1在胆管癌(cholangiocarcinoma,CHOL),结肠癌(colon adenocarcinoma,COAD),食管癌(esophageal carcinoma,ESCA),头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSC),胃癌(stomach adenocarcinoma,ST

关键词： Biochemistry   Cell biology  

摘要： The small GTPase Cdc42 is an integral component of the cytoskeleton, and its dysregulation leads to pathophysiological conditions, such as cancer. Binding of Cdc42 to the scaffold protein IQGAP1 stabilizes Cdc42 in its active form. The interaction between Cdc42 and IQGAP1 enhances migration and invasion of cancer cells. Disrupting this association could impair neoplastic progression and metastasis;however, no effective means to achieve this has been described. Here, we screened 78,500 compounds using a homogeneous time resolved fluorescence-based assay to identify small molecules that disrupt the binding of Cdc42 to IQGAP1. From the combined results of the validation assay and counter-screens, we selected 44 potent compounds for cell-based experiments. Immunoprecipitation and cell viability analysis rendered four lead compounds, namely NCGC00131308, NCGC00098561, MLS000332963 and NCGC00138812, three of which inhibited proliferation and migration of breast carcinoma cells. Microscale thermophoresis revealed that two compounds bind directly to Cdc42. One compound reduced the amount of active Cdc42 in cells and effectively impaired filopodia formation. Docking analysis provided plausible models of the compounds binding to the hydrophobic pocket adjacent to the GTP binding site of Cdc42. In conclusion, we identified small molecules that inhibit binding between Cdc42 and IQGAP1, which could potentially yield chemotherapeutic agents.

关键词： IQGAP1   shRNA   liver cancer   in vivo   mouse  

摘要： BackgroundLiver cancer is the deadliest malignancy among common tumors. It is the top cause of cancer-related deaths in Egypt, and it is characterized by increasing occurrence among the population. The objective of this study was to determine the outcome of pre-treatment of IQGAP1-shRNA on induced mouse hepatocellular carcinoma model and evaluate the potency of this IQGAP1-shRNA plasmid to recover hepatic cancer as a new tool of cancer therapy. Therefore, we will use RNA interference (RNAi) technology to silence IQGAP1 oncogene to completely recover the chemically induced models for hepatic cancer by designing short RNAi specific for IQGAP1 gene in HCC cells in vivo and construct new vectors suitable for this purpose. We assigned mice into three groups: the first negative control group (NC) was injected with saline, the second control group was injected with shRNA (shNC), the third positive control group was injected with diethylnitrosamine (DENAA), and the fourth group was treated with the IQGAP1-shRNA prior to its exposure to DENA. ResultsOur results revealed that the treated group with IQGAP1-shRNA with DENA developed very few cases of hepatic cancer when compared with the positive control group. The positive control group exhibited significant increases in the liver function level as well as a decrease in serum albumin levels when compared to both the treated and the negative control groups. The altered levels of the serum alpha-fetoprotein as well as of the tumor necrosis factor-alpha, and interleukin-4 in DENA-treated mice were significantly ameliorated by IQGAP1-shRNA administration. Flow cytometer analyses have indicated that the silencing of IQGAP1 cannot significantly modulate DENA-induced apoptosis in the circulating blood cells. Moreover, the elevated mRNA expression levels of IQGAP1, IQGAP3, KRas, HRas, interleukin-8, nuclear factor kappa B, caspase-3, caspase-9 and Bcl-2, were significantly decreased by the IQGAP1-shRNA treatment. However, the IQGAP2,

关键词： 肌萎缩侧索硬化症   脊髓   RAC1   RAC3   IQGAP1   SOD1^(G93A)突变小鼠  

摘要： 目的:检测Ras相关C3肉毒菌毒物底物1(RAC1)、Ras相关C3肉毒菌毒物底物3(RAC3)和IQ结构域GTP酶活化蛋白1(IQGAP1)在SOD1^(G93A)突变小鼠脊髓中的表达变化。方法:选取SOD1^(G93A)突变小鼠与野生型(WT)小鼠作为动物模型,将其分为症状前期(出生70 d)、症状早期(出生95 d)、症状中期(出生108 d)和症状晚期(出生122 d)4个组别,利用RT-PCR检测小鼠脊髓中RAC1、RAC3和IQGAP1 mRNA表达,利用Western Blot和免疫荧光染色检测RAC1、RAC3和IQGAP1蛋白表达与定位。结果:与同窝WT小鼠相比,RAC1 mRNA表达水平在出生不同时间点SOD1^(G93A)突变小鼠脊髓中无明显变化;在出生95、108和122 d RAC3 mRNA均明显降低,IQGAP1 mRNA均明显升高;RAC1、RAC3和IQGAP1蛋白在出生95、108和122 d表达均明显降低;RAC1、RAC3、IQGAP1免疫阳性细胞主要分布在脊髓前角,即运动神经元所在的部位,RAC1、RAC3和IQGAP1均与神经元特异性核抗原(NeuN)标记的神经元共表达。结论:SOD1^(G93A)突变小鼠脊髓中RAC1、RAC3和IQGAP1的表达异常与肌萎缩侧索硬化症(ALS)的发病密切相关。