关键词： Arabidopsis   High mobility group protein   Pichia pastoris   Eukaryotic expression  

摘要： [Objective] The aim was to study the expression of Arabidopsis gene A/2G34450 in Pichia pastoris and to obtain recombinant Arabidopsis HMGB protein. [Method] The At2G34450 gene was cloned into yeast expression vector pPIC9K containing AOXl promoter and the sequences of secreting α-signal peptides. Recombinant plasmid was linearized by Sal l and transformed into P. pastoris GSl15 competent cells by electroporation. Positive integrated clones were screened out, and the At2G34450 protein was expressed under the induction of methanol. [Result] The At2G34450 protein was expressed in yeast medium through methanol induction. SDS-PAGE results showed that recombination product was At2G34450 protein. [Conclusion] At2G34450 protein was successfully expressed in the P. pastoris system for the first time, which paves a direct path to further research on the functions of HMGB family members.

关键词： 异三聚体G蛋白   紫外线B辐射   气孔运动   拟南芥  

摘要： 【目的】了解异三聚体G蛋白在紫外线B(UV-B)辐射诱导气孔关闭中的作用,为进一步阐明植物细胞转导UV-B辐射信号的机制提供依据。【方法】以拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型、G蛋白α亚基基因缺失突变体及其超表达株系和组成活化型株系为材料,并结合药理学试验,通过气孔开度分析确定G蛋白在0.5 W.m-2UV-B辐射诱导拟南芥叶片气孔关闭中的作用。【结果】细菌毒素试验表明,G蛋白抑制剂百日咳毒素(PTX)能显著抑制UV-B诱导的气孔关闭,而其活化剂霍乱毒素(CTX)能模拟UV-B的作用诱导可见光下叶片气孔关闭。遗传学试验显示,UV-B不能诱导异三聚体G蛋白α亚基GPA1功能缺失突变体gpa1-1和gpa1-2的气孔关闭,却能诱导其超表达株系wGα和组成活化型株系cGα的气孔关闭,且cGα在可见光下气孔开度明显小于野生型,在UV-B辐射初期其气孔关闭速度明显快于野生型。【结论】异三聚体G蛋白α亚基参与了UV-B辐射诱导拟南芥叶片气孔关闭的信号转导过程。

关键词： SCBP60g蛋白   表达模式   PCR技术   GUS组织化学染色   植物模型  

摘要： 钙调素结合蛋白的分离鉴定及其结构功能、理化性质的研究对阐明 Ca2+/CaM在生物体内的复杂调控机制具有重要意义。为了明确 SCBP60g蛋白在拟南芥中的表达模式及其功能，本论文进行了如下研究：\n 1、采用PCR技术从拟南芥中克隆了SCBP60g基因的启动子，并和GUS报告基因相融合，将构建好的重组表达载体转化野生型拟南芥，对获得的转基因株系进行GUS组织化学染色，结果表明：SCBP60g基因的启动子能指导GUS报告基因在拟南芥的根、茎、叶和花中表达，并且在这些部位的维管束表达较强。\n 2、通过 RT- PCR技术从拟南芥中克隆获得 SCBP60g基因的cDNA序列，利用Gateway克隆技术将SCBP60g基因的cDNA和GFP报告基因相融合，构建了 CaMV35S启动子驱动的融合表达载体 p35S::GFP-SCBP，以空载体 p35S::GFP为对照。将重组载体转化野生型拟南芥，并经筛选获得 T2代转基因株系。利用激光扫描共聚焦显微镜观察转基因株系的根部细胞，结果发现：转空载体的株系绿色荧光分布于整个细胞膜、细胞质和细胞核中，转 p35S::GFP-SCBP载体的株系绿色荧光分布于细胞核内，表明 SCBP60g蛋白定位于细胞核内。\n 3、通过 RT-PCR技术从拟南芥中克隆获得 SCBP60g基因的cDNA序列，利用Gateway克隆技术将SCBP60g基因的cDNA序列融合到双元载体 pMDC32上，构建了 CaMV35S启动子驱动的表达载体 p35S::SCBP，将构建好的互补载体转化 cbp60g-1突变体，并经筛选获得转基因纯合株系。通过细菌生长量检测，对 SCBP60g蛋白的功能进行初步的探讨。

关键词： 胞间连丝   AtRGP2   At1g19190   细胞骨架   显微嫁接  

摘要： 胞间连丝(plasmodesmata, Pd)是一个联通两个邻近的植物细胞的共质体通道。在本研究中,我们构建了GFP和At1g19190的融合蛋白表达载体,并成功转化拟南芥。通过与AtRGP2:YFP融合蛋白共定位以及苯胺蓝染色实验,结果表明At1g19190可能定位于胞间连丝；用细胞骨架阻断剂处理稳定表达GFP:At1g19190的转基因拟南芥,结果表明只有在秋水仙素处理后能够扰乱At1g19190在胞间连丝的定位,而BFA和细胞松弛素B不能影响At1g19190在胞间连丝的定位；利用显微嫁接的手段研究了GFP:At1g19190和AtRGP2:YFP的长距离运输,当把稳定表达GFP:At1g19190的转基因拟南芥和野生型进行嫁接后,无论野生型作为砧木还是接穗,都可以在野生型中检测到荧光信号,相反,当把AtRGP2:YFP的拟南芥稳定表达株和野生型进行嫁接后,在接口处产生荧光堆积现象,荧光信号没有转运到野生型中。总之,本研究表明At1g19190是一个新的胞间连丝相关蛋白,在依赖微管的转运途径中可能起负调节作用,并能够依赖微管进行长距离运输,对At1g19190的研究,有助于深入了解胞间连丝的结构组成,阐明植物细胞间物质和信息长距离运输的调控机制。

关键词： TAPa-LP   Gα   拟南芥   朗伯-比尔定律   蛋白质结构  

摘要： G蛋白是普遍存在于真核生物细胞中的一个与GTP结合蛋白家族,与膜受体偶联(Heterotrimeric GTP binding proteins),由α,β,γ三个亚基组成异三聚体复合物,分子量100kDa左右。哺乳动物目前发现23种左右的Gα,6种Gβ,14种Gγ蛋白,每个亚基都由多基因编码,从而构成多种多样的可能组合方式。目前已在豌豆、玉米、菠菜、拟南芥、燕麦、大豆、大麦、水稻等多种植物细胞中检测到了G蛋白的存在。植物中G蛋白数目很少,任一G蛋白亚基在各种植物中只有1到2个成员。如拟南芥中只有1个Gα,1个Gβ和2个Gγ。相互作用的只有少数几个蛋白,包括与Gα互作的AtPirinl (PRN1)、prephenatedehydratase1(PD1)、THYLAKOID FORMATION1(THF1)和PLDa1,以及与Gβ互作的N-MYCDOWN-REGULATED1(NDL1)。植物G蛋白的空间结构目前了解极少,主要是参考动物的G蛋白进行推测。Ga亚基有两个独立区域组成,一个区域(GTPase区)含有GTP结合域,这个区域参与GTPase结合。另一个区域即完整的α螺旋区域,它是由一个长的中心螺旋和5个短的螺旋组成,该区域是识别效应物的区段。目前对拟南芥G蛋白的了解很有限,需要进一步研究G蛋白的结构与功能,信号转导机制,及其相互作用因子。 因此我们发展了含有连接肽的串联亲和层析技术(命名为TAPa-LP),用以研究拟南芥G蛋白的互作因子,蛋白结构及其生理作用。 串联亲和纯化(tandem技术通过靶蛋白质一端嵌入一个特殊的蛋白质标签(TAP tag),不破坏靶蛋白质序列,经过两步连续的亲和纯化获得接近自然条件的特定蛋白质复合体,然后用质谱技术或Edman降解法进行蛋白质鉴定。 融合蛋白的功能可能改变或丧失(有的不影响),这也是TAP方法固有的一个缺点,解决的办法是增加一个柔性连接肽,使两边的蛋白质空间结构各自独立,减少干扰。本实验设计的连接肽为GGGGSGGGGGS,核酸序列为GGAGGAGGAGGATCAGGA GGAGGAGGAGGATCA,并构建了5套载体：p2300EC-GPT, p2300EC-GT, p2300EC-QT, p2300EC-QPT和p2300EC-FPT,这5种类型中有3种有连接肽,另2种不含连接肽。 TAPa-LP系统揭示了G蛋白在植物的发育过程起着极其复杂的作用。我们发现在叶、茎、花和果实的发育过程中GTP-Ga是一种正调控因子,而GTP-Ga在种子花青素和根的发育过程中为负调控因子。Gaβγ在主根、茎和果实的发育过程是正调控因子,而在叶片的表皮细胞横向增值的过程中起着负调控作用。也就是说在拟南芥发育过程中,GTP-Ga在不同的组织分别发挥4种正调控和2种负调控作用。三聚体Gap丫发挥着3种正调控和1种负调控作用。Gaβγ和GTP-Ga在根和叶的发育中起着相反的调控作用。我们推测·Gaβγ和GTP-Ga的比值影响着或强烈影响植物的生长。 在gpal和fpt中GPA1的缺失导致Gapy和GTP-Ga两者均缺失,植物的生长并没有受到明显的影响,这可能是因为G蛋白参与的正负调控的双双缺失造成的。这也说明G蛋白在植物的发育过程中并不是主要的调控元件,可能存在着另外的不为G蛋白参与的调控模式。gpt在T2代的类型中长的高大而粗壮,可能是35S启动子较强的功能提高了Gaβγ和GTP-Ga的含量。 qpt在T1代生长健壮但在T2代生长的极其柔弱,主根几乎不再生长,最终是全体死亡。其原因极可能是T1代的激素水平不同于T2种子的水平。看来植物生长的调控不仅依赖于Gaβγ和GTP-Ga的含量,而且也依赖于激素水平,不同的植物激素进行着复杂的植物的生长调控。 通过TAPa或linker-TAPa对Ga功能的干涉情况,来判断Ga亚基在空间结构上调控区域所在的空间位置。从实验情况来看,TAPa或linker-TAPa标签有时会影响Ga的功能。Ga的三维结构呈现出两个独立的区域,根据SWISS-MODEL预测的融合蛋白的结构,呈现出三个独立的区域,也就是比Hamm报道的多了TAPa区域。 当G、GPT、 QT和QPT中的一种或2种或3种能明显引起拟南芥某种表型发生变化时,调控区域可能定位在C端区域,因为TAPa干扰了G蛋白的功能,靠近C端最有可能的调控区是A stem, I primary root, A primary root, A silique size, I Seed color和A leaf。Gβγ二聚体结合在Ga的N端区域,功能区多在C端。 在筛选拟南芥G蛋白α亚基GPA1蛋白互作因子过程中,成功获取了Gγ1和Gβ两个互作因子,并首

关键词： UV-B   异三聚体G蛋白   H2O2   NO   气孔运动、拟南芥  

摘要： 紫外线B (UV-B)作为一种重要的环境信号调控着植物的生长发育,但目前对其信号转导机制却知之甚少。动物细胞中研究已表明异三聚体G蛋白参与了UV-B辐射信号的传递,但G蛋白是否也参与植物细胞响应UV-B信号的传递却并不清楚。在植物气孔运动的研究中,许多证据表明G蛋白参与了脱落酸、胞外钙调素、病源激发子和臭氧等多种刺激调控气孔运动的信号转导过程,且其作用是调控信号分子过氧化氢(H202)和一氧化氮(NO)的形成。在UV-B调控气孔运动的研究中,前期研究已表明H202和NO参与了UV-B诱导气孔关闭的信号转导过程,但对于(1)UV-B诱导H202和NO形成的具体酶学途径；(2)G蛋白是否参与该UV-B信号转导过程；(3)G蛋白与H202和NO的关系等一系列问题均不清楚。本研究结合药理学、遗传学和细胞生物学的研究方法,以模式植物拟南芥为材料,对上述问题进行了研究,得到以下主要实验结果和结论： 1.以野生型拟南芥叶片为材料,当UV-B辐射强度达到0.5W·m-2时诱导气孔关闭最为显著,且该剂量UV-B在辐射3h后气孔关闭程度最显著,说明0.5W·m-2UV-B辐射处理3h是诱导拟南芥叶片气孔关闭的最适辐射剂量和处理时间,故以下实验均采用该UV-B辐射强度处理3h。 2.G蛋白抑制剂百日咳毒素(PTX)能显著抑制0.5W·m-2UV-B诱导的气孔关闭,而其活化剂霍乱毒素(CTX)能模拟UV-B的作用诱导可见光下叶片气孔关闭；UV-B辐射不能诱导G蛋白α亚基GPA1的功能缺失突变体gpal-1和gpal-2的气孔关闭,却能诱导GPA1基因过表达株系wGa和其组成活化型株系cGa的气孔关闭,且cGa和wGα在UV-B辐射下气孔关闭速度明显快于野生型。表明异三聚体G蛋白α亚基参与了UV-B辐射诱导拟南芥气孔关闭的信号转导过程。 3.H202的清除剂抗坏血酸(ASA)和过氧化氢酶(CAT)以及NADPH氧化酶抑制剂二苯基碘(DPI)均能显著抑制UV-B诱导拟南芥野生型气孔关闭和保卫细胞H202的生成；但UV-B不能诱导NADPH氧化酶AtrbohD和AtrbohF的功能缺失单突变体和双突变体的气孔关闭和保卫细胞H2O2的生成。说明H2O2参与了UV-B诱导拟南芥气孔关闭的过程,且H2O2的形成依赖于NADPH氧化酶AtrbohD和AtrbohF。 ***能显著抑制UV-B诱导保卫细胞H2O2的形成,外源H2O2也能逆转PTX对UV-B诱导气孔关闭的抑制效应；CTX能诱导可见光下保卫细胞H2O2的生成,且其诱导的H202的生成和气孔关闭均可被ASA、CAT和DPI抑制；UV-B不能诱导突变体gpal-1和gpal-2的保卫细胞形成H202,却能使cGa和wGa保卫细胞H202形成量高于野生型；外源H202能诱导可见光和UV-B辐射下突变体gpal-1和gpal-2的气孔关闭,CTX也不能诱导NADPH氧化酶AtrbohD和AtrbohF的功能缺失单突变体和双突变体的气孔关闭和保卫细胞H202的生成。上述结果表明在UV-B诱导气孔关闭的信号转导过程中Ga作用于H202的上游。 ***清除剂c-PTIO和硝酸还原酶(NR)抑制剂钨酸钠均能抑制UV-B诱导的拟南芥野生型气孔关闭和保卫细胞NO的形成；但UV-B辐射不能诱导NR单突变体nial和双突变体nialnia2的气孔关闭和保卫细胞NO的形成,却能诱导NR单突变体nia2气孔关闭和保卫细胞NO的形成。该结果不仅再次证明NO参与了UV-B诱导气孔关闭的信号转导过程,而且进一步表明UV-B诱导的NO依赖于Nial,而不依赖于Nia2。 ***能抑制UV-B诱导保卫细胞NO的形成,外源NO供体硝普钠(SNP)也明显逆转PTX对UV-B诱导气孔关闭的抑制效应；CTX能诱导可见光下保卫细胞NO的生成,且其诱导的NO的生成和气孔关闭均可被c-PTIO和钨酸钠显著抑制；UV-B不能诱导突变体gpal-1和gpal-2的保卫细胞形成NO,却能使cGa和wGa保卫细胞NO形成量高于野生型；SNP能诱导可见光和UV-B辐射下突变体gpal-11和gpal-2的气孔关闭,CTX却不能诱导突变体nial和nialnia2的气孔关闭和保卫细胞NO的生成。上述结果表明UV-B诱导的保卫细胞NO形成依赖于Gα。 7.外源H202不能诱导可见光和UV-B辐射下突变体nial和nialnia2的气孔关闭,而SNP却能促使可见光和UV-B辐射下NADPH氧化酶AtrbohD和AtrbohF的功能缺失单突变体和双突变体的气孔关闭；UV-B辐射不能诱导NADPH氧化酶AtrbohD和AtrbohF的功能缺失单突变体和双突变体的保卫细胞形成NO,却能诱导突变体nial和nial/nia2保

关键词： 气孔   细胞外ATP   异三聚体G蛋白   H+-ATPase  

摘要： 气孔是植物与外界环境进行气体交换和水分代谢的通道，每个气孔均由一对保卫细胞组成。随着离子流动的变化和许多特异的渗透调节因子的调节，保卫细胞通过开关气孔完成植物与环境的水分及气体交换、响应外界环境变化、感受生物及非生物胁迫，使植物尽量迅速适应外界环境正常生存下去。 在植物中异三聚体G蛋白介导的信号级联反应是重要的信号转导机制，拟南芥中目前仅有一个典型的G蛋白α亚基，GPA1，它参与水分代谢的调节、ABA调节的保卫细胞运动等许多信号转导通路。 保卫细胞是在体内研究H+-ATPase活性及信号转导通路的理想系统，可以在生理学条件下研究H+-ATPase及相关调节元件的调节机制。目前已经证实H+-ATPase参与ABA诱导气孔运动过程、蓝光诱导气孔开放、植物与病原菌互作等多种进程。 本实验室前期的试验结果表明，异三聚体G蛋白α亚基参与eATP在光照条件下促进气孔开放、胞内Ca2+浓度的升高、ROS的产生以及H+离子流速上升等进程，而异三聚体G蛋白β、γ亚基不参与这些进程。 为探究eATP调节气孔运动的信号转导机制，我们采用拟南芥生态型ws、col-0及异三聚体G蛋白α亚基的功能缺失突变体gpα1-1、gpα1-2，过表达株系wGα、cGα，还有在拟南芥保卫细胞中大量表达的H+-ATPase AHA1、AHA2、AHA5功能缺失突变体保卫细胞为材料，观察野生型与突变体在ATP处理前后气孔开度变化的差异，判断异三聚体G蛋白α亚基与H+-ATPase是否参与eATP诱导的气孔开放。结果显示，异三聚体G蛋白α亚基的功能缺失突变体及AHA1、AHA2、AHA5功能缺失突变体对ATP反应不明显，而ws、col-0及过表达株系的气孔开度则在加入ATP后明显增大。这说明，异三聚体G蛋白α亚基与H+-ATPase很有可能参与了eATP诱导的气孔开放过程。 为探究ATP引起的质子外流是否由H+-ATPase介导，我们使用非损伤微测技术对在拟南芥保卫细胞中大量表达的H+-ATPase AHA1、AHA2、AHA5功能缺失突变体及col-0加入ATP后保卫细胞质膜H+流速进行了测定。结果表明，AHA1、AHA2、AHA5功能缺失突变体中加入ATP后虽能够产生一定量的质子外流，但是其流速和持续时间均明显小于野生型中得到的结果。表明拟南芥保卫细胞中大量表达的H+-ATPase AHA1、AHA2、AHA5参与了由eATP诱导气孔开放的过程。

关键词： 植物代谢   气体交换   渗透调节   细胞形态学  

摘要： 气孔是植物与外界环境进行气体交换和水分代谢的通道,每个气孔均由一对保卫细胞组成。随着离子流动的变化和许多特异的渗透调节因子的调节,保卫细胞通过开关气孔完成植物与环境的水分及气体交换、响应外界环境变化、感受生物及非生物胁迫,使植物尽量迅速适应外界环境正常生存下去。在植物中异三聚体G蛋白介导的信号级联反应是重要的信号转导机制,拟南芥中目前仅有一个典型的G蛋白a亚基,GPAl,它参与水分代谢的调节、ABA调节的保卫细胞运动等许多信号转导通路。保卫细胞是在体内研究H+-ATPase活性及信号转导通路的理想系统,可以在生理学条件下研究H+-ATPase及相关调节元件的调节机制。目前已经证实H+-ATPase参与ABA诱导气孔运动过程、蓝光诱导气孔开放、植物与病原菌互作等多种进程。本实验室前期的试验结果表明,异三聚体G蛋白a亚基参与Eatp在光照条件下促进气孔开放、胞内Ca2+浓度的升高、ROS的产生以及H+离子流速上升等进程,而异三聚体G蛋白β、丫亚基不参与这些进程。　　本研究采用拟南芥生态型ws、col-O及异三聚体G蛋白a亚基的功能缺失突变体gpa1-1、gpa1-2,过表达株系wGa、cGa,还有在拟南芥保卫细胞中大量表达的H+-ATPase AHAI、AHA2、AHA5功能缺失突变体保卫细胞为材料,观察野生型与突变体在ATP处理前后气孔开度变化的差异,判断异三聚体G蛋白a亚基与H+-ATPase是否参与Eatp诱导的气孔开放。结果显示,异三聚体G蛋白a亚基的功能缺失突变体及AHAI、AHA2、AHA5功能缺失突变体对ATP反应不明显,而ws、col-o及过表达株系的气孔开度则在加入ATP后明显增大。这说明,异三聚体G蛋白a亚基与H+-ATPase很有可能参与了Eatp诱导的气孔开放过程。为探究ATP引起的质子外流是否由H+-ATPase介导,我们使用非损伤微测技术对在拟南芥保卫细胞中大量表达的H+-ATPaseAHAI、AHA2、AHA5功能缺失突变体及col-O加入ATP后保卫细胞质膜H+流速进行了测定。结果表明,AHAI、AHA2、AHA5功能缺失突变体中加入ATP后虽能够产生一定量的质子外流,但是其流速和持续时间均明显小于野生型中得到的结果。表明拟南芥保卫细胞中大量表达的H+-ATPaseAHA1、AHA2、AHA5参与了由Eatp诱导气孔开放的过程。

关键词： 拟南芥   高迁移率族蛋白   毕赤酵母   真核表达  

摘要： [目的]观察拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母体系中的表达,获得重组蛋白。[方法]将At2G34450基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SaⅠl将重组质粒线性化,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性整合子进行甲醇诱导表达。[结果]拟南芥At2G34450在酵母培养基中实现了表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定为重组蛋白。[结论]在毕赤酵母真核系统中实现了拟南芥At2G34450蛋白的表达,为进一步研究拟南芥HMGB家族蛋白打下了基础。

关键词： 花粉发育   种子重量与体积   WD40-repeat蛋白  

摘要： 植物中WD40-repeat蛋白在细胞周期调控等方面具有重要作用。本研究鉴定了一株拟南芥WD40-repeat蛋白基因突变体at1g65030,与野生型植株相比种子重量增重体积变大,营养生长长势较弱,角果种子结实率较低。以突变体作为母本/父本与野生型父本/母本杂交,前者杂交后代未显示有母本的突变表型,后者部分杂交后代显示出父本的突变表型,统计突变体后代分离比符合1:1。用苯胺兰(DAB)、4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)、碘-碘化钾花粉染色,发现花粉部分败育且主要为核败育。爱氏苏木精花粉染色结果显示可观察到正常减数分裂各时期形态。采取热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)方法确认突变基因位于第一条染色体65030位置,生物信息学分析表明该基因含有DWD基序。半定量RT-PCR分析发现在拟南芥发育晚期该基因在花器官中大量表达,过表达该基因使种子重量减轻。推测At1g65030影响了拟南芥花粉发育细胞核有丝分裂过程,该研究增加了人们对调控拟南芥花粉发育分子机制的认识。