关键词： 拟南芥   异三聚体G蛋白   eATP   离子通道   膜片钳  

摘要： eATP对于高等植物的生长以及对环境的适应等过程都具有调节作用,已有实验证明eATP可以激活拟南芥根表皮细胞质膜上的超极化激活的钙离子通道,使胞质中游离钙离子的含量增加。 为了检测异三聚体G蛋白在eATP调节细胞质膜上离子通道过程中是否发挥作用,本文使用模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的根细胞原生质体做为研究对象,采用异三聚体G蛋白α亚基的突变体作为实验材料,利用外源ATP处理根细胞原生质体,采用膜片钳技术,检测eATP对于拟南芥根细胞质膜上离子通道(钙离子通道,钾离子通道)活性的影响。 本实验采用全细胞电压钳的方式记录了拟南芥根细胞质膜上超极化激活的钙离子通道,外源ATP处理后钙离子通道的开放电压提高,电流强度增大,在异三聚体G蛋白α亚基缺失突变体中,外源ATP处理后钙通道的开放电压以及电流强度变化不大,在Gα超表达株系中外源ATP处理后钙通道的开放电压以及电流强度明显增大,证明异三聚体G蛋白在eATP调节细胞质膜上钙离子通道的信号转导机制中可能发挥作用。 为了检测异三聚体G蛋白在eATP调节细胞质膜上钾离子通道过程中是否发挥作用,采用全细胞电压钳的方式分别记录了拟南芥根细胞质膜上内向与外向钾离子通道,结果显示野生型拟南芥外源ATP处理后外向钾离子通道电流增强,内向电流无变化。在异三聚体G蛋白α亚基缺失突变体中,外源ATP处理后内、外向钾通道电流均无变化。在Gα超表达株系中外源ATP处理后外向钾通道电流增强,内向电流无变化。表明异三聚体G蛋白在eATP调节细胞质膜上外向钾离子通道过程中发挥作用,但对于内向钾离子通道活性无明显影响。 通过本实验的结果可以推测异三聚体G蛋白在eATP激活根表皮细胞质膜上超极化激活的钙离子通道,引起胞质钙离子增加的过程中发挥重要作用,并且还在eATP调节细胞质膜上外向钾离子通道过程中发挥作用。

关键词： 香蕉   MaROP1   拟南芥   盐胁迫   干旱胁迫   ABA  

摘要： ROP(Rho-related GTPases from plants)蛋白作为高等植物体内广泛存在的一类GTP结合蛋白,是一类重要的信号分子,在植物的生长发育过程中起着重要的调控作用。利用抑制差减杂交分离香蕉果实采后差异表达基因时获得了一个香蕉ROP基因,将其命名为MaROP1。该基因具有一个完整的开放阅读框,编码196个氨基酸,具有保守的ROP结构域,Blastx表明该基因与其它物种的ROP基因的同源性较高。实验室前期结果表明,该基因在香蕉基因组中的拷贝数较低,在香蕉的根、球茎、叶、花、果实中差异表达且在香蕉球茎中的表达量最高。 为了深入研究MaROP1基因对逆境和激素的应答,本实验构建了MaROP1基因的融合植物表达载体pCAMBIAl 302-MaROP1,通过根癌农杆菌EHA105介导的花序浸蘸法将pCAMBIA1302-MaROP1植物表达载体转化哥伦比亚生态型野生拟南芥,经过35ug/mL潮霉素筛选各代种子(T1-T3)获得了14个MaROP1转基因拟南芥纯合株系,southern杂交表明MaROP1基因已经整合到各转基因株系的基因组中,RT-PCR证实MaROP1基因在各转基因株系中转录水平上表达。利用其中5个经过Southern和RT-PCR鉴定的转基因株系进行盐、干旱等逆境处理和***处理。 MaROP1转基因拟南芥与野生型相比对盐胁迫抵抗能力增强。在不同浓度的NaCl培养基上,MaROP1转基因拟南芥与野生型相比种子发芽率提高,200mM NaCl处理下野生型萌发率为23.42%,各转基因纯合株系发芽率在46.21%-79.76%之间。根长被抑制程度较低,150mM NaCl处理下,野生型平均根长为0.29 cm,各转基因纯合株系平均根长在0.57-0.79cm之间。对野生型和各转基因拟南芥成苗进行高盐胁迫后发现,MaROP1转基因拟南芥的存活率大于野生型,300mM NaCl处理14天后,野生型的存活率几乎为零,而各转基因拟南芥存活率均在30%以上。 MaROP1转基因拟南芥与野生型相比对干旱胁迫抵抗能力增强。在不同浓度甘露醇模拟干旱的培养基上,MaROP1转基因拟南芥与野生型相比种子发芽率提高,在400mM甘露醇培养基上野生型发芽率为23.12%,各转基因拟南芥发芽率在73.83%-85.00%之间。根长被抑制程度较低,在400mM甘露醇培养基中上野生型的根长几乎为零,而各转基因株系的根长仍然在1.00-1.42 cm之间。对野生型和各转基因拟南芥的离体叶片进行失水率测定发现,野生型离体叶片失水率明显高于各转基因株系,第240min时,野生型失水率为38.07%,而各转基因株系叶片离体失水率在22.04%-29.43%之间,说明各转基因拟南芥离体叶片在干旱胁迫下保水能力较高。对野生型和各转基因拟南芥进行干旱胁迫后发现,MaROP1转基因植株的存活率大于野生型,野生型的存活率为16%,而各转基因株系存活率在35%-65%之间。 MaROP1转基因拟南芥与野生型相比降低了对ABA的敏感性。种子在胚胎萌发后期,产生大量内源ABA抑制种子萌发,本实验将刚收获的野生型和各转基因拟南芥播于MS培养基上,不经春化,按时间梯度统计萌发率,观测内源ABA对种子休眠的影响,结果发现各转基因拟南芥与野生型相比萌发速率较快,说明内源ABA对MaROP1转基因拟南芥的抑制作用低于野生型。外源ABA抑制种子萌发,在不同浓度外源ABA的处理下,各MaROP1转基因拟南芥种子发芽率均大于野生型,在5uMABA培养基上,野生型萌发率为38.77%,各转基因株系发芽率在54.62%-70%之间。在不同浓度外源ABA的处理下垂直培养和平放培养野生型和各转基因株系均表明,外源ABA对各转基因株系根长和生长速率的影响均比野生型小。

关键词： 拟南芥   小G蛋白   RabD2b   定位   功能  

摘要： Rab是小G蛋白超家族中最大的一个家族,它们广泛存在于动物、植物及微生物中,在囊泡运输的不同阶段发挥其调控作用。Rab1类小G蛋白是Rab蛋白家族的一个亚家族,酵母和哺乳动物的Rab1类蛋白(Ypt1和Rab1)调控从内质网到高尔基体的囊泡运输过程。植物中Rab1类小G蛋白归属于RabD亚家族。拟南芥RabD亚家族又被分为功能不同的两个亚类AtRabD1(包括一个成员AtRabD1)和AtRabD2(包括三个成员AtRabD2a、AtRabD2b和AtRabD2c)。目前,AtRabD1和AtRabD2a的功能研究开展较多,它们的功能类似于Ypt1和Rab1,调控内质网到高尔基体的囊泡运输过程。但另外两个成员AtRabD2b和AtRabD2c的细胞学和生理学功能还不清楚。本研究中,我们分析了AtRabD2b的表达谱和亚细胞定位,同时,利用基因敲除突变体和转基因植株对AtRabD基因的生理功能进行了研究。主要研究结果如下： (1)不同物种(拟南芥,酵母以及哺乳动物)Rabl类小G蛋白的氨基酸序列高度保守,而且它们都具有保守的功能结构域(核苷酸结合结构域和效应因子结合结构域);AtRabD2b能够互补酵母温敏突变体ASY01(ypt1)的缺陷表型,表明AtRabD2b与Ypt1是功能上相似的同源蛋白;(2)烟草叶片表皮细胞瞬时转化结果表明AtRabD2b主要定位在细胞内的高尔基体上。通过定点诱变的方法获得了AtRabD2b的两种突变形式：组成性结合GTP的活性形式AtRabD2b[Q67L]和无核苷酸结合的非活性形式AtRabD2b[N121I]。AtRabD2b[Q67L]主要定位在高尔基体上,而AtRabD2b[N121I]则弥散在细胞质中,表明不同的核苷酸结合状态会影响AtRabD2b的亚细胞定位;(3)RT-PCR结果显示AtRabD2b基因在植株的根、茎、叶、花、角果等组织中都有表达,表明它是组成型表达的蛋白。GUS组织染色结果显示AtRabD2b在幼苗和成熟期的不同组织中都有表达,但是在幼嫩以及生长发育比较旺盛的部位中优先表达;(4)atrabd2b单突变体和atrabd2b/atrabd2c双突变体没有出现异于野生型植株的表型。YFP-AtRabD2b [Q67L]的超表达植株出现矮化、莲座叶宽度增加以及果柄与花序轴夹角减少等异常表型。超表达YFP-AtRabD2b[Q67L]还导致了AtRabD2b基因的共抑制,产生了AtRabD2b, AtRabD2c和AtRabD1基因下调表达的转基因植株,这些转基因植株的茎顶端部分由绿变紫,并逐渐坏死,成熟期植株表现出矮化、丛生、不育等表型。这些结果表明AtRabD基因参与了植物的多个生长发育过程,而且AtRabD亚家族蛋白间存在着高度的功能冗余。 (5)显微切片结果表明,AtRabD2b基因共抑制植株茎段的坏死起始于细胞的死亡,坏死细胞首先在外围的表皮细胞层中发现,然后沿着切面在细胞和细胞之间蔓延。透射电镜观察结果表明在即将死亡的细胞中,叶绿体发育异常,内囊体片层膜数目减少,并且这些细胞中的细胞器被液泡逐渐吞噬。这些结果暗示了AtRabD基因在体内调控的囊泡运输过程对于维持植物某些组织的细胞活性有重要的作用。 (6) AtRabD2b蛋白C末端两个保守的半胱氨酸残基是蛋白质进行异戊二烯化修饰的重要位点。PCR扩增获得了AtRabD2b单个半胱氨酸突变或两个半胱氨酸缺失的序歹AtRabD2bC199s和AtRabD2bΔCC。亚细胞定位结果显示两个突变蛋白都定位在细胞质中;酵母互补实验表明两个突变基因不能互补vpt1温敏突变体,而且tRabD2bC199S(?)tRabD2bΔCC超表达拟南芥植株表现出与AtRabD2b达植株不同的表型。这些结果表明保守半胱氨酸的突变造成了AtRabD2b亚细胞定位和功能的改变。

关键词： 拟南芥   DHHC   锌指蛋白   At5g04270   scc10-D   过量表达   分枝  

摘要： 植物株型的形成是一个受多种因素,如基因型、激素、环境和营养条件等影响的复杂生物学现象,而腋生器官的发生发育在此过程中起着非常重要的作用。在长日照条件下(16小时光照,8小时黑暗),以拟南芥隐花素突变体cry1cry2为研究背景构建了T-DNA激活标签突变体库,筛选得到与株型变化相关的突变体scc10-D,通过T-DNA激活标签插入位点的鉴定、T-DNA强启动子作用基因的克隆、重组、抗性筛选、遗传和生物信息学分析等研究,获得了以下主要研究结果： (1)以拟南芥隐花素突变体cry1cry2为背景,用激活标签技术构建了拟南芥的基因功能获得型T-DNA突变体库,获得了近2000个独立转化株系。通过抗性基因筛选和表型观察分析,在T1代转化植株中,共发现4个有显著的表型变化的株系,从中筛选得到一个与分枝相关的突变体scc10-D。采用IPCR等技术对拟南芥多分枝突变体scc10-D的插入位点进行分析鉴定,获得T-DNA在突变体cry1cry2基因组的插入位点是第5号染色体的90708核苷酸处。采用RT-PCR和实时定量PCR的方法对T-DNA基因组插入位点上游和下游6个侯选基因进行了mRNA转录表达水平的差异分析,结果发现在scc10-D多分枝突变体中,T-DNA的插入引起了DHHC型的锌指蛋白基因At5g04270的表达量上调,其余基因的表达量基本无明显上调变化。研究结果表明scc10-D突变体多分枝的表型由At5g04270基因表达量上调所致。 (2)克隆At5g04270并通过酶切连接的方法将其重组到过表达载体pEGAD,然后通过农杆菌GV3101浸花蕾的方法将(?)EGAD-At5g04270重组体通过转化整合到拟南芥野生型Col-4基因组,构建过量表达转基因植株35S::GFP-At5g04270。通过除草剂的连续三代筛选得到转基因植株的纯合体,结果发现该转基因植株分枝增加。同时,采用RT-PCR检测了转基因纯合体植株的mRNA水平,发现At5g04270基因的表达量上调,该结果进一步证实scc10-D突变体多分枝表型是由At5g04270基因表达量上调所致。采用三引物法对At5g04270基因T-DNA插入突变体(SALK006515)的DNA进行分子鉴定及纯合株系的筛选。采用RT-PCR的方法进行At5g04270转录mRNA表达分析,在SALK06515的纯合突变体中基本上检测不到At5g04270基因的表达,结果表明我们筛选到了SALK06515的纯合突变体。通过RT-PCR对拟南芥根、茎、莲座叶、茎生叶、花中分别提取At5g04270基因的mRNA转录表达的检测,At5g04270基因在各个不同器官中均有表达,在花和莲座叶中表达量较高,根、茎、茎出叶较低,莲座叶中表达量比花中高。 (3)利用拟南芥TAIR和NCBI网站提供的生物信息学数据对At5g04270的对该基因锌指结构域DHHC定点突变的At5g04270C105A进行了氨基酸修饰位点、信号肽序列、跨膜结构以及亲疏水性对比分析,预测结果发现At5g04270所编码的蛋白是一个膜蛋白,存在3个主要的跨膜结构域及一个次要的跨膜结构域和DHHC-CRD结构域,可能具有蛋白质酰基转移酶的活性。氨基酸C(半胱氨酸)是脂肪族含巯基的极性氨基酸,氨基酸A(丙氨酸)是脂肪族的非极性氨基酸。At5g04270的DHHC定点突变的DHHA后,由于氨基酸极性的改变,预测其可能改变了结构域与锌离子的结合能力,使其失去了蛋白质酰基转移酶的活性。 (4)采用搭桥PCR方法将At5g04270基因的DHHC结构域定点突变为DHHA,然后将At5g04270和发生定点突变的At5g04270C105A克隆到酵母的表达载体pYES260,然后将该重组载体转化到酵母蛋白酰基转移酶ARK1的突变体ark1,结果发现在30℃的条件下,通过载体上的GAL1强启动子在半乳糖的选择培养基中过表达At5g04270,能够使成ARK1的突变体ark1表型恢复为ARK1表型,而发生定点突变的At5g04270C105A在同等培养条件下却不能恢复其表型,该研究结果说明At5g04270具有蛋白质酰基转移酶活性,DHHC结构域是该酶的功能结构域。通过酶切连接技术成功构建了原核表达质粒pCold-At5g04270;通过Gateway技术成功构建了原核表达质粒pDEST17-At5g04270,将At5g04270克隆到原核表达载体pCold和pDEST17,为进一步研究At5g04270基因的功能提供基础。

关键词： Abiotic stress   Arabidopsis   High mobility group protein   Transgenic plant  

摘要： [Objective]To better understand the functions of High Mobility Group B （HMGB） proteins in the transcriptional regulation of plant stress responses.[Method]We cloned the At2G33450 gene encoding At2G34450 protein in Arabidopsis *** vectors carrying the above gene were transformed into Arabidopsis to detect the influences of environmental stimuli to transgenic Arabidopsis.[Result] Under salt or drought stress the transgenic Arabidopsis plants over-expressed At2G33450 displayed retarded germination and subsequent growth compared with wild-type plants.[Conclusion]Our results provide a novel basis for understanding the biological functions of HMGB protein family members that differently affect germination and seedling growth of Arabidopsis plants under various stress conditions.

关键词： 非生物胁迫   拟南芥   转基因植物   高迁移率族蛋白  

摘要： [目的]研究高等真核生物细胞核中的高迁移率族蛋白B(HMGB)在植物胁迫反应的转录调控中的作用方式。[方法]克隆了拟南芥中编码HMGB蛋白的基因At2G33450,将其转化拟南芥并筛选出超表达的转基因植株,检测干旱、高盐等非生物胁迫对转基因拟南芥的影响。[结果]在盐或干旱胁迫下,过度表达At2G33450的转基因拟南芥与野生型相比,出现萌发及生长迟缓现象。[结论]HMGB蛋白家族中的At2G33450蛋白对各种胁迫条件下拟南芥的生长发育具有重要作用。

关键词： 水稻   拟南芥   核质间转运   小G蛋白Ran   非生物胁迫  

摘要： 植物作为固定生长的生物,必须对外界变化的生长环境条件作出迅速反应以适应环境的改变。盐害、干旱及极端温度等非生物胁迫严重影响植物生长发育过程,是造成全球农业减产的重要因素。研究植物响应非生物胁迫反应的信号传导分子机理,对农作物的基因改良,提高主要作物对非生物胁迫的耐受能力,从而保持全球粮食的稳定供应有着重要的意义。\n 小G蛋白Ran是importinβ受体家族介导的核质间转运过程中一个必需的调控蛋白因子。此外它在细胞有丝分裂过程及分裂后核组装过程中也有重要作用。迄今为止,愈来愈多的研究报道表明,调控蛋白在核质间的分隔在植物生长发育及响应外界环境变化的信号传导过程中起重要的调控作用。我们研究发现Ran在植物生长发育和响应非生物胁迫过程中发挥重要作用。实验主要包括以下两个部分:\n (1)水稻小G蛋白基因OsRAN2的功能研究。\n 关于植物中Ran的研究在拟南芥,西红柿,小麦中已有报道。而水稻中的这类蛋白目前为止还未有报道。我们实验结果发现:(ⅰ)水稻Ran家族(包括OsRAN1,OsRAN2和OsRAN3)与人类Ran/TC4以及拟南芥或者小麦中的同原物享有保守的蛋白序列和结构特征。OsRAN2主要定位在细胞核内,部分定位在细胞质中,这与动物细胞中Ran以RanGTP形式定位在细胞核内,以RanGDP形式定位在细胞质中的结果一致。(ⅱ)盐胁迫、渗透胁迫和外源ABA处理会下调OsRAN1和OsRAN2的转录表达。而且我们发现,ABA合成抑制剂氟啶酮会部分消除盐胁迫和渗透胁迫条件下OsRAN2的表达下降趋势,而外源添加ABA又会一定程度地恢复这种下调趋势。这就表明,OsRAN2在水稻响应非生物胁迫反应过程中的作用可能部分是通过ABA信号分子来介导的。另外我们还发现,外源水杨酸SA和茉莉酸JA处理也会下调OsRAN2的表达。(ⅲ)高表达OsRAN2的转基因水稻和拟南芥植株对这些非生物胁迫处理敏感。我们鉴定到在盐胁迫或者外源ABA处理条件下,胁迫响应基因AtNCED3、AtPLC1和AtMYB2在转基因拟南芥中有较高的诱导表达。玉米(Zea mays)转录因子Lc是一种入核转运的报告基因。而且高表达OsRAN2会破坏Lc在烟草(Nicotiana tabacum *** No.1)表皮细胞中的亚细胞定位,使得Lc不能完全定位到细胞核中。我们推测,高表达OsRAN2的转基因植株对胁迫反应的敏感,一方面是通过调节胁迫相应基因如AtNCED3、AtPLC1和AtMYB2的表达来实现的,另一方可能是由于一些重要调控蛋白在细胞核质间的转运被破坏而导致的。(ⅳ)OsRAN2高表达和RNAi(RNA interference)的转基因水稻植株还表现出多种生长发育表型。如高表达OsRAN2的转基因植株抽穗要比野生型植株晚；RNAi转基因植株为雄性不育,且分蘖不正常,花序发育不正常等等。我们推测,OsRAN2的过量表达或者OsRAN1-2下调表达很可能引起了转基因植株中不正常的RanGTPase循环,从而造成了不正常的核质间转运、细胞有丝分裂等过程,最终使得转基因植株表现出一系列的生长发育表型。\n (2)拟南芥Ran家族参与的非生物胁迫反应\n 有报道称,拟南芥中AtRAN1,AtRAN2和AtRAN3可能参与了光受体介导的植物光信号传导途径。我们实验发现,在盐胁迫和外源ABA处理条件下,AtRAN1,AtRAN2和AtRAN3表达被上调。而且双突变体ran1/ran3-1,ran-1/ran3-2,ran2/ran3-1和ran2/ran3-2表现出对盐胁迫和ABA处理的敏感。这些结果表明AtRAN1,AtRAN2和AtRAN3在拟南芥植株对非生物胁迫反应过程中起重要调控作用。我们推测,AtRAN1,AtRAN2和AtRAN3突变后,影响importinβ受体家族介导胁迫调控因子的核质间转运过程,最终引起了双突变体对非生物胁迫的敏感表型。

关键词： 拟南芥   突变体   再誉镰刀菌   抗性   植物激素   G蛋白  

摘要： 水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)被认为是传统的植物防卫激素，在调控植物对病原菌等生物性胁迫的抗性中发挥重要作用。它们通过诱导植物产生病程相关蛋白或植物防卫素等方式使植物产生系统获得性抗性和系统诱导性抗性并以网络状的信号传导形式共同抵御生物性胁迫。此外，脱落酸(ABA)和G蛋白也可以通过影响JA、ET和胼胝质的形成来抵抗病原菌的侵入。本论文以拟南芥JA、ET、SA和ABA生物合成和信号转导突变体以及G蛋白突变体为材料，研究了植物激素和G蛋白在拟南芥对再誉镰刀菌抗性中的作用及其机制。\n 1.建立了再誉镰刀菌侵染拟南芥的体系，发现再誉镰刀菌可侵染拟南芥Col-0生态型，症状首先从叶缘开始发生，逐渐形成褐色病斑，菌丝可以侵染开花期的顶端组织造成顶端组织坏死，进一步导致植株的黄化和萎蔫甚至死亡。\n 2.以SA信号转导突变体npr1和转基因植株NahG为材料结合外源SA处理研究了SA及其信号转导组分在拟南芥对再誉镰刀菌抗性中的作用，研究发现npr1和NahG对再誉镰刀菌的抗性降低，而外源SA处理后植株抗性增强，这表明SA及其信号转导组分在拟南芥对再誉镰刀菌抗性中起正向调节作用。npr1和NahG抗性的降低可能与病程相关基因表达受到抑制有关。\n 3.以JA信号转导突变体jar1和coi1为材料结合外源茉莉酸甲酯(MeJA)处理研究了JA及其信号转导组分在拟南芥对再誉镰刀菌抗性中的作用，研究发现jar1抗性降低，而coi1抗病性则显著增强。jar1抗性降低可能与JA与异亮氨酸衍生物合成受阻，导致JA诱导的应答反应被抑制有关。而coi1抗性的增强则有可能与其激活SA和ET途径有关，也有可能与COI1突变后再誉镰刀菌分泌的效应物挟持这一受体而侵染拟南芥的机制受阻断有关。\n 4.以ET信号转导突变体ein3为材料结合外源乙烯利和AgNO3处理研究了ET及其信号转导组分在拟南芥对再誉镰刀菌抗性中的作用，研究发现发现EIN3信号阻断和野生型植株外源AgNO3处理后其抗性降低，而外源乙烯利处理后植株抗性增强，这表明ET及其信号转导组分EIN3正向地参与拟南芥防御再誉镰刀菌的反应。基因表达分析表明ein3对再誉镰刀菌抗性的降低可能与其在发病的早期阶段PDF1.2诱导能力的减弱有关。\n 5.以ABA信号转导突变体abi5-1为材料结合外源ABA处理研究了ABA及其信号转导组分在拟南芥对再誉镰刀菌抗性中的作用，研究发现abi5-1对再誉镰刀菌的抗性降低，而外源ABA处理后植株抗性增强，这表明ABA正向地参与调控拟南芥对再誉镰刀菌的防卫反应。基因表达分析表明abi5-1对再誉镰刀菌抗性的降低也可能与JA、ET和SA等防卫途径途径相关，JA、ET和SA等途径有可能在再誉镰刀菌侵染早期被抑制从而导致抗性降低。\n 6.以G蛋白β亚基缺失突变体agb1-2为材料研究了对G蛋白信号途径在拟南芥对再誉镰刀菌抗性中的作用。结果表明agb1-2对再誉镰刀菌抗性增强，这可能与其能更快速地诱导JA和ET信号途径有关。

关键词： 细胞外ATP   ROS   异三聚体G蛋白   Ca2+   质子泵   气孔  

摘要： 气孔运动关系到植物与外界环境气体和水分的交换,气孔运动的调节机理是植物生理学研究的重要内容。细胞外ATP(extracellular ATP,eATP)作为一种信使分子,通过其特定的信号转导机制参与细胞代谢、生长和发育过程的调控。本文研究了eATP对气孔运动的影响,并对其信号转导过程中可能的信号传递组分进行了探索。 我实验室已经完成的研究结果显示,eATP能够作为信使分子促进拟南芥气孔开放,保卫细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)在eATP信号转导过程中发挥介导作用,异三聚体G蛋白α亚基参与了eATP诱导ROS合成、促进气孔开放的过程。但是,对于eATP信号转导过程中活性氧下游的生理变化还不清楚,异三聚体G蛋白其他两个亚基(Gβ、Gγ)在eATP调节气孔运动的信号转导过程中是否发挥作用也不清楚。因此,本文以拟南芥野生型、异三聚体G蛋白基因缺失突变体和超表达株系、活性氧合成的关键酶—NADPH氧化酶的基因缺失突变体为材料,采用表皮条生物分析、激光共聚焦显微技术、非损伤微测技术对异三聚体G蛋白和ROS在eATP调节保卫细胞Ca2+流和H+流的过程中发挥的作用进行了探索。结果表明: 异三聚体G蛋白β、γ亚基基因缺失突变体在外加ATP处理之后,气孔开度明显增大,突变体及其野生型气孔对eATP刺激的反应没有明显差异;ATP处理后,野生型和突变体保卫细胞内ROS含量都有显著升高。这些结果显示,Gβ、Gγ可能不参与eATP诱导胞内ROS升高、促进气孔开放的过程。 为进一步探索eATP调节气孔运动的生理机制,我们利用非损伤微测技术测定了eATP处理后拟南芥保卫细胞Ca2+流和H+流的动态变化。结果显示,在eATP处理之后,保卫细胞跨膜Ca2+内流增加;在Gα基因缺失突变体中,外加ATP对Ca2+流没有产生明显的影响,而在Gα基因超表达株系中,Ca2+内流显著增强,Gβ、Gγ基因缺失突变体Ca2+流对eATP刺激的反应与野生型没有明显差异。在NADPH氧化酶的基因缺失突变体中,eATP处理几乎没有引起Ca2+流的变化。这些结果表明,eATP可能通过活性氧促进钙离子内流促进气孔开放,在此过程中,Gα起到了重要的介导作用,而Gβ、Gγ未参与其中。 H+流检测的结果显示,eATP处理引起保卫细胞跨膜H+外流增加。在NADPH氧化酶的基因缺失突变体中,eATP处理没有引起H+流的变化。在Gα基因缺失突变体中,外加ATP对H+流几乎没有影响,而在Gα基因超表达株系中,H+外流明显增强;Gβ、Gγ基因缺失突变体与野生型之间没有明显差异。这表明eATP可能通过ROS激活细胞质膜质子泵、促进细胞向外排放H+离子,并最终促进气孔开放程度加大。在此过程中,Gα可能参与了信号转导过程,而Gβ、Gγ未参与。

关键词： 拟南芥   低温胁迫   POD   SOD   MDA  

摘要： 采用分光光度法测定了低温胁迫下两种拟南芥G蛋白突变体的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的活性及丙二醛(MDA)含量的变化。结果表明:在低温12h,野生型(Ws)和突变体gpa1-1的SOD酶活性迅速升高,分别为15.501 U/mg protein和9.453 U/mg pro-tein,突变体gpa1-2则在低温24 h升至最高点,酶活性为6.325 U/mg protein。低温胁迫下,三种材料的POD酶活性都呈现降低趋势,而MDA含量呈上升趋势。初步证明外界低温刺激与植物细胞内G蛋白有一定的关联。