关键词： 水稻   拟南芥   核质间转运   小G蛋白Ran   Dof转录因子   细胞增殖   环境响应机理   基因改良  

摘要： 植物作为固着生长的生物，必须对外界环境的变化做出适度的反应。盐害、干旱、冷害及病害等环境胁迫都会严重影响植物生长发育，造成农业减产。植物进化出对环境胁迫信号感知，传导，整合和响应的一系列机制。本论文从信号分子小G蛋白Ran和植物特有的DOF转录因子着手研究植物响应环境胁迫的机制及其与生长发育之间的联系，为农作物的基因改良和提高植物对环境胁迫耐受提供理论依据。\n 研究内容包括以下几个部分:\n 1.水稻小G蛋白OsRAN1和拟南芥AtRAN1功能研究\n 小G蛋白Ran是importinβ受体家族介导的核质间转运过程中一个必须的调控蛋白。此外它在细胞有丝分裂过程以及分裂后核膜组装过程都有重要作用。很多报道显示，调控蛋白在核质间的分隔在植物生长发育及响应外界环境变化的信号传导过程中起重要的调控作用。我们的研究发现Ran参与细胞周期调控在植物响应低温胁迫中发挥重要作用。该功能在单子叶植物水稻和双子叶植物拟南芥中有一定的保守性。\n (1)水稻小G蛋白OsRAN1的功能研究\n 关于植物中Ran的研究在拟南芥，番茄，小麦，水稻中已有报道。但水稻中的OsRAN1蛋白目前为止还未见报道。我们实验结果发现:(i)水稻Ran家族（包括OsRAN1，OsRAN2和OsRAN3）与人类Ran/TC4以及拟南芥或者小麦中的同源基因享有保守的蛋白序列和结构特征，OsRAN1主要定位在细胞核内，部分定位在细胞质中。(ii)低温胁迫、外源IAA处理会上调OsRAN1的转录表达。(iii)高表达OsRAN1的转基因水稻和拟南芥植株对冷害耐受能力增强。(iv)OsRAN1高表达的转基因植株还表现出分枝增多，株高降低等生长发育表型。(v)进一步研究显示OsRAN1提高了水稻根尖细胞有丝分裂指数和增多了处于分裂期细胞数目从而提高对冷害的耐受。\n (2)拟南芥AtRAN1调控发育和冷胁迫响应研究\n 由于拟南芥和水稻Ran蛋白序列上的保守型可能预示着功能上的保守性，再者拟南芥中编码Ran蛋白的基因报道的有四个(AtRAN1，AtRAN2，AtRAN3和AtRAN4)，所以拟南芥中哪个/些Ran参与了低温信号传导，以及功能上的冗余性和特异性值得进一步研究。我们的实验结果显示:(i)在低温条件下，AtRAN1和AtRAN3基因表达被上调6倍左右，而AtRAN2和AtRAN4基因的表达不受影响。(ii)进一步的突变体结果分析显示atran1 atran3双突变体经过4℃低温驯化后对冻害的敏感性明显提高了，而atran1，atran2，atran3单突变体和野生型相比差异不明显，验证了AtRAN1和AtRAN3可能冗余地参与拟南芥对冻害的耐受。(iii)AtRAN1但不是AtRAN3过表达提高了拟南芥对冻害的耐受。(iv)AtRAN1参与冻害下细胞周期的进程和细胞核膜稳定性维持。(v) AtRAN1基因在开花时间调控和促进营养生长中有重要作用。\n 2.拟南芥DOF转录因子研究\n DOF(DNA binding with one finger)蛋白是植物所特有的一类转录因子。它含有一个独特的富含Cys残基的单锌指保守结构域，命名为DOF结构域。DOF结构域是一个双功能的结构域，它不仅介导与DNA的结合，而且介导蛋白与蛋白之间的相互作用。Zhang等最先报道了拟南芥的DOF蛋白OBP1就是通过其与bZIP(basic leucine-zipper)蛋白OBF4、OBF5的特异性相互作用而分离到的，另外OBP2，OBP3，OBP4相继被报道，这方面的工作我们重点围绕OBP4基因在调控细胞周期的新功能进行研究。\n 我们发现一个新的参与细胞周期调控的DOF转录因子OBP4(DOF5.4)，OBP4在分裂旺盛组织表达较强，其定位于细胞核。组成型表达的转基因植株表现出极矮化表型，细胞明显变小，生长发育受到抑制;我们在用雌激素诱导的转基因株系中诱导表达OBP4同样抑制了植株的生长;显示OBP4可能是细胞增殖的负调控因子。进一步的芯片结果显示OBP4能够抑制了G2-M期有重要作用的CYCB周期蛋白，CDKB激酶的表达以及和细胞延伸有关因子的表达水平(XTHs，EXPs)。流式细胞检测显示:过量表达OBP4导致细胞增殖能力降低，更多的细胞脱离细胞周期进程而进入了内复制过程，同时细胞壁延伸因子表达明显抑制。OBP4可能是通过对细胞周期核心调节基因控制细胞周期进程和细胞的扩张。该研究对于揭示植物细胞周期调控与植物生长发育之间联系具有重要意义。

关键词： 异三聚体G蛋白   阿罗酸脱水酶   L-苯丙氨酸   花青素   叶绿体蛋白转运   拟南芥   转基因植株  

摘要： 异三聚体G蛋白广泛存在于真核生物中，被誉为信号转导途径中的分子开关，介导胞外信号传递至胞内并引起一系列生理反应。在模式植物拟南芥中，G蛋白在种子萌发、细胞增殖、植株形态、气孔运动、逆境胁迫响应和叶绿体发育等方面发挥着重要的作用，但是其工作机理仍有待阐明。\n 为了解析G蛋白信号转导的分子机理，我们通过酵母双杂交手段筛选到一个与G蛋白α-亚基(GPA1)的互作蛋白，阿罗酸脱水酶(Arogenate dehydratase，ADT)。它们之间的相互作用在体内外分析中均得到验证，而且不同的ADT成员可以与不同活性状态的GPA1相互作用。同时，在酵母中也检测到AGB1和RGS1能与ADT互作。ADT催化苯丙氨酸合成的最后一步反应。拟南芥基因组有六个编码阿罗酸脱水酶的基因，命名为ADT1-ADT6。荧光定位结果显示ADT1-5与GFP融合蛋白均定位于叶绿体，而ADT6-GFP则定位于细胞核。组织特异性表达分析结果显示ADT1-ADT6在植物各个生长时期和组织器官中均有表达，ADT4和ADT5的表达水平较高。虽然遗传学及代谢产物分析表明ADT1-6具有功能冗余性，但ADT1、ADT2和ADT3在蔗糖诱导和冷胁迫诱导的花青素合成中发挥主要作用，而ADT4和ADT5在木质素和原花青素合成中发挥主要作用。\n 在所有ADT过表达的转基因植株中，只有ADT4/ADT5在野生型中过表达具有很严重的表型，例如真叶形状狭长，新叶颜色变淡，生长期滞后，乃至不育。有趣的是当ADT4或者ADT5在G蛋白突变体gpa1、agb1和rgs1背景中过表达可使表型减轻或消失。分离完整叶绿体和Western blot实验结果证明ADT4-GFP融合蛋白在gpa1突变体叶绿体中的含量同野生型比减少接近一半。体外叶绿体蛋白转运实验证明，激活态形式的GPA1-GTP可以调控ADT4/ADT5从细胞质到叶绿体的蛋白转运。进一步分析表明ADT4/ADT5通过atToc120/atToc132转运进入叶绿体，尽管体外的叶绿体蛋白转运分析的结果显示ADT4在野生型和突变体之间的蛋白转运效率没有差别。\n 以上实验结果显示了ADT4/ADT5蛋白转运进入叶绿体有两条途径:一条途径依赖G蛋白，一条途径不依赖G蛋白。依赖G蛋白的途径是由Gαβγ异三聚体和RGS1共同介导的。不依赖G蛋白的转运途径通过Toc120/Toc132，依赖G蛋白的转运途径是否通过Toc120/Toc132还有待验证。生理学及遗传学的数据表明ADT4/ADT5转运进入叶绿体受到光信号的调控，G蛋白复合体如何参与光信号的传递也有待于进一步的探索。

关键词： 拟南芥   AtCDKG2   花期转换   种子萌发   细胞周期   自主途径  

摘要： 植物从受精卵到成熟的孢子体,是通过细胞不断增殖、生长和分化实现的,因此细胞增殖是植物生长发育的基础。有丝分裂是真核细胞所特有的增殖方式,它是真核生物体细胞增殖的主要方式。具有有丝分裂能力的细胞具有细胞周期。它是指从一次细胞分裂完成,到下一次细胞分裂结束时的过程。一次有丝分裂,细胞遗传物质复制一次,分裂后将两套遗传物质均等分配给两个子细胞,这个机制保持了生物体的遗传稳定性。所以,细胞增殖及细胞周期的调控对生物的正常生长发育具有重要意义。 细胞周期蛋白依赖激酶和细胞周期蛋白是重要的细胞周期调控蛋白。两者结合形成二聚体结构并产生活性,可以将靶蛋白磷酸化,并实现其促进或抑制细胞周期的生理功能。因此他们被认为是调控细胞周期的关键调控元件。 拟南芥相对于其他真核生物,其基因组中含有更多的细胞周期调节基因。譬如,目前研究已经表明,拟南芥中有71个细胞周期调控蛋白编码基因,而酵母中只发现15个,人类也只发现23个。预示着在植物生长发育过程中存在更为复杂的细胞周期调控网络和机制。 CDK-G2属于细胞周期蛋白激酶CDK家族G亚家族成员,本论文研究工作以拟南芥CDKG2为研究对象,发现其参与了拟南芥开花调控过程及逆境胁迫相应,并对其可能的作用机制进行了系统分析。希望从细胞周期调控的角度,发现调控植物花期转换和非生物胁迫反应的新功能基因,丰富植物开花调控及耐逆的分子机理,并为培育农作物新品种奠定理论基础及提供基因资源。 本论文的主要研究内容及结果如下： 研究中发现CDKG2的功能缺失突变体(cdk2-1及cdkg2-2)在长日照下表现出早花的表型,而两个CDKG2过表达株系OE-1及OE-2则相对于野生型均表现出晚花性状,由此表明CDKG2基因参与了植物花期转换的调控。 随后分别研究了不同光周期、春化及赤霉素处理对cdkg2-1及cdkg2-2早花性状的影响,发现在长日照或短日照条件下,CDKG2功能缺失突变体均表现出早花性状,即对光周期响应正常；春化处理及GA处理后,突变体花期有所提前,且相对于野生型提前程度相同,即突变体对春化及GA反应正常。因此推测该突变体的早花性状可能是通过自主途径实现的。 此外CDKG2基因的时序及组织定位表达模式以及亚细胞定位表明,CDKG2在成熟组织表达量比幼嫩组织表达量高(如花粉、花瓣、花柄及雄蕊柄等),推测该基因的表达与组织分生能力负相关,可能对细胞分裂有阻滞效应,在细胞周期调控中起到“刹车闸”的作用。CDKG2与GFP融合蛋白的荧光观察显示,CDKG2蛋白表达主要定位于细胞核,可能与基因表达的调控相关。 此外,本研究还发现CDKG2参与了种子萌发过程。在盐胁迫条件下,与野生型相比,突变体萌发较早且萌发率高等其他性状,该现象预示着CDKG2还参与了植物植物生长发育过程中的逆境胁迫响应。

关键词： 拟南芥   耐盐性   G蛋白β亚基   生理生化指标   蛋白互作  

摘要： G蛋白(GTP结合蛋白)异源三聚体复合物通过GPCR(G蛋白偶联受体)将胞外信号传递给α、β和γ亚基,进而传递给各亚基下游的效应器,G蛋白复合体在细胞信号转导过程中发挥重要作用。目前,已有文献报道G蛋白复合体在植物中参与发育、激素响应、病原防卫反应和胁迫响应等各种重要的信号传导过程,但目前关于G蛋白参与盐胁迫响应过程的研究还未见报道。本研究比较野生型拟南芥(Col-0)和G蛋白β亚基(AGB1)突变体agb1-2在高盐胁迫下的表型、生理生化反应以及胁迫相关基因表达情况,解析AGB1调控植物耐盐性的作用机制。研究结果如下:1.表达谱分析结果表明,AGB1在冷和热胁迫条件下下调表达,在高盐胁迫条件下上调表达;2.在高盐胁迫条件下,相对于Col-0,agb1-2突变体对盐更加敏感,agb1-2的幼苗绿化率、植株鲜重、萌发率和存活率均降低,agb1-2的主根长更短;3.生理生化指标分析结果表明,在高盐处理后,agb1-2突变体中叶绿素含量、脯氨酸含量、POD(过氧化物酶)活力、Na+含量、K+含量较Col-0降低,而丙二醛含量和Na+/K+浓度比较Col-0升高,表明AGB1基因正向调节植物的耐盐性;4.胁迫相关基因表达分析表明,盐处理后,在突变体agb1-2中部分MAPK蛋白激酶(丝裂原活化蛋白激酶)基因,ABA响应、胁迫响应、离子通道、脯氨酸合成和氧化胁迫等相关基因的表达量均低于Col-0,这些下游基因控制的生理生化过程与3中测定的生理过程相符,推测这些基因处于AGB1基因的下游,通过控制3中测定的生理生化过程影响拟南芥的耐盐性;5.为进一步揭示AGB1的分子调控机制,利用酵母核系统筛选AGB1的互作蛋白,然后利用酵母互作实验、双分子荧光互补实验和蛋白体外pull-down实验验证AGB1与MAPK1蛋白互作,MAPK1可能参与AGB1调控植物的耐盐反应,具体调控机制有待进一步研究。综上所述,本研究对AGB1突变体盐胁迫的表型及生理生化指标进行鉴定,第一次确定AGB1正向调控植物的耐盐性;通过对AGB1可能的下游基因表达及互作蛋白进行鉴定,初步揭示AGB1调控植物耐盐性的分子机制。这些研究为进一步剖析整个G蛋白复合体调控植物逆境反应的分子机制创造条件。

关键词： G蛋白   泛素分离系统   蛋白互作   铝离子胁迫   双分子荧光互补  

摘要： 拟南芥G蛋白复合体(异源三聚体包括α、β、γ亚基)参与植物多个信号转导途径,G蛋白复合体通过膜上的G蛋白偶联受体(GPCR)接受胞外信号后通过3个亚基将信号传递给下游效应器。目前,有关植物G蛋白复合体的效应器及其信号传递途径的报道较少,寻找新的G蛋白的效应器有助于阐明G蛋白复合体相关的信号传导途径。本研究以拟南芥G蛋白α亚基GPA1为诱饵蛋白,利用泛素分离系统筛选拟南芥cDNA文库,获得一个与GPA1互作的铜离子结合蛋白AtBCB。荧光双分子杂交(BiFC)试验证明,GPA1与AtBCB的互作发生在细胞膜上。基因表达特性分析结果显示,GPA1和AtBCB受金属铝胁迫的诱导表达。进一步以野生型拟南芥(WT)、GPA1拟南芥突变体gpa1-4和AtBCB拟南芥突变体bcb为材料,研究该基因对植物耐金属铝胁迫的功能,结果显示,在无胁迫情况下,2个突变体和WT根部的丙二醛含量无显著差异;在100μmol L–1Al3+处理下,gpa1-4突变体根部丙二醛含量显著(P<0.05)低于WT低;bcb根部丙二醛含量极显著(P<0.01)高于WT。对3个铝胁迫响应基因(苹果酸转运体基因AtALMT1、半类型ABC转运蛋白基因ALS1和ABC转运蛋白基因ALS3)的表达进行Real-time PCR分析,比较它们在突变体和野生型之间的表达差异,发现在有铝和无铝处理情况下,ALS1和ALS3的表达水平在突变体和WT间均无显著差异;在铝处理下,gpa1-4中AtALMT1的表达量极显著高于WT;在bcb中的表达量显著低于WT。以上结果表明,植物通过细胞膜上的G蛋白α亚基GPA1和铜离子结合蛋白AtBCB的相互作用调控下游基因AtALMT1的表达,参与植物对铝胁迫的响应,其中GPA1对铝胁迫耐受起负向作用,AtBCB对铝胁迫耐受起正向作用。

关键词： 拟南芥   CtpA   D1蛋白   光系统II  

摘要： 采用电镜技术、Northern印迹技术、蓝绿温和胶电泳、SDS-PAGE电泳和蛋白免疫印迹等方法对拟南芥at3g57680基因缺失的突变体植株研究。结果表明:(1)突变体植株和野生型植株的叶绿体都呈扁球状,叶绿体的大小基本一样,叶绿体内部基质,基粒均匀分布,基粒类囊体垛叠层数相近;(2)psbA、psbB、psbC和psbO基因mRNA水平没有变化;(3)类囊体膜蛋白复合物的组成、表达量以及蛋白复合物各亚单位的组成和含量也是基本一致,且突变体与野生型植株中D1蛋白的表达量也保持一致。说明在正常生长环境中,拟南芥at3g57680基因的缺失对叶绿体显微结构、D1蛋白的成熟加工以及PSⅡ蛋白组成等没有影响,即at3g57680基因编码的类CtpA蛋白对PSⅡ功能没有影响。

关键词： G蛋白   硫化氢   过氧化氢   气孔关闭  

摘要： 硫化氢(H2S)可诱导拟南芥气孔关闭。本文以拟南芥野生型及其G蛋白α亚基缺失突变体(Atgpa1-3、Atgpa1-4)和β亚基缺失突变体(Atagb1-1、Atagb1-2)为材料,研究了G蛋白在H2S诱导拟南芥气孔关闭中的作用及其与H2O2的关系。结果表明,H2S可诱导野生型拟南芥气孔关闭及G蛋白α亚基(GPA)和β亚基(AGB)基因表达量增加,但对Atgpa1-3、Atgpa1-4、Atagb1-1和Atagb1-2叶片气孔运动无显著影响;G蛋白激活剂霍乱毒素(CTX)增强H2S诱导拟南芥气孔关闭的作用,而其抑制剂百日咳毒素(PTX)能够阻断H2S的诱导作用,表明G蛋白参与H2S诱导的拟南芥气孔关闭过程。同时,H2S诱导野生型拟南芥叶片及气孔保卫细胞H2O2含量升高,但对Atgpa1-3、Atgpa1-4、Atagb1-1和Atagb1-2无显著作用。CTX促进拟南芥叶片及气孔保卫细胞中H2O2积累,而PTX抑制H2S引起的拟南芥叶片及气孔保卫细胞中H2O2含量的升高。由此说明,G蛋白位于HO上游参与HS诱导的拟南芥气孔关闭过程。

关键词： 均一化cDNA文库   G蛋白复合体   泛素分离系统   蛋白质互作   铝离子胁迫  

摘要： 拟南芥G蛋白复合体（异源三聚体包括α、β、γ亚基）参与植物多个信号转导途径，G蛋白复合体通过膜上的G蛋白偶联受体（GPCR）接受胞外信号后通过三个亚基将信号传递给下游效应器。目前，有关植物G蛋白复合体的效应器及其信号传递途径的报道较少，寻找新的G蛋白的效应器有助于阐明G蛋白复合体相关的信号传导途径。本研究以拟南芥为实验材料，提取总RNA构建拟南芥均一化cDNA文库，并以拟南芥G蛋白α亚基GPA1为诱饵蛋白，利用泛素分离系统（hunter系统）筛选cDNA文库，以期获得新的GPA1互作蛋白，为阐明G蛋白参与的信号途径提供理论基础。本研究取得以下实验结果： 1、利用SMART技术（switching mechanism at5’-end of RNA transcript）和DSN技术（duplex-specific nuclease）构建了均一化的ABA处理的拟南芥cDNA文库，文库库容为1.079×106。 2、利用泛素分离系统筛选文库，共获得100个编码蛋白的基因。经过跨膜预测分析，在候选克隆中，61个蛋白具有1次以上跨膜结构域；26个蛋白具有3次以上跨膜结构域，证明利用泛素分离系统可以有效筛选与GPA1互作的膜蛋白。 3、在筛选的候选克隆中获得一个铜离子结合蛋白AtBCB。通过荧光双分子杂交实验（BiFC）证明GPA1与AtBCB在细胞膜上互作。 4、基因表达特性分析表明，GPA1和AtBCB受金属铝胁迫的诱导表达。在100μmol/L Al3+处理下，GPA1突变体gpa1-4根部丙二醛含量（丙二醛含量反映细胞受损程度，丙二醛含量高证明细胞受损程度高）显著（P<0.05）低于WT；AtBCB突变体bcb根部丙二醛含量极显著（P<0.01）高于WT，证明GPA1在植物铝胁迫耐受过程中起负向作用，AtBCB起正向作用。 5、分析三个铝胁迫响应基因（苹果酸转运体基因AtALMT1、半类型ABC转运蛋白基因ALS1和ABC转运蛋白基因ALS3）在野生型及突变体中的表达情况，结果发现，在有铝和无铝处理情况下，ALS1和ALS3的表达水平在突变体和WT间均无显著差异；在铝处理下，gpa1-4中AtALMT1的表达量极显著高于WT；在bcb中AtALMT1的表达量显著低于WT。 综合以上结果表明，采用泛素分离系统筛选cDNA文库获得的100个GPA1候选互作蛋白中，大部分为膜蛋白。其中一个互作蛋白为铜离子结合蛋白AtBCB，经过BiFC实验，突变体表型观察证明GPA1与AtBCB具有相互作用，并调控苹果酸转运体基因AtALMT1的表达，参与植物对铝胁迫的响应，其中，GPA1对铝胁迫耐受起负向作用，AtBCB对铝胁迫耐受起正向作用。

关键词： AT4G12490基因   拟南芥   开花调控   亚细胞定位   病原体抗性  

摘要： 被子植物通过成花转变过程完成从营养生长向生殖生长的过渡。成花转变受环境因素和植物自身发育状态的精确控制。植物内部复杂的调控网络可以监控环境变化,能够使个体在经历足够的营养生长阶段之后再进入生殖生长阶段,以获得最大的繁殖能力。拟南芥开花时间的调控机制涉及光周期、赤霉素、年龄、自主、春化作用和环境温度等多条途径,分别在不同的生长条件下对成花转变过程起调节作用。 本工作研究了EARLI1亚家族基因AT4G12490在拟南芥开花转变过程中的生物学功能。EARLI1亚家族蛋白均由信号肽、PRD功能域和8CM功能域构成,它们的8CM编码序列非常保守。表型观察结果显示,以Col-FRI-Sf2为遗传背景的EARLI1亚家族8CMRNA干扰植株的开花时间明显早于Col-FRI-Sf2野生型植株,说明该亚家族基因在维持拟南芥营养生长和防止拟南芥植株过早进入生殖生长方面具有功能。 为了更为深入地研究EARLI1亚家族基因AT4G12490在拟南芥开花调控过程中的作用机制,本工作构建了以AT4G12490基因PRD和8CM编码区为靶标的RNA干扰载体AN-90-PRD和AN-90-8CM,以及包含AT4G12490基因完整开放阅读框序列的过表达载体AN-90,并通过浸花法结合抽真空处理对拟南芥Col-0生态型野生型植株进行了转化,获得了AT4G12490基因的RNA干扰株系和过表达株系。同时,通过PCR方法从杂合性T-DNA插入系筛选得到AT4G12490基因的纯合突变体。对野生型、过表达和RNA干扰植株的表型特征进行比较,证实下调AT4G12490基因能够引起早花,该基因具有维持营养生长、延迟开花的作用。 进一步利用这些材料对AT4G12490基因上调、下调或敲除以后不同开花诱导途径主要基因的表达水平进行了分析。在长日照条件下,AT4G12490基因主要在种子苗、成熟莲座叶和茎中表达。它的表达模式与自主途径开花基因FLK与晚花基因FRI最为相似,都主要在茎和叶中表达。AT4G12490基因的表达在个体发育的不同阶段差异较大,在营养生长初期和生殖发育初期转录水平较高。在长日照条件下,AT4G12490、EARLI1和AZI1等EARLI1亚家族基因表现出相似的昼夜节律性表达特征。无论在长日照还是短日照条件下,通过RNA干扰技术降低AT4G12490基因的表达水平后,成花素基因FT和成花整合因子基因SOC1mRNA的积累会增加,并且在长日照条件下这种效果更加强烈;同时,一些促进成花转变的关键基因的昼夜节律性表达模式更为明显。但AT4G12490基因被干扰后,CCA1、LHY、GI等节律钟基因的表达和振荡规律不受影响。另外,随着AT4G12490基因表达水平的下调,春化作用和自主途径中的关键性开花抑制因子基因FLC以及GA信号转导途径的抑制基因RGA的mRNA丰度明显降低,而春化相关基因VIN3和GA生物合成相关基因的表达水平表现上升。高效液相检测结果表明,干扰AT4G12490基因能够增加内源赤霉素含量,这与RNA干扰植株细、高、早花的表型相一致。以上研究结果表明,AT4G12490基因能够影响不同的拟南芥开花途径。 为了确定AT4G12490蛋白的亚细胞定位特征,将去除终止密码的AT4G12490基因编码序列连接到pCAMBIA1302载体的绿色荧光蛋白基因之前,构建产生融合表达载体,通过农杆菌介导的叶圆盘转化法获得了35S::AT4G12490-GFP烟草转基因植株。激光共聚焦显微观察发现,AT4G12490蛋白定位在细胞表面,表明该蛋白与感受环境刺激和信号转导有关。AT4G12490基因在烟草中的组成性表达也能够促进营养生长,延迟开花过程。 此外,本工作还在大肠杆菌细胞中表达了不含信号肽的AT4G12490重组蛋白。首先从Col-0野生型拟南芥基因组DNA扩增产生8CM-PRD编码序列,并连接到pPROEX-HTb载体中,然后将重组质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌细胞中。SDS-PAGE和Western免疫印迹实验结果表明,用IPTG诱导表达的AT4G12490重组蛋白主要存在于包涵体中。由于在大肠杆菌细胞中表达的融合蛋白带有六组氨酸标签,所以在使用尿素对包涵体进行溶解后,通过Ni-NTA亲和层析柱纯化了AT4G12490重组蛋白。抑菌试验结果显示,用AT4G12490重组蛋白处理后,灰霉菌和酿酒酵母细胞的生长明显受到抑制。同时,在细胞内用半乳糖诱导表达AT4G12490基因也能够使酿酒酵母的繁殖速度降低。 研究AT4G12490基因在拟南芥开花调控网络中的功能将为通过基因工程技术延长植物营养生长时间和增加生物量积累水平提供理论根据,在生物质能源开发中具有重要意义。对AT4G12490等EARLI1亚家族基因的抗性功能进行研究,在农作物改良

关键词： UV-B   乙烯   乙烯信号元件   异三聚体G蛋白   H2O2   NADPH氧化酶   过氧化物酶   拟南芥   气孔运动  

摘要： UV-B辐射作为一种重要的环境信号对植物生长发育的许多方面均有显著影响,因此研究植物细胞感知UV-B辐射的信号转导机制具有重要的理论意义和实践意义。以前的研究已显示不同剂量UV-B均能诱导气孔关闭；乙烯通过诱导保卫细胞过氧化物酶(POD)途径的过氧化氢(H2O2)形成介导了0.8W·m-2UV-B辐射诱导的蚕豆气孔关闭；异三聚体G蛋白α亚基(Ga)通过诱导保卫细胞NADPH氧化酶途径的H202形成参与了0.5W·m-2UV-B辐射诱导拟南芥气孔关闭的信号转导过程。可见,虽然以前的证据已显示乙烯、Ga和H202均参与UV-B诱导气孔关闭的信号转导过程,但是由于不同研究所用材料及UV-B剂量不同,因此使人们不能系统而全面的了解不同剂量UV-B诱导气孔关闭的信号转导途径的异同以及这些信号分子之间的相互关系。本论文选用拟南芥野生型和各种突变体的叶片为材料,借助药理学、遗传学方法和激光共聚焦扫描显微镜技术,主要探究了 (1)不同剂量UV-B辐射对拟南芥气孔运动的影响；(2)乙烯信号元件、Ga和H202是否都参与不同剂量UV-B辐射诱导的拟南芥气孔关闭；(3)不同剂量UV-B辐射下,H202的来源途径是否一致；(4)低剂量UV-B辐射诱导气孔关闭的信号途径中,乙烯信号元件、Ga和H202之间的相互关系。本研究得到以下主要实验结果和结论： 1、UV-B辐射诱导野生型拟南芥叶片气孔关闭具有剂量依赖性,当UV-B剂量达到0.5W.m-2时气孔开度降低程度最大,达到0.65W.m-2时气孔关闭程度达到最大。因此,本论文用0.5W·m-2UV-B辐射代表低剂量UV-B处理,而0.65W.m-2UV-B辐射代表高剂量UV-B处理。 2、低剂量UV-B辐射和外源乙烯不能诱导乙烯受体ETR1和EIN4、铜离子转运体RAN1和乙烯信号转导元件EIN2、EIN3和ARR2的功能缺失突变体气孔关闭,而高剂量UV-B能够诱导这些突变体气孔关闭。表明乙烯参与低剂量但不参与高剂量UV-B辐射诱导的拟南芥气孔关闭,且乙烯信号元件ETR1、EIN4、 RAN1、EIN2、EIN3和ARR2均参与低剂量UV-B诱导气孔关闭的信号转导过程。 3、Ga抑制剂PTX(百日咳毒素)能完全阻断低剂量UV-B辐射诱导的气孔关闭,但是不能完全阻断高剂量UV-B辐射诱导的气孔关闭,而CTX(霍乱毒素,Ga活化剂)能显著诱导可见光下拟南芥叶片的气孔关闭；低剂量UV-B对拟南芥G蛋白a亚基GPAl功能缺失突变体gpa1-1和gpa1-2气孔开度无明显影响,而高剂量UV-B能显著诱导gpa1-1和gpa1-2气孔关闭；低剂量UV-B辐射下wGa (GPA1过表达转基因系)和cGa (GPA1组成活化性转基因系)的气孔关闭速度比野生型快。表明Ga参与低剂量但不参与高剂量UV-B辐射诱导的拟南芥气孔关闭。 4、H2O2清除剂抗坏血酸(ASA)和过氧化氢酶(CAT)均能显著降低不同剂量UV-B辐射下保卫细胞H2O2水平、并抑制其诱导的气孔关闭,说明H2O2参与不同剂量UV-B诱导气孔关闭的信号转导过程。但是,低剂量UV-B诱导的保卫细胞H2O2生成和气孔关闭能被NADPH氧化酶的抑制剂二苯基碘(DPI)显著抑制,却不能被细胞壁过氧化物酶抑制剂水杨苷异羟肟酸(SHAM)抑制,而高剂量UV-B诱导的保卫细胞H2O2生成和气孔关闭能被SHAM显著抑制,但不能被DPI显著抑制；低剂量UV-B不能诱导NADPH氧化酶功能缺失突变体AtrbohD、 AtrbohF、AtrbohD/F的保卫细胞H2O2生成和气孔关闭,而高剂量UV-B能诱导这些突变体保卫细胞H2O2生成和气孔关闭,且SHAM能明显逆转高剂量UV-B诱导的突变体保卫细胞H2O2生成和气孔关闭。说明介导低剂量UV-B诱导气孔关闭的H2O2主要来自NADPH氧化酶AtrbohD和AtrbohF途径,而介导高剂量UV-B诱导气孔关闭的H2O2主要来自细胞壁过氧化物酶(POD)途径。 5、低剂量UV-B辐射和外源乙烯虽然能诱导野生型拟南芥保卫细胞H202生成和气孔关闭,但是均不能诱导AtrbohD/F、etrl, ein4和ran1突变体的保卫细胞H2O2生成和气孔关闭以及ein2, ein3和arr2突变体的气孔关闭,但能诱导ein2, ein3和arr2突变体保卫细胞H2O2生成；外源H2O2能逆转AtrbohD/F、etrl, ein4和ran1突变体气孔运动对低剂量UV-B辐射和外源乙烯的不敏感性,但不能逆转ein2, ein3和arr2突变体气孔运动对低剂量UV-B辐射和外源乙烯的不敏感性。表明低剂量UV-B辐射下乙烯通过其受体ETR1和EIN4以及铜离子转运体RAN1诱导NADPH氧化酶途径的H2O2生成,生