关键词： Ga   Ws   gpa1-1   gpa1-2   抗氧化酶系   丙二醛  

摘要： 对拟南芥野生型Ws及其G蛋白α亚基突变体gpa1 1和gpa1 2的形态特征进行了比较,并研究了低温处理对其抗氧化酶系活力和丙二醛含量的差异。结果表明,与野生型相比,两突变体形态上发生了较大的变化,并表现出对低温反应敏感性的降低。低温12h时,野生型的SOD酶和POD酶活迅速发生变化,丙二醛含量迅速升高,而两突变体变化较平缓。

关键词： 拟南芥   AtRGS1蛋白   脱落酸   糖   突变体   转基因植株   转基因细胞  

摘要： 本研究以拟南芥野生型Col-0、突变体rgs1-2和gpa1-3、悬浮培养细胞系为材料,通过突变体分析、转基因植株构建、转基因细胞系构建和原生质体瞬时表达等技术,用分子生物学、分子遗传学、生物化学等方法研究了AtRGS1蛋白在拟南芥信号转导网络途径中的作用。取得了以下主要研究结果: 1、分析突变体rgs1-2的生理特性表明: (1)突变体rgs1-2种子萌发不需要春化作用,与野生型相比,后熟作用对rgs1-2种子萌发促进作用不明显;rgs1-2种子萌发对葡萄糖和蔗糖的抑制作用不敏感,gpa1-3对葡萄糖和蔗糖的抑制作用表现为超敏感。且这种抑制作用与糖的渗透胁迫无关,而是由糖介导的信号转导途径引起的,且不依赖于已糖激酶途径;rgs1-2种子萌发对ABA低敏,gpa1-3对ABA超敏。不同基因型种子萌发对ABA响应差异主要是由于内源ABA水平的差异;rgs1-2种子内源ABA水平较低,ABA生物合成酶ABA2和NCED3的基因表达水平低,葡萄糖处理对rgs1-2两基因表达水平影响不显著。推断葡萄糖对种子萌发的抑制效应是通过提高内源ABA含量,且RGS1在此途径中作为一个重要的信号分子起调节作用。 (2)葡萄糖与蔗糖抑制了Col黄化苗下胚轴生长,且葡萄糖抑制作用更明显,但不抑制rgs1-2黄化苗下胚轴生长;10%蔗糖作用下幼苗依然保持生长,6%甘露醇对幼苗主根生长作用比种子萌发更明显,表明糖对幼苗生长过程与种子萌发过程有着不同的调节机制。 (3)植株水平,rgs1-2叶片气孔比Col大,气孔密度比Col小,离体叶片失水速率比Col快,植株表现比Col不耐旱。 2、本实验用TOPO克隆的方法构建了35S-RGS1过表达体系,并分析了转基因植株生理特性: (1)RT-PCR结果表明,转基因植株内RGS1在不同组织器官表达都有所增加。过表达植株比野生型表现出一定的生长抑制和花期延长。 (2)转基因种子萌发表现出对ABA超敏感性,在1μmol L-1 ABA上萌发的转基因幼苗绿苗率较低,在2μmol L-1 ABA上生长的转基因植株幼苗主根生长受明显抑制,RGS1过表达也增加了植株对ABA的敏感性。 (3)转基因植株表现出高的抗旱能力,且能提高干旱复水后植株成活率和开花率。转基因植株叶片气孔比Col小,密度比Col大,离体叶片失水速率比Col低。 (4)对ABA和干旱响应和/或调节的基因分析结果表明,RGS1过表达不同程度提高或降低了相关基因的表达水平。 3、建立了拟南芥悬浮培养细胞体系并构建了转基因细胞系,结合RGS1-GFP融合蛋白表达技术证明了RGS1蛋白定位于细胞膜,但ABA和其它处理可以改变RGS1的亚细胞定位,western blotting分析结果表明不同胁迫处理可以不同程度诱导AtRGS1蛋白表达。

关键词： 异三聚体G蛋白   花粉萌发   生长发育   细胞外钙调素   信号转导   拟南芥  

摘要： 我室前期的实验结果曾证实花粉细胞质膜上存在异三聚体G蛋白，药理学等实验证实植物异三聚体G蛋白参与了花粉萌发及花粉管伸长生长过程的调节；且位于质膜内侧的异三聚体G蛋白可能传递细胞外钙调素信号，即细胞外钙调素可能是异三聚体G蛋白参与调控的质膜外信号之一。本论文利用异三聚体G蛋白相关突变体及其超表达转基因拟南芥为材料，设计实验进一步从分子水平上提供直接证据证实异三聚体G蛋白参与了拟南芥花粉萌发和花粉管生长的调节，参与了细胞外钙调素调节花粉萌发及花粉管生长的跨膜信号转导，以及叶片、长角果发育，花粉的生成等生长发育过程的调节；且异三聚体G蛋白不同亚基对上述各生长发育过程的调节可能起着相同或不同的作用。 实验中，以拟南芥GPA1基因缺失突变体（gpa1-1，gpa1-2），AGB1基因的突变体（agb1-1）及超表达Gα的转基因拟南芥（wGα，cGα）花粉为试材，研究花粉萌发及花粉管生长。结果表明：体外实验中gpa1突变体花粉的萌发率及花粉管生长速率均低于野生型花粉，而超表达Gα花粉的萌发率及花粉管生长速率则高于野生型及空载体对照；Gβ突变体agb1-1与野生型花粉的萌发率及花粉管生长速率差异不大。体内实验中，gpa1突变体柱头上实际萌发的花粉粒数少于野生型，超表达植株则多于野生型和空载体对照；agb1-1突变体柱头上实际萌发的花粉粒数与对照比较差异不显著。上述结果从分子水平上提供直接的证据证实，异三聚体G蛋白α亚基参与了拟南芥花粉萌发和花粉管生长的调节；而G蛋白β亚基可能不参与拟南芥花粉萌发和花粉管生长的调节。 实验中我们用激光共聚焦显微镜测定了上述材料花粉粒细胞中游离钙离子水平的差异。结果表明，gpa1突变体花粉粒细胞中游离钙离子水平低于野生型花粉；Gα超表达植株花粉粒细胞中游离钙离子浓度则比野生型和空载体对照要高，而空载体对照与野生型花粉粒细胞中游离钙离子浓度没有差异。证实细胞中的游离钙离子参与了Gα蛋白调节的花粉萌发过程，即Gα蛋白对花粉萌发的调节有可能是进一步通过调控质膜钙通道和调控PLC活性动员下游胞浆中钙离子水平来实现的。 两种外源钙调素(花椰菜和拟南芥Ⅱ亚型，10-7M)处理对野生型和Gα蛋白突变体 博士学位论文（中文摘要） gPal的花粉萌发和花粉管生长都有促进作用，只是促进幅度不同，即对野生型花粉萌发 率和花粉管生长的促进幅度高于突变体花粉;这表明Ga蛋白参与了细胞外钙调素调节花 粉萌发及花粉管生长的跨膜信号转导。 外源钙调素（花椰菜和拟南芥11亚型，10一7M）处理能够提高野生型及gPol缺失突 变体中的游离钙离子水平，但对野生型花粉细胞游离钙离子水平的激活效应高于gPal缺 失突变体。从野生型和突变体花粉细胞中游离钙离子水平对外源钙调素的反应能力看，G 蛋白参与了花粉萌发过程中外源钙调素的跨膜信号转导，且进一步通过其下游的钙信使 来调控。 实验中我们跟踪观察了多代异三聚体G蛋白a亚基超表达转基因植株及a，p亚基缺 失突变体的表型特征，发现突变体的叶片宽度大于对应的野生型，叶片长度，叶柄长度 及莲座直径小于野生型，而超表达植株的上述某些特征与突变体相反;gp时突变体的长 角果长度，花梗柄部长度大于野生型，而超表达Ga植株种英则略小于对照;gPal突变 体长角果尖端未出现咭乙I突变体的特征:gPal，口gbl突变体花粉生成量大于野生型，而 超表达Ga植株的花粉生成量则略小于对照。上述初步研究结果还表明，异三聚体G蛋 白除了参与花粉萌发和花粉管伸长调节外，还参与调节叶片的发育，长角果的发育，花 粉的生成等。可见异三聚体G蛋白在植物体的生长发育过程中发挥着极其重要的作用; 且在拟南芥不同生长发育的调控过程中，异三聚体G蛋白的各个亚基可能在某一过程中 共同起调节作用，也有可能以单体的形式各自参与不同发育过程的调节。