关键词： 拟南芥   抗逆性   水稻   转基因技术  

摘要： 研究表明，拟南芥很多种基因的过量表达能引起拟南芥株型、熟期、产量的改变，部分基因能增加生长速度和生物量，提早开花，增强抗逆性。为了了解这些基因在农业生产上的应用价值，有必要将这些基因转化到水稻等农作物中进行进一步异源基因表达评价。GTP结合蛋白(GTP-bindingproteins)，简称G蛋白，是活细胞内一类具有重要生理调节功能的蛋白质。此类蛋白由于其生理调节功能有赖于与三磷酸鸟苷(GTP)的结合与水解GTP的活性而得名。现已经证明G蛋白参与细胞生长与分化、细胞骨架、膜囊泡与蛋白质运输的调节过程，在细胞信号转导过程中有着非常重要的调节作用。\n Atlg09630是拟南芥中推测与单聚体G蛋白中的Rab亚类蛋白合成相关的基因，本论文研究利用农杆菌介导法将其转入水稻得到25株转基因水稻(OsAtRab)，在对转基因植株进行除草剂标记筛选时，所有T0植株叶片均抗除草剂,T1、T2代苗发生了接近3:1比例的抗感分离。\n 转基因水稻OsAtRab一个明显的表现是育性下降，通过调查与分析，其主要原因有：花粉育性低，部分花粉败育；鞘包穗现象：部分植株出现开花时颖壳不打开及花丝不伸长等现象降低了受精率，影响了结实；部分植株的花粉管的萌发受阻；还有其他如颖壳退化、无花粉、三个柱头、七枚花药、雄蕊短于柱头等变异。\n 转基因水稻OsAtRab的株高是野生型植株的70％左右，其倒4节间长比对照Kitaake长，而其他三节间长均按比例比对照Kitaake短.

关键词： 拟南芥   叶绿体   转运肽   融合蛋白   亚细胞定位  

摘要： 利用反向遗传学研究方法对1个预测的拟南芥叶绿体未知功能基因At3g61870编码蛋白进行了亚细胞定位研究.通过克隆At3g61870基因5′端长229 bp的DNA片段,与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建重组表达载体pMON530-CP-TP-GFP,经农杆菌介导转化拟南芥.转基因植株的叶肉细胞经激光共聚焦显微镜观察,叶绿素自发荧光与GFP荧光共定位于叶绿体中.结果表明,未知功能基因At3g61870编码的蛋白质为叶绿体蛋白质.

关键词： 异三聚体G-蛋白   突变体   形态  

摘要： 对拟南芥异三聚体G蛋白α-亚基突变体gpa1-3、β-亚基突变体agb1-2及α和β亚基双突变体gpa1agb1与相应的Col野生型的形态特征比较发现,异三聚体G蛋白的突变引起根、叶、生殖器官等的表型发生改变,gpa1-3的叶片宽椭圆形,略大于Col,叶片下表皮细胞显著大于Col、agb1-2及gpa1agb1,果柄也显著长于其它三类,但侧根发生及长角果形态与Col无显著性差异;agb1-2的表型与gpa1agb1的表型相似:叶片小而近圆形、叶缘平滑,侧根发达,长角果较短,这些特征均显著区别于Col及gpa1-3.结果表明,异三聚体G-蛋白在拟南芥的多个生长发育过程中发生作用,且α-亚基和β-亚基在叶、根、花器官等发育过程中的作用不同.

关键词： 拟南芥   异三聚体G蛋白   亚基   纯化  

摘要： 以拟南芥哥伦比亚Columbia（Col—O）野生型悬浮培养细胞为材料，采用超声波破碎、匀浆、离心、40％～60％饱和度硫酸铵分步沉淀、Sephadex G-25脱盐、DEAE—Sepharose Fast Flow离子交换、Sephadex G-200凝胶过滤，最后经过Sepharose CL-6B得到纯化的目的蛋白，蛋白收率为0．097％。纯化的蛋白质经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定显示为一条带，经Western blotting证实为G蛋白。把经Native—PAGE鉴定的蛋白质的条带回收，进行SDS—PAGE显示有3条带。一条是Gα亚基，其分子量为60kDa左右；另外2条带分子量为45kDa和35kDa，可能是β、γ亚基，初步证实拟南芥中存在异三聚体G蛋白。G蛋白提取方法的建立为在基因突变型拟南芥中G蛋白功能的研究奠定基础。

关键词： 拟南芥   根系发育   侧根发生   异三聚体G蛋白   生长素  

摘要： 根系是植物体的重要组成部分,主要执行着吸收土壤养分和水分的功能。侧根的发育及形态与根系建成密切相关,生长素对侧根的发育具有重要的调节作用。有研究表明,异三聚体G蛋白在生长素介导的拟南芥侧根发育过程中发挥作用,但是其作用机理尚不明晰。本文以拟南芥异三聚体G蛋白相关亚基突变体及过表达的转基因植株与悬浮培养细胞系为材料,应用植物解剖学、植物生理学、分子遗传学等研究手段,探讨了异三聚体G蛋白在生长素介导侧根发育中的作用机理。研究结果表明: 1. G蛋白相关亚基突变显著影响根系发育表型。agb1-2及gpa1agb1幼苗的侧根发生数均极显著多于野生型(Col),主根长度也显著长于Col。gpa1-3与Col间主根长度无显著性差异,但是gpa1-3幼苗的侧根发生数显著少于Col。 2. G蛋白突变体的侧根发生依赖于生长素途径的调节。抑制生长素极性运输条件下,外源生长素可显著增加突变体及野生型的侧根发生数。但各基因型对生长素诱导侧根发生的敏感性存在差异,与Col相比,gpa1-3侧根发生对生长素低敏感,agb1-2及gpa1agb1对生长素超敏感。 3.对种子萌发后2-4d内各基因型侧根原基发育时期统计结果表明,萌发后2d,各基因型侧根原基开始发生,gpa1-3与agb1-2的侧根原基数差异不明显,但均显著高于Col。萌发后4d,当茎端生长素开始向根部运输时,gpa1-3幼苗的侧根及侧根原基总数与Col类似,但是显著低于agb1-2和gpa1agb1。对侧根原基分布时期观察表明,gpa1-3的侧根及侧根原基约70%处于侧根发生的第3-5期,而agb1-2和gpa1agb1的侧根原基主要集中于第5-7期(agb1-2,55%;gpa1agb1,72%),Col的侧根原基在侧根发育的各个阶段均匀分布。 4.种子萌发4d时去除根茎交界处以上部分处理显著抑制各基因型的侧根发生,且各基因型间侧根发生数无显著差异,说明各基因型的侧根发生均依赖于地上部茎端合成的生长素。侧根发生早期(萌发后4d)去根尖处理促进了各基因型的侧根发生,但对agb1-2侧根发生影响较小,侧根发生数的增加显著低于Col。种子萌发后7d对幼苗去根尖处理的效应则相反,gpa1-3侧根发生数的增加显著低于Col。根据影响侧根发生的根部生长素运输特征分析,根部生长素的向基运输是影响G蛋白突变体侧根发生差异的主要因素。 5.对GPA1和AGB1过表达转基因幼苗G蛋白亚基定位和侧根发育特征的研究结果表明,GPA1主要定位在根尖顶端及中柱部位,而AGB1在整个根部均有分布。GPA1过表达植株的侧根发生数目较野生型显著增加,AGB1过表达植株的侧根发生数与野生型相比无显著性差异。结合G蛋白突变体根系发育特征,根据G蛋白信号转导模式,推测AGB1在侧根发育过程中具有负调节作用。对种子萌发4d内过表达株系及野生型的侧根发育时期分布规律分析表明,在萌发第4d时AGB1过表达幼苗的侧根原基主要分布于第3-4期,GPA1过表达幼苗的侧根原基总数高于Col野生型,其增加的侧根原基主要集中在第3-5期,说明GPA1过表达有利于促进侧根原基的早期形成及分裂过程。 6.不同基因型悬浮培养细胞对2,4-D和NAA的响应存在显著的差异。用2μM 2,4-D/NAA处理悬浮培养细胞系,agb1-2和GPA1过表达悬浮细胞对2,4-D促进的细胞分裂不敏感,对NAA诱导的细胞伸长过程超敏感。RT-PCR结果表明,在无外源生长素处理条件下,agb1-2悬浮细胞中细胞分裂周期素基因AtCYCD4;1的表达量相对较高。NAA处理促进了agb1-2和GPA1过表达悬浮细胞中与细胞伸长相关的ABP1的表达。根据2,4-D和NAA进出细胞机制的不同,可以推测AGB1突变体及GPA1过表达细胞系具有较强的生长素极性输出能力。 7.对不同基因型的根系向重性反应研究表明:突变体agb1-2和过表达GPA1植株对向重性刺激的反应显著强于Col和gpa1-3,而过表达AGB1植株的向重性反应显著低于Col。 8. Real-time PCR研究结果表明,agb1-2及GPA1过表达植株根部生长素极性输出载体PIN1的表达量显著增加。 根据以上研究结果,认为G蛋白突变体的侧根发生差异是由于影响了根部生长素的向基运输途径,AGB1对这一过程具有负调节作用。AGB1突变促进了根系中生长素极性输出载体PIN1转录水平的表达,从而负调节根系中生长素的向基极性输出途径,促进侧根大量发生。

关键词： 拟南芥   异三元G蛋白   THF1调控   叶绿体   发育机理   PhyA   信号转导  

摘要： 异三元G蛋白，简称G蛋白，在真核生物感知细胞内外环境变化过程中起着重要的作用。虽然早期药理学实验结果表明植物G蛋白信号能够调节叶绿体发育，但由于G蛋白亚基缺失突变体都没有表现出明显的叶绿体发育缺陷，关于G蛋白促进叶绿体发育的相关研究结果一直受到人们的质疑。 最近研究发现，拟南芥G蛋白α亚基(GPA1000)可以和一个定位于质体的蛋白——THF1相互作用，并且THF1缺失突变体有明显的叶绿体发育缺陷表型，子叶转绿减慢，真叶呈现花斑。因此，本研究利用thf1突变体，从遗传学和分子生物学的角度探讨了GPA1与叶绿体发育的关系。研究结果表明活性态的GPA1(eGPA1)能够恢复thf1斑叶的表型，促进叶绿体的发育。进一步研究发现过表达eGPA1同样也能够恢复ftsh2(var2)突变体的花斑表型。这些结果为G蛋白与叶绿体发育的关系提供了可靠的遗传学和分子生物学方面的证据。 基于THF1蛋白与叶片花斑之间的关系，利用thf1突变体子叶具有花斑特征的特性，对THF1蛋白缺失所造成的类囊体发育缺陷的发生时期以及发生机理进行了探讨。结果显示，在thf1突变体黄化幼苗中，叶绿素前体原叶绿素酸酯(Pchlide)和其还原酶(POR)的含量大量减少，部分质体中缺少原片层体(PLB)。δ-氨基乙酰丙酸(ALA)和2，2'-联吡啶(BP)培育实验结果显示thf1突变体中异常质体的Pchlide合成途径是通的，说明PLB缺陷是由其它因素造成的。 本研究还发现了一种PhyA依赖的新表型——远红光诱导的下胚轴细胞死亡，并且发现远红光诱导的下胚轴细胞死亡与G蛋白信号转导途径相关。实验结果显示α亚基缺失突变体gpa1细胞死亡率低于WT，而β亚基缺失突变体agb1细胞死亡率高于WT，表明GPA1和AGB1相互拮抗。进一步的研究结果表明，PhyA依赖的下胚轴细胞死亡与Pchlide积累有关，白光诱导Pchlide产生活性氧(ROS)可能是细胞死亡发生的原因。H2O2体外处理能够模拟下胚轴细胞死亡的表型，而agb1突变体对H2O2体外处理比较敏感，表明G蛋白对ROS胁迫信号有响应。 综上所述，本研究发现了G蛋白调控叶绿体发育的证据，并为进一步深入研究G蛋白信号通路调控叶绿体发育的分子机理奠定了基础。

关键词： 拟南芥   G蛋白   巴斯德毕赤酵母   GST pull down   细胞定位  

摘要： 异三聚体GTP结合蛋白(heterotrimeric GTP-binding proteins, G蛋白)是活细胞内一类具有重要生理调节功能的蛋白质。自从上世纪70年代初在动物细胞中首先发现G蛋白的存在以来,有关G蛋白的研究发展迅速。对于植物G蛋白的研究于80年代后期才开始,处于相对滞后阶段。拟南芥是一种重要的模式植物,对拟南芥异三聚体G蛋白功能和作用机制的研究对于阐明其他植物中G蛋白的功能和作用机制有着重要的参考意义。而一直以来研究较多的是异三聚体G蛋白的主要功能亚基Gα,通常认为Gβγ的功能只是作为α亚基的负调节器并将其固定于细胞质膜上。最近的研究认为,Gβγ二聚体是细胞信号系统中的主要纽带之一,是调节代谢和生长信号传递的信号系统中的重要功能性亚基。 本实验首先从拟南芥植物中分离克隆了G蛋白的β和γ亚基,通过转基因手段成功地将克隆的基因转化到巴斯德毕赤酵母中。利用巴斯德毕赤酵母表达体系成功表达了拟南芥异三聚体G蛋白的β和γ亚基。在本实验培养条件下,β、γ1和γ2亚基的表达量分别为483.3μg/mL、365μg/mL和359.7μg/mL。 另外,以拟南芥野生型Col、G蛋白β亚基功能缺失突变体agb1-2, RACK1蛋白功能缺失突变体rack1以及G蛋白β亚基和RACK1蛋白功能都缺失的双突变体agb1-2/rack1种子为材料,研究AGB1和RACK1蛋白在拟南芥种子萌发过程中的作用,结果表明它们共同参与了拟南芥种子萌发过程中对春化作用、糖和激素的响应。 经GST pull down技术研究证实两者之间不存在相互作用,说明它们存在各自的作用途径。最后,利用Topo克隆和Gateway亚克隆技术转化RACK1-GFP到农杆菌中,并分别用PEG-Ca溶液和农杆菌介导转化重组质粒到Col原生质体和悬浮培养细胞中,利用荧光显微镜观察RACK1蛋白在原生质体和细胞中的定位,进而分析其功能。

关键词： 拟南芥   G蛋白   细胞分裂   细胞伸长   生长素  

摘要： 本文以拟南芥Col悬浮细胞系、Col为遗传背景条件下的GPwA1过表达细胞系、AGB1过表达细胞系以及AGB1突变体agb1-2悬浮培养细胞系为材料,结合外源2,4-D/NAA处理,探讨了G蛋白在拟南芥悬浮细胞分裂和伸长中的作用,取得了以下主要实验结果。 1.使用不同浓度的2,4-D/NAA处理拟南芥Col悬浮细胞的结果表明,2μM 2,4-D对拟南芥的细胞分裂过程有显著的促进作用,悬浮细胞中GPA1和AGB1的表达量增加,细胞的长宽比显著小于无外源生长素处理。2μM的NAA对拟南芥悬浮细胞的分裂促进作用较弱,但显著促进细胞的伸长生长,NAA诱导条件下GPA1的表达量未见有显著变化,但AGB1的表达量显著增加。 2.用RT-PCR和TOPO克隆的方法从野生型拟南芥(Col)中克隆了GPA1和AGB1基因,将克隆的基因序列与35S-启动子和报告基因(GFP)相融合构建了过表达载体,通过农杆菌介导的方法获得了GPA1和AGB1基因过表达的拟南芥转基因悬浮细胞系。荧光定位结果表明,GPA1和AGB1主要定位于质膜部分,原生质体瞬时表达定位结果与细胞水平定位结果一致。 3.无外源生长素处理条件下,过表达AGB1细胞系的细胞分裂指数显著低于Col。AGB1突变体细胞系和过表达GPA1细胞系的细胞分裂指数显著高于Col,细胞分裂周期素基因AtCYCD4;1的表达量相对较高,但是AGB1突变体细胞系和过表达GPA1细胞系对2,4-D诱导的细胞分裂过程不敏感。 4.无外源生长素处理条件下,过表达AGB1的细胞长度显著长于Col,而AGB1突变体细胞系多为圆形,其细胞长径显著小于Col。外源NAA处理显著促进了突变体agb1-2细胞和GPA1过表达悬浮细胞对NAA诱导的细胞伸长的响应。RT-PCR结果表明,agb1-2和GPA1过表达悬浮细胞中与细胞伸长相关的ABP1的表达量显著增加。 根据上述研究结果,可以达到以下初步结论:(1)GPA1对2,4-D所诱导的细胞分裂过程具有促进作用;(2)AGB1对细胞分裂过程具有负调节作用;对NAA所诱导的细胞伸长过程具有促进作用。

关键词： 拟南芥   AtRGS1蛋白   脱落酸   葡萄糖   突变体   差异显示   转基因  

摘要： 本研究以拟南芥野生型Col-0、突变体rgs1-2、gpa1-4、aba3和abi1、过表达35S:RGS1为材料,通过转基因细胞系构建、差异显示分析和双突变体构建分析等技术,用分子生物学、生物化学、分子遗传学等方法研究了AtRGS1蛋白在拟南芥葡萄糖信号转导途径中的作用。取得了以下主要研究结果: 1、建立了拟南芥悬浮培养细胞体系,并对AtRGS1蛋白及相关结构域进行了细胞定位根据AtRGS1蛋白的特有结构,将编码AtRGS1的两个结构域分别进行克隆表达,结合RGS1-GFP融合蛋白表达技术证明:AtRGS1蛋白定位于细胞膜,AtRGS1-N端结构域和AtRGS1-C端结构域分别定位于质膜和细胞核。D-葡萄糖和ABA处理可以改变AtRGS1全蛋白的亚细胞定位,而AtRGS1-N端结构域定位未发生改变。 2、筛选了AtRGS1蛋白介导的葡萄糖信号转导途径中特异表达的基因 以拟南芥野生型Col-0和突变体rgs1-2为材料,运用差异显示技术筛选AtRGS1蛋白介导的葡萄糖信号转导途径中特异表达的基因。经反向Northern验证,得到四个差异表达蛋白,分别是拟南芥UDP葡萄糖苷转移酶(UGTs)、拟南芥γ谷氨酰水解酶、拟南芥苏氨酸内切酶、拟南芥ADP-核糖基化因子(ARF)。它们很可能是AtRGS1蛋白介导的葡萄糖信号转导途径中重要的作用因子。其中ADP-核糖基化因子(ARF)可能和AtRGS1-C端结构域具有相互作用,参与了AtRGS1-C端结构域的迁移,而且可能将处于游离状态的AtRGS1的C端结构域通过胞内运输转运至细胞膜,使其和跨膜结构域重新融合。UDP葡萄糖苷转移酶(UGTs)是催化拟南芥内源脱落酸(ABA)糖基化的一种酶,在外源高浓度葡萄糖处理后,其表达量降低,这就表明,外源高浓度葡萄糖处理导致内源ABA分解的速度降低,从而促进ABA抑制的种子萌发。而且,UDP葡萄糖苷转移酶很可能是AtRGS1介导的葡萄糖信号转导途径中下游的效应分子。 3、明确了拟南芥种子萌发对葡萄糖信号响应过程中AtRGS1的作用及其与ABA的关系 (1)以拟南芥野生型Col-0为遗传背景的突变体为材料,研究了AtRGS1蛋白在葡萄糖介导的种子萌发过程中的作用。结果显示,与Col相比,AtRGS1过表达的35S:RGS1和Gα缺失突变体gpa1-4的种子萌发对D-葡萄糖的抑制作用表现为超敏感,而AtRGS1缺失突变体rgs1-2表现为低敏感。35S:RGS1、rgs1-2和Col-0种子萌发对葡萄糖类似物甘露糖的响应无明显差异。己糖激酶抑制剂NAG处理对葡萄糖抑制种子萌发的效应不明显,但显著降低了甘露糖对种子萌发的抑制作用。表明在种子萌发过程中,AtRGS1参与的葡萄糖信号转导途径是一特殊途径,且该途径不依赖于己糖激酶。 (2)以AtRGS1缺失突变体rgs1-2、ABA合成突变体aba3、ABA响应不敏感突变体abi1和双突变体aba3rgs1-2、abi1rgs1-2,以及野生型Col-0为材料,研究了葡萄糖介导的拟南芥种子萌发过程中AtRGS1与ABA3和ABI1的相互关系。结果表明:双突变体aba3rgs1-2表现出比单突变体对高浓度葡萄糖的抑制作用更加不敏感。说明AtRGS1和ABA3都参与了拟南芥种子萌发过程的葡萄糖信号的转导。双突变体abi1rgs1-2表现出和单突变体rgs1-2相似的对高浓度葡萄糖的抑制作用不敏感,而单突变体abi1和野生型Col均表现为敏感。

关键词： 拟南芥   转运肽   融合蛋白   叶绿体定位  

摘要： 蛋白质的亚细胞定位信息对于深入了解该蛋白质的功能具有重要意义。本文对一个预测的拟南芥叶绿体未知功能基因At4g22890编码蛋白进行了叶绿体定位研究。我们克隆了该基因5′端长208bp的DNA片段,与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建重组表达载体pMON530-cTP-GFP,经农杆菌介导转化拟南芥。转基因植株经激光共聚焦显微镜观察,GFP荧光仅在叶绿体中观察到,表明所克隆的DNA序列编码的多肽能够将At4g22890编码蛋白质引导进入叶绿体,由此推测该蛋白质为叶绿体蛋白质。