关键词： 拟南芥   突变体   再誉镰刀菌   抗性   植物激素   G蛋白  

摘要： 水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)被认为是传统的植物防卫激素，在调控植物对病原菌等生物性胁迫的抗性中发挥重要作用。它们通过诱导植物产生病程相关蛋白或植物防卫素等方式使植物产生系统获得性抗性和系统诱导性抗性并以网络状的信号传导形式共同抵御生物性胁迫。此外，脱落酸(ABA)和G蛋白也可以通过影响JA、ET和胼胝质的形成来抵抗病原菌的侵入。本论文以拟南芥JA、ET、SA和ABA生物合成和信号转导突变体以及G蛋白突变体为材料，研究了植物激素和G蛋白在拟南芥对再誉镰刀菌抗性中的作用及其机制。\n 1.建立了再誉镰刀菌侵染拟南芥的体系，发现再誉镰刀菌可侵染拟南芥Col-0生态型，症状首先从叶缘开始发生，逐渐形成褐色病斑，菌丝可以侵染开花期的顶端组织造成顶端组织坏死，进一步导致植株的黄化和萎蔫甚至死亡。\n 2.以SA信号转导突变体npr1和转基因植株NahG为材料结合外源SA处理研究了SA及其信号转导组分在拟南芥对再誉镰刀菌抗性中的作用，研究发现npr1和NahG对再誉镰刀菌的抗性降低，而外源SA处理后植株抗性增强，这表明SA及其信号转导组分在拟南芥对再誉镰刀菌抗性中起正向调节作用。npr1和NahG抗性的降低可能与病程相关基因表达受到抑制有关。\n 3.以JA信号转导突变体jar1和coi1为材料结合外源茉莉酸甲酯(MeJA)处理研究了JA及其信号转导组分在拟南芥对再誉镰刀菌抗性中的作用，研究发现jar1抗性降低，而coi1抗病性则显著增强。jar1抗性降低可能与JA与异亮氨酸衍生物合成受阻，导致JA诱导的应答反应被抑制有关。而coi1抗性的增强则有可能与其激活SA和ET途径有关，也有可能与COI1突变后再誉镰刀菌分泌的效应物挟持这一受体而侵染拟南芥的机制受阻断有关。\n 4.以ET信号转导突变体ein3为材料结合外源乙烯利和AgNO3处理研究了ET及其信号转导组分在拟南芥对再誉镰刀菌抗性中的作用，研究发现发现EIN3信号阻断和野生型植株外源AgNO3处理后其抗性降低，而外源乙烯利处理后植株抗性增强，这表明ET及其信号转导组分EIN3正向地参与拟南芥防御再誉镰刀菌的反应。基因表达分析表明ein3对再誉镰刀菌抗性的降低可能与其在发病的早期阶段PDF1.2诱导能力的减弱有关。\n 5.以ABA信号转导突变体abi5-1为材料结合外源ABA处理研究了ABA及其信号转导组分在拟南芥对再誉镰刀菌抗性中的作用，研究发现abi5-1对再誉镰刀菌的抗性降低，而外源ABA处理后植株抗性增强，这表明ABA正向地参与调控拟南芥对再誉镰刀菌的防卫反应。基因表达分析表明abi5-1对再誉镰刀菌抗性的降低也可能与JA、ET和SA等防卫途径途径相关，JA、ET和SA等途径有可能在再誉镰刀菌侵染早期被抑制从而导致抗性降低。\n 6.以G蛋白β亚基缺失突变体agb1-2为材料研究了对G蛋白信号途径在拟南芥对再誉镰刀菌抗性中的作用。结果表明agb1-2对再誉镰刀菌抗性增强，这可能与其能更快速地诱导JA和ET信号途径有关。

关键词： 细胞外ATP   ROS   异三聚体G蛋白   Ca2+   质子泵   气孔  

摘要： 气孔运动关系到植物与外界环境气体和水分的交换,气孔运动的调节机理是植物生理学研究的重要内容。细胞外ATP(extracellular ATP,eATP)作为一种信使分子,通过其特定的信号转导机制参与细胞代谢、生长和发育过程的调控。本文研究了eATP对气孔运动的影响,并对其信号转导过程中可能的信号传递组分进行了探索。 我实验室已经完成的研究结果显示,eATP能够作为信使分子促进拟南芥气孔开放,保卫细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)在eATP信号转导过程中发挥介导作用,异三聚体G蛋白α亚基参与了eATP诱导ROS合成、促进气孔开放的过程。但是,对于eATP信号转导过程中活性氧下游的生理变化还不清楚,异三聚体G蛋白其他两个亚基(Gβ、Gγ)在eATP调节气孔运动的信号转导过程中是否发挥作用也不清楚。因此,本文以拟南芥野生型、异三聚体G蛋白基因缺失突变体和超表达株系、活性氧合成的关键酶—NADPH氧化酶的基因缺失突变体为材料,采用表皮条生物分析、激光共聚焦显微技术、非损伤微测技术对异三聚体G蛋白和ROS在eATP调节保卫细胞Ca2+流和H+流的过程中发挥的作用进行了探索。结果表明: 异三聚体G蛋白β、γ亚基基因缺失突变体在外加ATP处理之后,气孔开度明显增大,突变体及其野生型气孔对eATP刺激的反应没有明显差异;ATP处理后,野生型和突变体保卫细胞内ROS含量都有显著升高。这些结果显示,Gβ、Gγ可能不参与eATP诱导胞内ROS升高、促进气孔开放的过程。 为进一步探索eATP调节气孔运动的生理机制,我们利用非损伤微测技术测定了eATP处理后拟南芥保卫细胞Ca2+流和H+流的动态变化。结果显示,在eATP处理之后,保卫细胞跨膜Ca2+内流增加;在Gα基因缺失突变体中,外加ATP对Ca2+流没有产生明显的影响,而在Gα基因超表达株系中,Ca2+内流显著增强,Gβ、Gγ基因缺失突变体Ca2+流对eATP刺激的反应与野生型没有明显差异。在NADPH氧化酶的基因缺失突变体中,eATP处理几乎没有引起Ca2+流的变化。这些结果表明,eATP可能通过活性氧促进钙离子内流促进气孔开放,在此过程中,Gα起到了重要的介导作用,而Gβ、Gγ未参与其中。 H+流检测的结果显示,eATP处理引起保卫细胞跨膜H+外流增加。在NADPH氧化酶的基因缺失突变体中,eATP处理没有引起H+流的变化。在Gα基因缺失突变体中,外加ATP对H+流几乎没有影响,而在Gα基因超表达株系中,H+外流明显增强;Gβ、Gγ基因缺失突变体与野生型之间没有明显差异。这表明eATP可能通过ROS激活细胞质膜质子泵、促进细胞向外排放H+离子,并最终促进气孔开放程度加大。在此过程中,Gα可能参与了信号转导过程,而Gβ、Gγ未参与。

关键词： AOS   Arabidopsis   heterotrimeric G-protein   G-protein alpha-subunit (GPA1)   jasmonic acid   PDF1   2   VSP  

摘要： Heterotrimeric G-proteins have been implicated in having a role in many plant signalling pathways. To understand further the role of G-proteins, a preliminary experiment was performed to assess the impact of the G alpha subunit loss-of-function mutation gpa1-1 on the Arabidopsis transcriptome. The analysis indicated that the G alpha subunit may play a role in response to jasmonic acid (JA). Consistent with this, G alpha mutants showed a reduced response to JA in inhibition of chlorophyll accumulation and root growth, whilst G alpha gain-of-function plants overexpressing G alpha showed the opposite phenotype. The levels of JA and related compounds were unaffected in the gpa1-1 mutant, as was autoregulation of the Allene Oxide Synthase (AOS) gene that encodes a key enzyme for JA biosynthesis. In contrast, further analyses using G alpha loss- and gain-of-function Arabidopsis lines indicated that G alpha positively modulates the expression of the Vegetative Storage Protein (VSP) gene. This indicates that the G alpha subunit regulates a subset of JA-regulated genes defining a branch point in this signalling pathway in Arabidopsis. Further analysis of the impact of G alpha loss of function upon the JA-regulated transcriptome using Arabidopsis full genome arrays indicated that up to 29% of genes that are > 2-fold regulated by JA in the wild type are misregulated in the G alpha mutant. This supports the observation that a significant proportion of, but not all, JA-regulated gene expression is mediated by G alpha.

关键词： 拟南芥   低温胁迫   POD   SOD   MDA  

摘要： 采用分光光度法测定了低温胁迫下两种拟南芥G蛋白突变体的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的活性及丙二醛(MDA)含量的变化。结果表明:在低温12h,野生型(Ws)和突变体gpa1-1的SOD酶活性迅速升高,分别为15.501 U/mg protein和9.453 U/mg pro-tein,突变体gpa1-2则在低温24 h升至最高点,酶活性为6.325 U/mg protein。低温胁迫下,三种材料的POD酶活性都呈现降低趋势,而MDA含量呈上升趋势。初步证明外界低温刺激与植物细胞内G蛋白有一定的关联。

关键词： 拟南芥   AtRGS1蛋白   结构域   突变体   脱落酸   糖   转基因植株  

摘要： 本研究以拟南芥野生型Col-0、突变体rgs1-2、过表达35S:RGS1-N、35S:RGS1-C为材料,通过突变体分析、转基因植株构建等技术,用分子生物学、生物化学等方法研究了AtRGS1蛋白N-末端、C-末端结构域在拟南芥葡萄糖和ABA信号转导途径中的作用。取得了以下主要研究结果: 1、采用TOPO克隆的方法构建了35S:RGS1-N、35S:RGS1-C过表达转基因植株。 克隆了AtRGS1基因N-末端、C-末端cDNA,通过TOPO克隆构建了CaMV 35S为启动子,GFP为报告基因,含有融合基因35S:RGS1-N-GFP、35S:RGS1-C-GFP的植物表达载体。利用根癌农杆菌浸染转化法将35S:RGS1-N-GFP、35S:RGS1-C-GFP融合基因导入突变体rgs1-2植株,经过抗生素筛选、根部荧光观察和GFP基因PCR鉴定,获得了转化成功的阳性植株。 2、运用突变体分析技术研究AtRGS1蛋白N-末端、C-末端结构域在拟南芥葡萄糖和ABA信号转导途径中的作用及其调节机理。结果表明: (1)rgs1-2种子萌发对葡萄糖的抑制作用不敏感,而35S:RGS1-N、35S:RGS1-C种子表现为超敏感,其中35S:RGS1-N种子最敏感。四基因型种子萌发对甘露糖的抑制作用未表现出差异。表明这种抑制作用与糖的渗透胁迫无关,而是由葡萄糖介导的信号转导途径引起的。己糖激酶抑制剂NAG处理削弱了甘露糖对种子萌发的抑制效应,而对葡萄糖抑制萌发没有影响,表明葡萄糖抑制种子萌发不依赖于已糖激酶途径。 (2)rgs1-2种子萌发对ABA低敏,而35S:RGS1-N、35S:RGS1-C种子表现为超敏感,其中35S:RGS1-N种子最敏感。表明过表达AtRGS1-N、AtRGS1-C能互补rgs1-2的ABA不敏感性表型,增加了种子对ABA的敏感性。 (3)葡萄糖与ABA共处理结果显示葡萄糖与ABA对种子萌发的抑制作用存在叠加效应。Fluridone与葡萄糖共处理结果显示Fluridone能降低葡萄糖抑制种子萌发的效应。表明葡萄糖是通过增加内源ABA含量来抑制萌发的。 (4)rgs1-2幼苗主根显著长于Col,而35S:RGS1-N、35S:RGS1-C主根显著短于Col、rgs1-2。rgs1-2、35S:RGS1-N和35S:RGS1-C主根生长对葡萄糖和ABA的应答表现出相同趋势,即rgs1-2敏感性最低,其次是35S:RGS1-C,35S:RGS1-N敏感性最高。表明AtRGS1基因突变和过表达改变了代谢糖和ABA调节作用的敏感性。 (5)植株水平,rgs1-2离体叶片失水速率显著快于Col,而35S:RGS1-N、35S:RGS1-C显著低于Col。表明过表达AtRGS1-N、AtRGS1-C能降低植株叶片失水速率,增强耐旱性。 (6)干旱胁迫条件下,rgs1-2水势显著低于Col,而35S:RGS1-N、35S:RGS1-C水势显著高于Col、rgs1-2。表明rgs1-2保水能力较弱,而35S:RGS1-N、35S:RGS1-C具有较强的保水能力,在干旱胁迫下能够保持较高的叶片水势。相应地,Col、rgs1-2叶片ABA含量较低,而转基因株系35S:RGS1-N、35S:RGS1-C叶片ABA含量显著高于Col、rgs1-2。表明过表达AtRGS1 N-末端、C-末端结构域增强了拟南芥应对干旱胁迫的能力。

关键词： WRKY25   At2g03440   AtNRP1   高温胁迫   耐热性   Northern杂交  

摘要： 高温胁迫对植物造成损伤并诱导植物产生热激反应,是限制植物生长和地域分布的重要影响因子之一。本研究通过高温胁迫下的基因表达谱分析,筛选到受高温诱导的WRKY25和受高温明显抑制编号为At2g03440的基因,并通过筛选这两个基因的突变体和构建高表达转基因植株,进一步分析它们抗热方面的分子生物学功能。 (1)WRKY25的表达受高温胁迫的明显诱导,并随处理时间的延长表达持续增强。通过对筛选到的wrky25与野生型材料的不同生长阶段在高温处理后的比较分析发现：wrky25相对野生型材料表现出对高温的敏感性,如高温处理后下胚轴的伸长、根的伸长和成苗期高温处理后的电导率增加等。 WRKY25高表达转基因植株在正常条件下苗的状况和生长势比野生型材料要明显弱一些,不易进行抗热比较分析；但WRKY25高表达转基因植物的种子在高温处理后的萌发率明显比野生型材料高,表现了一定的高温抗性。 对一些热胁迫相关的标志基因进行表达分析,如热激转录调控因子HsfA2、HsfB1和氧化反应相关的基因APX2,Zat10和热激蛋白Hsp101等在高温处理后的突变体和野生型材料中的表达分析。结果表明,虽然作为热激因子的HsfA2在突变体和野生型材料的表达差异相对微弱一些,但HsfB1,HSp101,APX2,Zat10在wrky25突变体中的表达量都要比对应处理温度的野生型材料的表达量要低,尤其以42℃处理1h差别更明显。WRKY25在抗高温的作用可能涉及与这些抗热相关的热激因子、热激蛋白基因和氧化胁迫相关基因的相互表达调控。 (2)编号为At2g03440的基因功能还未见报道,生物信息学分析由At2g03440编码的蛋白与苜蓿早期结瘤蛋白12B前体(Early nodulin 12B precursor)有一定程度的相似性,我们就暂命名“结瘤相关蛋白1"(Nodulin-related protein 1,NRP1)。本论文从AtNRP1组织表达定位、逆境胁迫下的表达谱初步分析AtNRP1可能的功能。 对ProAtNRP1::GUS转基因植株不同发育时期和不同器官进行组织化学GUS染色,发现AtNRPl基因主要在幼苗期大部分组织,成苗期生长旺盛的顶端分生组织和在花器官中的雄蕊、柱头表达强烈,此外AtNRP1在剪伤的伤口部位和愈伤组织中都有很强的表达。AtNRP1在不同逆境胁迫下的表达谱分析表明AtNRP1受高温和ABA的明显抑制,受低温的强烈诱导和NaCl轻微诱导,而自然干旱和H20处理则对AtNRP1无明显影响。AtNRP1高表达转基因株系在高温胁迫处理后表现出比野生型对高温敏感,而在高温处理后的nrpl与野生型相比则无明显差别,推测单个基因的突变,尤其是下游功能基因的突变可能由于相似功能的基因互补而不易产生明显的表型。 我们首先检测了重要的热激相关的转录调控因子HsfA2、MBF1c和常见的热激蛋白Hsp70、Hsp101的表达是否在高温处理后的AtNRPl高表达转基因植株、野生型和nrpl突变体植株中存在差异。结果表明这几个热诱导的基因在AtNRP1高表达、突变体和野生型植株中的表达量无明显的差异,我们推测AtNRP1在抗热方面的作用可能不是依赖热激因子、热激蛋白这条抗热途径,可能是有另外的信号途径参与。 基于对ABA处理后AtNRPl的表达谱分析,我们检测了高温处理AtNRPl高表达转基因植株、nrpl和野生型植株后检测内源ABA的含量,结果表明38℃热处理约30min后,每个材料中ABA的含量都急剧增加,并随着热处理时间的延长,ABA的积累继续呈增加趋势,但高表达株系积累的ABA量都低于野生型和突变体材料的,推测AtNRP1在抗热反应中的作用与ABA的积累有关。此外,进一步的Northern杂交表明AtNRPl基因在野生型材料中受高温因子的抑制,而这一抑制情况在热处理的aba2-3材料中没出现,随着高温处理时间的延长,NRP1的表达在aba2-3中无明显变化。我们推测外源ABA抑制AtNRPl基因的表达,而高表达AtNRP1对热处理后的ABA的积累是一个负反馈调控作用,AtNRP1在抗热方面的作用可能是通过调控ABA信号途径而实现。

关键词： 拟南芥G蛋白   GPA1   cDNA文库   信号转导   AtXB31   Xcc   病原菌  

摘要： 异三聚体G蛋白是在从酵母到人的所有真核生物中都高度保守的信号转导蛋白。它与偶联的膜受体蛋白和效应器蛋白合作,接受外界信息,并经过调整、集合与放大,准确无误地传递到细胞内,从而调控基本的生命过程,是细胞与环境信息交换必不可少的分子开关。异三聚体G蛋白属于GTPase,由α,β,γ三个亚基组成。研究表明,异三聚体G蛋白与含有七次跨膜结构域的质膜受体密切偶联(GPCRs)。目前哺乳动物中已发现大于20个Gα亚基,多于5个Gβ亚基,至少20个Gγ亚基。 与哺乳动物相反,植物异三聚体G蛋白含有一个Gα亚基(GPA1),一个Gβ亚基(AGB1)和两个Gγ亚基(AGG1和AGG2)。研究表明,植物G蛋白参与许多激素、发育及环境信号的应答,从而调控植物生长、器官发育及病害及逆境抗性等。对于拟南芥和水稻研究表明,异三聚体G蛋白能够直接地,间接地组织特异性地影响生长素、ABA、GA、油菜素内酯(brassinosteroid)、鞘脂(sphingolipid )、D-葡萄糖信号、感受蓝光和病原菌信号传导等。虽然植物异三聚体G蛋白涉及广泛的信号转导过程,但已知的与Gα亚基或Gβγ二聚体相互作用的下游效应器还很少。但传统的方法,包括生物数据分析、遗传学与药理学等方法,对于筛选、鉴定植物G蛋白信号转导途径中的其它效应因子并不十分有效,因而寻找新的改良方法是必须的。 在本项研究中,作者构建了拟南芥cDNA文库,借助酵母反向Ras恢复系统(reverse Ras Recruitment system,rRRS)来筛选、鉴定与拟南芥GPA1相互作用的蛋白因子,如ADL1C,ACC1,AtXB31等,并以AtXB31作为进一步的研究对象,通过Pull down,BiFC和CoIP等体外与体内蛋白结合实验证明了AtXB31同GPA1的互作。生物化学分析与异位过量表达,病原菌接种等遗传学研究进一步验证它们之间的相互作用。分离GPA1相互作用蛋白的突变体以及与包括gpa1在内的其它信号蛋白突变基因构成的双突变体。通过鉴定这些突变体对已知G蛋白介导的信号转导事件产生的效应与表型性状,揭示G蛋白信号转导途径的机理。取得的结果如下: 1.提取拟南芥2星期和三星期幼苗,成熟的叶片、茎、花的总RNA,以随即引物为反转录引物,表达载体为pUra-Ras,构建了cDNA文库,1×105个克隆。 2.构建pMet-WtGPA1,pMet-Q222L两种诱饵,借助反向Ras拯救恢复系统,筛选得到若干GPA1推论的互作因子,如:ADL1C,ACC1,AtXB31等。 3.通过酵母双杂交,Pull down,BiFC,CoIP等体内体外蛋白互作实验,进一步证明AtXB31同GPA1的互作。其中酵母双杂交的互作发现,AtXB31的N-末端膜定位序列对于二者的互作是必需的。 4.对于AtXB31结构分析表明,该基因具有三个保守domain,分别为:N-末端的膜定位序列,将蛋白定位在质膜上;锚定重复序列(ankyrin repeats),参与蛋白互作;C3HC4的环形锌指结构,具有潜在的E3连接酶的活性。生物信息学预测该蛋白不具有跨膜结构。RT-PCR检测,该基因在植物的重要组织中均有表达,其中在花中表达较高。GFP亚细胞定位在质膜上。经ABA和病原菌处理之后,AtXB31表达量提高。 ***1同AtXB31有可能共同调控病原菌Xcc8004信号途径。通过对AtXB31的异位过表达和RNAi敲除转基因植株同野生型col-o形态学比较发现,基本没有差别。分别对GPA1的无义突变体gpa1-4和AtXB31过表达以及RNAi敲除植株接种病原菌,野生型作为对照。结果表明,gpa1-4和AtXB31RNAi敲除植株均出现了疑似感病症状。并且已经证明AtXB31在转录水平上响应该病原菌。因此推论AtGPA1和AtXB31很有可能参与Xcc8004病原菌的信号调控。 黄单胞菌是可造成植物严重病害的细菌,如黑腐病。因此研究该病原菌同植物之间的信号传递途径,找出关键调控基因,对于防治该病原菌可提供重要理论依据。 筛选、鉴定植物G蛋白相互作用因子,并剖析其生理功能和在G蛋白信号转导中的作用,从而揭示植物G蛋白信号转导过程中的分子运转机制,这不但具有深远的理论意义,而且具有现实的生产指导意义,为提作物高光合效率,改良作物品质,提高作物抗逆性等品种改良工作提供理论依据。

关键词： 细胞外ATP   ROS   异三聚体G蛋白   气孔   拟南芥  

摘要： 气孔运动是植物体内水分代谢调控的重要过程,气孔运动的调节机理是植物生理学研究的重要内容。细胞外ATP（extracellular ATP,eATP）在植物生长发育和抗逆过程中发挥重要的调节作用,是植物细胞外重要的信使分子。本文研究了eATP对气孔运动的影响及其可能的信号转导机制。 本文采用拟南芥野生型材料、异三聚体G蛋白α亚基基因缺失突变体和超表达株系、ROS（reactive oxygen species）合成的关键酶—NADPH氧化酶的基因缺失突变体、以及三磷酸腺苷双磷酸酶催化亚基基因的缺失突变体为材料,采用表皮条生物分析、激光共聚焦显微技术、RT-PCR等实验方法对异三聚体G蛋白和ROS在eATP调节气孔运动的信号转导过程中发挥的作用进行了研究。结果表明: 拟南芥野生型经eATP处理后,气孔开度明显增大,且随着eATP浓度的升高,气孔开放所受促进程度加大;不可水解的ATP结构类似物（BzATP,ATPγS,2meATP）同样能够诱导气孔开放,ADP和GTP也能不同程度地促进气孔开放,而AMP和腺苷则无明显作用,表明细胞外ATP能够作为信使分子促进气孔开放。三磷酸腺苷双磷酸酶和葡萄糖-己糖激酶处理后,气孔开度明显减小,在自然光照下,三磷酸腺苷双磷酸酶催化亚基基因缺失突变体比野生型的气孔开度大,说明了内源eATP在气孔运动中同样起着正调控作用。 eATP处理后,异三聚体G蛋白α亚基基因超表达株系气孔开度变大,而异三聚体G蛋白α亚基基因缺失突变体的气孔开度变化不明显,表明异三聚体G蛋白可能参与了eATP促进气孔开放的信号转导过程。 叶片经外源ROS处理后,发现低浓度的ROS能促进气孔开放,而高浓度ROS促进气孔关闭;在eATP处理的同时加入细胞质膜NADPH氧化酶专一性抑制剂二亚苯基碘和还原剂二硫苏糖醇以抑制或清除细胞产生的活性氧基团,eATP不能促进气孔开放;NADPH氧化酶的基因缺失突变体经eATP处理后,气孔开度变化不明显。上述结果表明NADPH氧化酶参与的ROS形成在eATP诱导拟南芥气孔开放的过程中起着重要的作用,是eATP信号途径中必不可少的成员。 利用ROS荧光染料H2DCFDA,结合激光共聚焦技术检测结果显示,eATP处理后保卫细胞内ROS含量明显升高,在NADPH氧化酶基因缺失突变体中eATP不能诱导ROS水平升高;异三聚体G蛋白α亚基基因缺失突变体大大削弱了eATP诱导保卫细胞内ROS升高的过程,而超表达株系加速了eATP诱导保卫细胞内ROS升高的过程。表明异三聚体G蛋白介导了eATP诱导胞内ROS升高的过程。 上述结果显示,eATP能够作为信号分子促进拟南芥气孔开放,异三聚体G蛋白和ROS在此过程中发挥重要介导作用。

关键词： 拟南芥   脱落酸   一氧化氮   过氧化氢   异三聚体G蛋白   气孔运动   信号转导  

摘要： 脱落酸（ABA）、一氧化氮（NO）、过氧化氢（H2O2）是植物应对外界刺激产生的关键信号分子,参与了多种植物信号转导途径。保卫细胞气孔运动中存在着复杂的信号转导网络,已有的研究证明,ABA、NO、H2O2、G蛋白都参与了气孔运动的复杂信号转导网络系统。气孔保卫细胞是研究高等植物细胞信号转导的模式材料。研究气孔运动信号转导途径及其调控机制对于认识植物整体对环境的适应机制具有重要的科学意义。 植物异三聚体G蛋白由α、β和γ三种亚基构成。植物异三聚体G蛋白介导的细胞信号转导是植物细胞信号转导机制中最为保守的信号转导机制之一。现有的实验结论已经阐明了ABA调节气孔关闭机制,同时证实G蛋白α亚基参与了ABA调控气孔关闭运动的过程,但关于G蛋白各亚基在气孔运动信号转导网络系统中的功能却还未完全阐明。 本文以拟南芥野生型Col以及GPA1、AGB1、GPA1/AGB1蛋白缺失突变体gpa1-4、agb1-2、αβ36为研究材料,利用表皮条生物分析和荧光显微技术探讨了G蛋白参与保卫细胞ABA、NO、H2O2信号转导通路中的功能,主要研究结果总结如下: 1)外源ABA可以诱导野生型拟南芥气孔关闭。在此过程中,gpa1-4对ABA不敏感说明GPA1介导了ABA对气孔关闭的诱导作用; agb1-2、αβ36对ABA敏感,推测AGB1不参与这一信号通路。 2)外源ABA可以抑制野生型拟南芥气孔开张运动。在此过程中,gpa1-4、agb1-2对ABA敏感,αβ36双突变体对ABA不敏感,说明GPA1和AGB1可单独在此信号通路中起作用,但不能同时缺失。 3)外源NO促进了野生型拟南芥气孔关闭运动。在此过程中,gpa1-4、agb1-2对NO敏感,αβ36对NO不敏感,推测GPA1蛋白和AGB1蛋白均可在此信号通路中发挥作用,但同时缺失会使此信号通路受阻。 4)外源NO抑制了野生型拟南芥气孔开张运动,对三种突变体亦产生相同的效应,说明G蛋白没有参与NO抑制气孔开张过程,或者是在该过程中起着负调控作用。 5)外源H2O2可以促进野生型拟南芥气孔关闭运动。agb1-2对H2O2敏感,而gpa1-4突变体和αβ36突变体对H2O2不敏感,说明GPA1蛋白可能为这一信号通路所必需。 6)外源H2O2可以抑制野生型拟南芥气孔开张运动。gpa1-4、αβ36对H2O2不敏感, agb1-2突变体对H2O2敏感,类似于野生型,从而推测GPA1蛋白是此信号通路所必需的。 7)野生型拟南芥保卫细胞内,ABA可诱导产生NO和H2O2进而引起气孔关闭。在此过程中,ABA诱导保卫细胞内产生H2O2过程需要GPA1蛋白参与,而ABA诱导保卫细胞内产生NO过程需要GPA1蛋白和AGB1蛋白两者同时存在。 8)野生型拟南芥中,ABA可诱导保卫细胞产生NO和H2O2进而抑制气孔开张运动,在此过程里,证明GPA1蛋白为ABA诱导产生H2O2进而抑制气孔开张运动所必需的,AGB1蛋白是ABA保卫细胞生成NO抑制气孔开张运动所必需的。 9)野生型拟南芥保卫细胞中H2O2可诱导产生NO,进而促进气孔关闭,agb1-2突变体也有类似表现,而gpa1-4、αβ36突变体内H2O2不能诱导产生NO而影响气孔关闭运动,从而可推测GPA1蛋白正调控H2O2诱导生成NO促进气孔关闭的信号通路。 10)野生型拟南芥保卫细胞中H2O2能够诱导NO生成,进而抑制气孔的开张运动,agb1-2突变体也有类似表现,而gpa1-4、αβ36突变体内H2O2不能诱导产生NO而影响气孔开张运动,从而可推测GPA1蛋白为H2O2诱导保卫细胞内生成NO抑制气孔开张运动信号通路所必需。 11)NO促进气孔关闭运动中,gpa1-4突变体、agb1-2突变体和αβ36突变体保卫细胞与野生型对NO反应类似,均不被诱导产生H2O2,故推测G蛋白不参与这一过程。 12)NO抑制气孔开放运动中,与野生型类似,gpa1-4突变体、agb1-2突变体和αβ36突变体保卫细胞均不被NO诱导产生H2O2,故推测G蛋白不参与这一过程。 13)细胞内源性ABA能增强NO和H2O2对野生型拟南芥气孔关闭运动的促进作用,而不能对gpa1-4突变体、agb1-2突变体和αβ36突变体保卫细胞产生此效应,故推测GPA1蛋白和AGB1蛋白参与了这一信号通路,且两蛋白在此过程中协同作用,缺一不可。 14)细胞内源性ABA能增强H2O2对野生型拟南芥气孔开张运动的抑制作用,αβ36突变体保卫细胞H2O2对气孔开张运动的抑制作用能被内源性ABA所减弱,故推测GPA1蛋白和AGB1蛋白在这一信号通路起正调控作用,

关键词： Ca^2+   拟南芥   生长素   异三聚体G蛋白   突变体  

摘要： 以拟南芥的野生型(ws)、异三聚体G蛋白α亚基基因GPA1缺失突变体(gpα1-1、gpα1-2)和超表达突变体(wGα、cGα)为材料,在含有不同质量浓度(0~0.2mg/L)NAA的培养基内,添加常用的钙通道抑制剂,对拟南芥侧根生长发育的形态进行了观测。结果表明:1)在不含Ca2+的培养基内,5种基因型侧根生长发育的差异显著性明显降低。2)在含有电压依赖型钙通道有机抑制剂(异搏定和地而流卓)的培养基内,5种基因型侧根的生长发育与未施加抑制剂的差异显著性一致。3)在含有不同浓度的3价无机离子的培养基内,5种基因型侧根的生长发育与未施加抑制剂的差异显著性不一致。初步表明了在NAA诱导的拟南芥侧根生长发育过程中Ca2+可能是G蛋白的下游信号。