关键词：
IQGAP1
血管紧张素Ⅱ
足细胞
凋亡
细胞外调节蛋白激酶1/2
摘要：
研究背景：
肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS)激活参与慢性肾脏疾病的发生发展,若及时将其阻滞,可以减轻蛋白尿,减缓终末期肾脏疾病的进展。血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)作为RAAS主要效应分子,其作用除直接改变肾小球血流动力学外,还通过多种非血流动力学机制发挥其肾脏损伤作用,如氧化应激、细胞外基质聚集、炎症因子的产生、细胞骨架的紊乱、细胞周期失常以及凋亡等。足细胞作为一种终末分化的上皮细胞,是肾小球滤过屏障的重要组成部分,其损伤或丢失在蛋白尿的发生以及肾小球疾病的进展中发挥重要作用。本实验组前期研究已经证实,Ang Ⅱ可诱导足细胞凋亡。但其具体分子机制仍未完全清楚。近期研究发现支架蛋白IQ domain GTPase-activating protein1(IQGAP1)在人体内广泛表达,且在多种细胞的凋亡过程中发挥重要作用。但IQGAP1是否参与Ang Ⅱ诱导的足细胞凋亡尚未见报道,本研究旨在探讨IQGAP1在Ang Ⅱ诱导足细胞凋亡中的作用以及可能的分子机制。为足细胞病理生理研究及IQGAP1分子生物学功能的深入发掘提供新的理论依据。
方法：
第一部分：36只SPF级雄性Wistar大鼠随机数字法分为正常对照2周组、生理盐水输注2周组、Ang Ⅱ输注2周组、正常对照4周组、生理盐水输注4周组和Ang Ⅱ输注4周组,每组大鼠6只。每周末测量大鼠血压及24h尿蛋白量。分别于14天、28天处死动物取肾,PAS染色观察肾组织病理学改变,电镜观察足细胞超微结构改变,TUNEL检测足细胞凋亡。免疫组化、免疫荧光、real-time PCR、Western blotting检测IQGAP1在肾小球的表达及分布。Western blotting检测肾小球半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)蛋白表达。采用偏相关分析探讨IQGAP1蛋白表达量和caspase-3活化量之间的相关性。
第二部分：体外培养条件永生性小鼠足细胞,未分化足细胞用含10U/ml IFN-γ的培养基在33℃培养箱中传代培养,然后用不含IFN-y的培养基在37℃培养箱中诱导分化10-14d用于后续实验。药物干预前无血清培养基同步化12h。(1)随机分组：正常对照组、10-8M AngⅡ刺激细胞不同时间(1h、3h、6h、12h、24h)以及不同浓度(10-12M,10-10M,10-8M,10-6M) AngⅡ刺激细胞6h组。(2)采用流式细胞术以及Hoechst-33258染色检测足细胞凋亡率。(3)免疫荧光、real-time PCR及Western blotting检测足细胞IQGAP1的表达及分布。(4)转染IQGAP1siRNA,观察其对AngⅡ诱导足细胞凋亡的影响。
第三部分：体外培养条件永生性小鼠足细胞,未分化足细胞用含lOU/ml IFN-γ的培养基在33℃培养箱中传代培养,然后用不含IFN-y的培养基在37℃培养箱中诱导分化10-14d用于后续实验。药物干预前无血清培养基同步化12h。(1)丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)通路(包含P38、JNK和ERK1/2三条主要通路)抑制剂SB202190, SP600125或U0126预处理足细胞,观察其对IQGAP1蛋白表达及AngⅡ诱导足细胞凋亡的影响。(2)转染IQGAP1siRNA,观察其对MAPK信号蛋白磷酸化水平的影响。(3)采用免疫共沉淀法研究IQGAP1与ERKl/2结合水平的变化。
结果：
第一部分：(1)AngⅡ输注组大鼠血压升高,实验第14天达峰值并维持在较高水平；第7天时便出现显著蛋白尿,且随时间的延长尿蛋白量持续增加,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)AngⅡ输注组出现轻度系膜细胞增殖和系膜基质增加,生理盐水输注组和正常对照组均未见明显病理改变。(3)透射电镜观察足细胞显示,AngⅡ输注2周组及4周组均可见明显的足突融合、消失,并伴有染色质凝集以及核固缩、核碎裂等足细胞凋亡的表现。生理盐水输注组和正常对照组均未见明显改变。(4)TUNEL显示,AngⅡ输注后足细胞凋亡显著增加；免疫印迹发现,AngⅡ输注后大鼠肾小球caspase-3活化明显增加(P<0.05)。(4)正常对照组IQGAP1沿毛细血管袢线性分布,与nephrin共定位表达,AngII输注后IQGAP1表达量显著增加(P<0.05),且其蛋白表达与caspase-3活化量呈显著正相关(r=0.689,P<0.05)。
第二部分：(1)AngⅡ以剂量和时间依赖方式诱导足细胞凋亡。(2)正
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