关键词： G蛋白   WNK激酶   氮素吸收和转运   NRT基因表达   GS活性  

摘要： 异三聚体G蛋白(下称G蛋白)是真核生物中介导细胞对外界刺激做出相应应答的膜信号转导组分。植物G蛋白参与调控多种生理生化过程,包括植物根茎叶发育、细胞增殖、气孔开闭、光周期、糖信号转导、生物和非生物胁迫及氮素利用效率等。前期蛋白互作组分析结果表明,G蛋白与硝态氮转运蛋白NRT在物理上没有互作,却通过其他蛋白与NRT有间接的联系,其中包括WNK激酶。植物WNK激酶家族成员参与多种生理过程,包括调控植物光周期和渗透胁迫。WNK激酶在RGS1的葡萄糖诱导下的内胞化过程中起着重要的作用,且WNK8与硝态氮转运蛋白NRT1.1物理上相互作用,因此我们推测G蛋白信号转导系统与WNK激酶可能参与调控氮素吸收利用。本文利用培养皿和水培的方法,对拟南芥相关G蛋白和WNK激酶突变体进行不同浓度的硝态氮处理,观察其苗期根系和叶片生长情况、成熟期生长情况、氮素吸收及转运、相关酶活性和基因表达等方面的差异,主要结果与结论如下:1.G蛋白突变体(agb1-2和rgs1-2)的根系表型结果表明,野生型Col主根长度受到高氮浓度的抑制,与野生型不同,突变体agb1-2幼苗期主根生长与外源氮素浓度呈正比,侧根数目显著高于野生型,成熟期高氮条件下agb1-2的根冠比显著高于野生型。rgs1-2的表型与agb1-2相反。2.在G蛋白突变体(agb1-2、gpa1-3和rgs1-2)中,硝态氮刺激下NRT1.1的表达量与野生型相似,NRT2.1和NRT3.1的情况与NRT1.1类似,表明G蛋白没有在转录水平上直接介导硝态氮信号转导。在WNK激酶突变体(wnk8-1和wnk8-2)中,氮处理后基因NRT1.1和NRT2.2的表达量显著低于野生型,表明WNK激酶在硝态氮原初响应过程中起着重要的作用,但其他几个WNK突变体中的NRT相关基因表达结果并无显著差异,说明WNK8对NRT基因表达调控具有特异性。3.平板试验结果表明,在低氮条件下,双突变体wnk8/10和三突变体wnk1/8/10幼苗期长势较弱,根系及叶面积较小;高氮条件下,突变体幼苗期根系发达,在低氮条件下表现出的叶面积生长不足现象消失,整体长势旺盛。长期氮素处理结果表明,长期低氮处理后,WNK激酶突变体植株生物量和根系GS活性显著降低,角果数量显著减少,可能是由于WNK激酶缺失导致植物花期延迟;高氮处理后,突变体根系GS活性显著升高,但整体生物量及角果生物量显著降低。4.同位素示踪结果显示,低氮处理后,突变体wnk1/8/10的氮转移速率显著低于野生型,突变体wnk1 N转移比例高于野生型;突变体wnk1/8/10在高氮条件下相对于野生型N转移比例显著提高,表明WNK激酶参与了N由根系向地上部的转移。AtWNK1、At WNK8及At WNK10的单突变体在所有的处理中并没有像双突变体wnk8/10和三突变体wnk1/8/10那样显示统一的表型。综上所述,G蛋白信号转导系统与WNK蛋白激酶在氮素调控的植物生长过程中起到重要作用。G蛋白通过影响拟南芥的根系构型从而响应外界氮素信号。AtWNK1、AtWNK8及At WNK10在低氮条件下,对植物的N吸收利用起到正调控的作用;高氮条件下,不会影响苗期植物对氮素的吸收,在成熟期,At WNK参与氮素转运及同化。本文初步解释了G蛋白与WNK激酶对拟南芥吸收利用硝态氮的调控模式,为植物响应氮信号的分子调控机制提供了新思路。

关键词： eATP   异三聚体G蛋白   ERFx   生长素  

摘要： 植物细胞内合成的ATP可以作为“能量货币”,为植物的生长发育提供能量,同时在一定条件下ATP也可以释放到细胞外。细胞外ATP(extracellular ATP,eATP)可以作为信号分子,参与调控植物的生长发育及环境适应性,eATP的生理功能和作用机制正成为植物发育与抗逆生理研究的一个新的重要内容。本实验室前期工作发现eATP对于拟南芥幼苗主根生长方向有影响,主根生长受到高浓度ATP抑制,且表现出明显的ATP躲避性反应(eATP avoidance response),显示根系视高浓度ATP为一种伤害性刺激。为阐明拟南芥根系应对eATP刺激、调整生长发育的信号转导机制,本文完成了两项主要工作:1.异三聚体G蛋白在拟南芥幼苗主根eATP躲避反应中的作用本实验室前期实验表明,拟南芥幼苗主根可以感受到eATP,并使根的生长方向发生改变,表现出明显的eATP负趋向性生长,我们将其定义为ATP躲避性生长方式。为进一步探究拟南芥幼苗主根在eATP躲避生长过程中的信号转导机制,我们分别观察了异三聚体G蛋白α、β、γ亚基(Gα、Gβ、Gγ)功能缺失突变体幼苗在含有ATP的接合培养基中的生长状况。实验结果表明,在Gα功能缺失突变体(gpα1-1、gpα1-2)中,幼苗主根对eATP的躲避生长反应明显减弱。Gβ功能缺失突变体(agb1-1、agb1-2)和Gγ功能缺失突变体(agg1-1、agg1-2)幼苗主根会对eATP产生躲避生长的反应,与野生型没有明显差异。结果显示,拟南芥幼苗主根感受eATP,并发生躲避生长反应的过程中,Gα发挥着至关重要的作用。为进一步探究Gα参与eATP调控拟南芥主根躲避生长反应的作用机制,我们利用杂交的方法将DR5-GFP和DⅡ-VENUS融合基因转化到野生型(WS)和Gα缺失突变体(gpα1-1、gpα1-2)中,利用激光共聚焦显微镜观察eATP处理后的拟南芥幼苗主根细胞中生长素含量及分布的变化。结果显示,ATP处理24h后,野生型幼苗在根尖细胞,尤其是静止中心及周围细胞中DR5-GFP的含量明显增加;同时DR5-GFP发生不对称分布,在主根弯曲点内侧细胞中的含量明显高于外侧细胞。对含有DⅡ-VENUS的野生型进行ATP处理24h后发现,野生型幼苗在根尖细胞,尤其是静止中心及周围细胞中DⅡ-VENUS的含量降低;同时DⅡ-VENUS发生不对称分布,在主根弯曲点内侧细胞中的含量明显低于外侧细胞。以上结果说明,野生型幼苗根尖细胞中生长素含量增加,生长素的积累会使主根伸长生长受抑制,导致幼苗主根伸长速率减缓;野生型幼苗主根在弯曲点内侧细胞中生长素含量高于外侧细胞,说明拟南芥幼苗主根对生长素敏感,在生长素积累的一侧,细胞生长受抑制,进而产生躲避性生长。ATP处理后,在Gα缺失突变体(gpα1-1、gpα1-2)幼苗根尖细胞中DR5-GFP含量增加,但未出现明显的分布变化;在带有DⅡ-VENUS标记的突变体幼苗中,根尖细胞中的DⅡ-VENUS含量降低,但是并未出现明显的分布变化。以上结果说明eATP诱使Gα缺失突变体(gpα1-1、gpα1-2)根尖细胞中生长素含量增加,生长素积累会使主根伸长生长受抑制导致幼苗主根伸长速率减缓;但是Gα突变体主根生长素未见明显的不均匀分布,也没有发生eATP躲避性生长反应。综上所述,Gα通过影响生长素的不对称分布,调控拟南芥幼苗主根对eATP的躲避反应。为进一步探究Gα如何影响生长素的不对称分布来调控幼苗主根对eATP躲避性生长反应,我们利用杂交的方法将PIN1-GFP、PIN2-GFP、PIN3-GFP、PIN7-GFP和AUX1-YFP融合基因转化到野生型(WS)和Gα缺失突变体(gpα1-1、gpα1-2)中,利用激光共聚焦显微镜观察eATP处理后的拟南芥幼苗主根细胞中生长素运输蛋白含量及分布的变化。结果显示,野生型幼苗经ATP处理后,幼苗根尖中柱和内皮层细胞中PIN1-GFP的含量降低,但未见明显的不对称分布现象;根尖中柱和小柱细胞中PIN3-GFP的含量降低,但未见明显的不对称分布现象;PIN7-GFP在根尖细胞中含量降低,但未见明显的不对称分布现象;位于幼苗根尖中柱、小柱和表皮细胞中的AUX1-YFP含量降低,但未见明显的不对称分布现象;位于根尖表皮和皮层细胞中PIN2-GFP的含量降低,并且发生了明显的不对称分布现象,在主根弯曲点内侧细胞中PIN2-GFP含量明显高于外侧细胞。说明拟南芥幼苗在ATP处理后,PIN1、PIN2、PIN3、PIN7和AUX1在根尖细胞中含量均有明显降低,影响了生长素运输总和的含量,导致幼苗主根伸长速率减缓;而PIN2-GFP在根尖细胞中的不对称分布,与生长素DR5-GFP的不对称分布相同,都是在主根弯曲点内侧细胞中含量明显高于外侧细胞,我们推测P

关键词： 乙烯   G蛋白   SA   过氧化氢   一氧化氮   气孔关闭   拟南芥  

摘要： 水杨酸(salicylicacid,SA)参与植物多种生长发育过程和对环境的响应,也参与气孔运动的调控。然而,目前关于SA调控气孔运动的作用机制尚未完全清楚。前人研究结果已表明SA能促进病原菌诱导植物叶片乙烯的生成,且SA、乙烯和G蛋白都参与气孔免疫反应;本实验室前期实验结果也表明G蛋白参与乙烯诱导拟南芥气孔关闭的信号转导过程,并且信号分子过氧化氢(H2O2)和一氧化氮(NO)也参与此过程。上述研究现状暗示乙烯和G蛋白可能参与SA调控气孔运动的信号转导过程,但目前关于SA诱导乙烯生物合成的机制、参与SA诱导气孔关闭的乙烯信号转导元件和G蛋白的种类及其与信号分子H202和NO的关系以及H202和NO来源的具体酶学途径仍不清楚。因此本文选用各种拟南芥突变体的叶片为材料,借助气孔开度分析、气相色谱、倒置荧光显微镜和半定量(RT-PCR)等技术与手段,首先研究SA处理对拟南芥叶片乙烯生物合成限速酶(ACC合酶ACS)基因表达和乙烯生成量的影响,明确SA诱导乙烯生物合成的机制;然后通过研究乙烯生物合成抑制剂对SA诱导气孔关闭和乙烯生成量的影响,确定乙烯在SA诱导气孔关闭中的作用;最后通过乙烯信号转导组分突变体和G蛋白不同亚基突变体的气孔开度分析以及保卫细胞内源H202和NO生成的分析,明确参与SA诱导气孔关闭的乙烯信号转导元件、G蛋白亚基的种类以及它们与H202和NO之间的相互关系。本文得到以下主要实验结果和结论:1.以野生型拟南芥叶片为材料,当SA处理浓度为100 μM时诱导气孔关闭最为显著,且该浓度在处理3 h后气孔关闭程度最显著,说明100 μM SA处理3 h是SA诱导拟南芥叶片气孔关闭的最适浓度和处理时间。2.与对照相比,SA处理下拟南芥野生型叶片中ACC合酶基因ACS6和ACS11表达量明显上调,乙烯生成量也显著提高;根据时间过程,SA处理2 h时ACS基因表达和乙烯生成达到峰值,这明显早于SA诱导气孔显著关闭的时间3 h,且SA诱导的气孔关闭和乙烯生成能被ACC合酶抑制剂氨基氧乙酸(AVG)显著抑制,暗示乙烯参与了 SA诱导气孔关闭的信号转导过程,也表明SA通过促进ACS6和ACS11的表达诱导叶片乙烯生成。***与乙烯生物合成前体物质1-氨基-1-羧基环丙烷(ACC)单独或复合处理后能诱导拟南芥野生型和乙烯受体etr2、ers2和ein4突变体叶片气孔关闭,但不能诱导乙烯受体etrl和ersl、铜离子转运体ran1以及乙烯信号转导组分ein2、ein3和arr2突变体的气孔关闭;乙烯信号转导组分ctr1突变体在可见光下气孔显著关闭,SA和ACC处理后气孔开度无明显变化,表明ETR1、ERS1、RAN1、EIN2、EIN3和ARR2作为正调节因子以及CTR1作为负调节因子均参与了乙烯介导SA诱导拟南芥气孔关闭的信号转导过程,而乙烯受体ETR2、ERS2和EIN4不参与乙烯介导SA诱导气孔关闭的信号转导过程。*** 氧化酶的 T-DNA 插入纯合突变体A rtobD、AtrbohF AtrbohD/F 和在SA处理下气孔不能正常关闭,其保卫细胞内H2O2含量也很低。该数据不仅表明H202介导了 SA诱导气孔关闭的信号转导过程,而且进一步表明SA诱导拟南芥保卫细胞H202形成依赖于NADPH氧化酶AtrbohD和AtrbohF。5.外源SA能明显诱导拟南芥野生型叶片气孔关闭和保卫细胞NO的生成,但对硝酸还原酶双突变体Nial-2/Niα2-5的气孔开度和NO水平无显著影响;相比于Niαl-2/Niα2-5、Niαl-2和Niα2-1单突变体均部分抑制了 SA诱导气孔关闭和NO生成的效应,但Nial-2比Nia2-1的抑制效应更大。该结果表明Nial和Nia2途径来源的NO都参与SA诱导拟南芥气孔关闭的信号转导过程,且Nial的作用大于Nia2。***能诱导拟南芥野生型、Gβ亚基αgbl和Gγ亚基αggl、αgg2和αgg3的功能缺失突变体的气孔关闭,却对Gα亚基gpαl的功能缺失突变体的气孔开度并无明显影响;外源H2O2、NO不仅能诱导gpal突变体气孔关闭,而且能逆转其在SA处理下的气孔不关闭表型;SA能诱导野生型保卫细胞H202、NO的产生,但不能诱导gpal突变体保卫细胞H2O2、NO的产生,说明Gα亚基GPA1参与SA诱导的拟南芥气孔关闭,且Gα位于H202、NO的上游起作用,而Gβ亚基AGB1和Gγ亚基AGG1、AGG2和AGG3均不参与SA诱导气孔关闭的信号转导过程。7.不管有、无SA,H2O2处理均能诱导铜离子转运体rαnl突变体的气孔关闭,但不能诱导乙烯受体及其信号元件etrl、ersl、ein2、ein3和αrr2突变体的气孔关闭;SA能诱导拟南芥野生型和乙烯信号元件ein2、ein3和αrr2突

关键词： 拟南芥   盐胁迫   种子萌发   异三聚体G蛋白  

摘要： 以拟南芥的野生型(WS)、异三聚体G蛋白α亚基基因GPA1缺失突变体(gpα1-1,gpα1-2)和超表达突变体(wGα,cGα)的种子为材料,在添加不同浓度NaCl盐溶液的MS基本培养基上培养,观察种子的萌发及根生长情况。结果表明:随着盐胁迫程度的增加,不同基因型拟南芥种子萌发率、存活率、主根长度及侧根数目均明显呈下降趋势;在同一浓度下,缺失型突变体的萌发率和存活率高于超表达突变体和野生型;缺失型突变体的主根长度和侧根的数目也大于野生型和超表达突变体。初步说明了植物异三聚体G蛋白α亚基在拟南芥种子萌发及根生长发育过程中起负调控作用。

关键词： UV-B   G蛋白   拟南芥   UVR8   UV-B专一信号途径   UV-B非专一信号途径  

摘要： 前人研究表明UV-B辐射作为一种重要的环境信号对植物光形态建成等多方面具有重要作用,且植物对UV-B信号的转导至少存在两条信号转导通路——依赖于UVR8的UV-B专一信号转导途径和不依赖于UVR8的UV-B非专一信号转导途径。G蛋白由α、β、γ三种亚基组成,是真核细胞中一类保守且重要信号转导分子。在动物中前人研究已表明Gα和Gβγ均参与了 UV-B辐射诱导的多种生理反应的信号转导途径,但关于G蛋白是否也参与植物对UV-B辐射信号的转导目前并不清楚。本论文根据前人的研究结果,选择依赖于UVR8的UV-B专一信号途径调控的基因(HY5、HYH、CHS、CRYD和ELIP1)和不依赖于UVR8的UV-B非专一信号途径调控的基因(FAD、UDP和WRKY)分别作为两种UV-B信号途径的分子标记,以拟南芥野生型和G蛋白不同亚基的功能缺失突变体叶片为材料,通过半定量PCR(RT-PCR)和荧光实时定量PCR(qPCR)技术,主要探讨了 G蛋白不同亚基在UV-B调控拟南芥叶片基因表达中的作用及其与依赖于UVR8和不依赖于UVR8的两条UV-B信号通路之间的关系。本研究主要得到以下实验结果和结论:1、检测拟南芥野生型叶片在不同UV-B辐照度(0.02、0.04、0.1、0.2 Wm-2)下所选两类基因的表达情况,结果说明0.02 Wm-2的低辐照度UV-B辐射就可明显启动HY5、HYH、CHS、CRYD和ELIP1等依赖于UVR8的UV-B专一信号途径调控的基因表达,而不依赖于UVR8的UV-B非专一信号途径调控的基因WRKY、UDP和FAD需要0.1 Wm-2以上的高辐照度UV-B处理才可启动其表达,且UV-B辐射诱导所有检测基因表达的适宜处理时间均为3小时。因此,本文选择0.02 Wm-2和0.2 Wm-2两个UV-B辐照度处理材料3 h分别作为低辐照度和高辐照度UV-B辐射处理进行后续研究。2、利用UVR8信号通路的关键组分UVR8、COP1和HY5/HYH的功能缺失突变体为材料,进一步证实不同辐照度UV-B辐射诱导HY5、HYH、CHS、CRYD和ELIP1基因的表达依赖于UV-B专一信号转导途径UVR8-COP1-HY5,而UV-B诱导WRKY、UDP和FAD基因的表达不受UVR8-COP1-HY5信号途径的影响。该结果进一步说明本文所选择的分别受两种UV-B信号通路调控的分子标记是正确的。3、与拟南芥野生型相比,G蛋白α亚基GPA1的功能缺失突变体gpa1-1和gpa1-2不影响低辐照度(0.02 Wm-2)UV-B下依赖于UVR8的UV-B专一途径介导的基因表达,但抑制高辐照度(0.2Wm-2)UV-B辐射下两种UV-B信号转导通路介导的基因表达。该结果暗示G蛋白α亚基GPA1是不依赖于UVR8的UV-B非专一信号转导通路的正调节因子,其不仅介导UV-B非专一途径调控的基因表达,而且它也与依赖于UVR8的UV-B专一信号转导通路相互作用而促进高辐照度UV-B辐射下UV-B专一途径调控的基因表达。4、与拟南芥野生型相比,G蛋白β亚基AGB1的功能缺失突变体agb1-1和agb1-2不影响低辐照度(0.02 Wm-2)UV-B辐射下依赖于UVR8的UV-B专一途径介导的基因表达,但抑制高辐照度(0.2Wm-2)UV-B辐射下两种UV-B信号转导通路介导的基因表达。该结果暗示G蛋白β亚基AGB1也是不依赖于UVR8的UV-B非专一信号转导通路的正调节因子,其不仅介导UV-B非专一途径调控的基因表达,而且它也与依赖于UVR8的UV-B专一信号转导通路相互作用而促进高辐照度UV-B辐射下UV-B专一途径调控的基因表达。5、与拟南芥野生型相比,G蛋白γ亚基AGG1、AGG2和AGG3的功能缺失突变体不影响低辐照度(0.02Wm-2)和高辐照度(0.2Wm-2)UV-B辐射下依赖于UVR8的UV-B专一途径介导的基因表达,但促进高辐照度(0.2 Wm-2)UV-B辐射下不依赖于UVR8的UV-B非专一信号通路调控的基因表达。该结果暗示G蛋白γ亚基AGG1、AGG2和AGG3均是不依赖于UVR8的UV-B非专一信号转导通路的负调节因子,它们只负调控该UV-B非专一途径介导的基因表达。

关键词： 核孔蛋白质   水通道蛋白质   抗病性   过氧化氢  

摘要： 核孔蛋白质作为核孔复合体的组分,能够介导大分子物质的核质转运过程。植物抗病防卫反应的信号传递与核质转运过程密不可分,所以核孔蛋白质在植物抗病防卫反应过程中起重要作用。水通道蛋白形成运输水的生物膜通道,并能介导细胞内外某些小分子物质的运输,如过氧化氢,参与植物的多种生理和病理反应过程。过氧化氢是一种活性氧成分,影响植物的抗病性,水通道蛋白质可以通过介导过氧化氢的运输调控植物的抗病性。本课题针对核孔蛋白质At 1G13120和水通道蛋白质AtPIP 1;4进行研究,探索两者对于拟南芥抗病性的影响,以便更好地了解植物抗病免疫机制。本论文研究内容主要分为两部分:第一部分:对获得的九种核孔突变体进行抗病性筛选,得到两种对抗病性有调控作用的突变体。取Salk20410为研究对象,对核孔蛋白质基因At1G13120进行研究,发现该基因能够被SA持续诱导表达,并且突变AtIG13120能够显著抑制抗性相关基因PR1和PR2的表达,说明At1G13120参与了 SA信号通路介导的抗病防卫反应。另一方面,该基因的突变降低其对病原菌PstDC3000的抗性却促进拟南芥的营养生长并提高植株的产种量。第二部分:对获得的AtPIP1;4突变体,野生型以及转基因植株进行抗病性的测定与比较。结果表明,AtPIP1;4转基因过表达植株较野生型更抗病而突变体植株较野生型更为感病。实验证实AtPIP1;4能够调控PR基因的表达,介导SA信号通路从而对拟南芥的抗病性产生影响。进一步探究水通道蛋白质AtPIP1;4对过氧化氢的作用,发现AtPIPl;4不直接诱导叶片中过氧化氢的积累,但可以协助病原菌诱导的质外体过氧化氢转移进胞质内。综上,拟南芥核孔蛋白基因At1G13120和水通道蛋白基因AtPIP1;4的表达量影响拟南芥对Pst DC3000的敏感程度,两者均能介导SA信号通路抗病相关基因的表达,从而对植物的抗病性产生影响。

关键词： 拟南芥   干旱胁迫   ABA   ADF5   微丝结合蛋白   G3区   功能  

摘要： 干旱是当今世界面临的全球性问题,干旱胁迫严重影响植物生长发育,造成农作物减产,并使生态环境日益恶化。植物内源激素脱落酸（ABA）在植物生长发育和抵御环境胁迫过程中扮演着非常重要的角色。已有的报道证明在干旱缺水时,ABA调控植物气孔关闭来降低蒸腾作用,阻碍水分丧失。同时,微丝骨架参与调控气孔的开闭,其动态的紊乱会造成气孔不能正常开闭,微丝骨架构象的转换也影响了气孔的开闭速度。然而微丝骨架的动态变化是否参与响应ABA信号还未见报道。此外,微丝结合蛋白（Actin binding protein,ABP）-凝溶胶蛋白超家族（Villin/gelsolin/fragmin super family）成员是一类钙离子依赖的微丝结合蛋白,一般含有3个或6个gelsolin结构域（gelsolin-like domain,简称G区）,并且每个结构域的功能各有不同。经过30多年的研究,大多数G区的功能已被鉴定,但是G3区的功能仍不清楚。本文对拟南芥ADF5响应干旱胁迫的作用机制及凝溶胶蛋白超家族G3区的功能进行了研究,并取得如下结果:1、发现ADF5负调控ABA介导的种子萌发及子叶绿化。研究表明干旱和ABA处理均可诱导ADF5上调表达,暗示ADF5参与响应干旱胁迫;ADF5的功能缺失突变体adf5的种子萌发及子叶绿化过程对外源ABA不敏感,证明ADF5负调控ABA介导的种子萌发及子叶绿化。2、揭示了ADF5通过调节气孔的闭合来响应植物干旱胁迫。土壤干旱实验证明,adf5植株的萎蔫程度及死亡率均高于WT（Wild type）,呈现干旱敏感表型;离体叶片失水分析发现,adf5突变体失水率显著高于WT;气孔开度实验表明,在响应干旱/ABA诱导的气孔闭合时,adf5突变体气孔的闭合速率显著慢于WT,不能正常闭合。上述实验结果说明,ADF5通过调节气孔的闭合来响应植物干旱胁迫。3、阐释了ADF5特异地参与ABA介导的种子萌发、子叶绿化及干旱响应,而ADF9并不参与这些生理过程。拟南芥ADF第三亚家族包含ADF5和ADF9,种子萌发、子叶绿化及干旱失水实验证明,ADF9的功能缺失突变体adf9与WT具有相同的萌发率、子叶绿化率及离体叶片失水率,并且adf5×adf9与adf5也具有相同的种子萌发率、子叶绿化率及离体叶片失水率,说明ADF5特异地参与ABA介导的种子萌发、子叶绿化及干旱响应。4、发现ADF5通过调控微丝骨架的构象变化来介导气孔的闭合。通过观察活细胞中的微丝结构发现,adf5突变体保卫细胞中的微丝含量及微丝束化程度都显著降低,微丝动态和排布转换产生延迟,表明ADF5可能通过调控微丝的构象变化来调控气孔的闭合。5、揭示了ADF5的上调表达受到DPBF3的调控进而响应ABA信号来适应干旱胁迫。ADF5启动子序列分析发现,其启动子区域含有多个ABRE核心结合序列ACGT;ABF/AREBs家族成员缺失突变中ADF5的表达量分析发现,只有在DPBF3的功能缺失突变体dpbf3中ABA不能诱导ADF5的上调表达;酵母单杂交实验证明DPBF3与ADF5启动子含有ACGT顺式作用元件的序列结合;染色质免疫共沉淀分析与转录激活分析证明了DPBF3在体内与ADF5启动子结合并促进其转录激活。上述实验证明,ABA处理时ADF5的上调表达受到DPBF3的调控。6、发现DPBF3通过调控气孔的闭合响应干旱胁迫。离体叶片失水分析表明,dpbf3突变体的失水率显著高于WT;气孔开度实验表明,dpbf3突变体气孔闭合速率慢于WT,表明DPBF3可能通过调控气孔的闭合响应干旱失水。7、阐释了G3区的主要功能是调节Villin/gelsolin/fragmin超家族蛋白活性来调控微丝骨架的动态变化。通过比较ABP135G1-G3（含有百合ABP135蛋白的G1-G3结构域）和ABP29（只含有G1和G2区）体外生化特性发现,在高浓度Ca2+条件下(如10μM和200μM Ca2+),ABP135G1-G3相对于ABP29表现出更高的微丝剪切/解聚活性和肌动蛋白成核能力;在低浓度Ca2+条件下(如41 nM Ca2+时),ABP29比ABP135G1-G3具有更强的微丝封端能力和肌动蛋白成核能力;在稀释解聚过程中,ABP135G1-G3与ABP29表现相互拮抗的生化特性,ABP135G1-G3促进稀释介导的微丝解聚,而ABP29抑制稀释介导的微丝解聚。上述实验结果说明,G3区在Villin/gelsolin/fragmin超家族蛋白活性调控方面发挥重要作用。综上所述,干旱/ABA信号通过ABF/AREB类转录因子DPBF3调控微丝解聚因子ADF5的表达,进而影响微丝骨架的动态与重排来响应植物干旱胁迫。此外,本论文首次揭示了G3区在调节Villin/gelsolin/fragmi

关键词： 拟南芥   CBP60g   核定位信号   GFP  

摘要： 在真核细胞中,细胞核具有核膜结构,细胞核内与细胞核外物质交换的主要通道是核膜上的核孔复合体。化合物的大小决定其通过核孔复合体的方式,分子量在50kD以上的蛋白质必须通过主动转运才能够进入到细胞核内,这种蛋白质序列上都存在核定位信号。CBP60s是植物所特有的钙调素结合蛋白家族之一。在拟南芥中,CBP60s家族共有8个成员,即CBP60a-g和SARD1。已有的研究表明CBP60g是DNA结合蛋白,是病原菌诱导的异分支酸合酶ICS1基因表达和SA积累的关键调节因子。CBP60g蛋白特异定位于细胞核,但CBP60g氨基酸序列中并没有已知的经典核定位信号。为进一步研究并确定CBP60g核定位信号,本研究用RT-PCR技术从拟南芥中克隆获得CBP60g基因分段后的cDNA片段,再利用In-Fusion技术将各片段cDNA分别与GFP融合,通过原生质体瞬时表达技术观察GFP融合蛋白的亚细胞定位情况。结果显示CBP60g-2-1(第1-84个氨基酸)、CBP60g-2-3(第130-]63个氨基酸)、CBP60g-2-4(第163-306个氨基酸)都存在核定位信号,说明CBP60氨基酸序列中含有多个核定位信号。对CBP60g-2-3进一步的研究得到了CBP60g氨基酸序列中第134、156、162位置的精氨酸都是决定核定位信号活性的关键氨基酸。

关键词： 异三聚体G蛋白   阿罗酸脱水酶   L-苯丙氨酸   花青素   叶绿体蛋白转运   拟南芥   转基因植株  

摘要： 异三聚体G蛋白广泛存在于真核生物中，被誉为信号转导途径中的分子开关，介导胞外信号传递至胞内并引起一系列生理反应。在模式植物拟南芥中，G蛋白在种子萌发、细胞增殖、植株形态、气孔运动、逆境胁迫响应和叶绿体发育等方面发挥着重要的作用，但是其工作机理仍有待阐明。\n 为了解析G蛋白信号转导的分子机理，我们通过酵母双杂交手段筛选到一个与G蛋白α-亚基(GPA1)的互作蛋白，阿罗酸脱水酶(Arogenate dehydratase，ADT)。它们之间的相互作用在体内外分析中均得到验证，而且不同的ADT成员可以与不同活性状态的GPA1相互作用。同时，在酵母中也检测到AGB1和RGS1能与ADT互作。ADT催化苯丙氨酸合成的最后一步反应。拟南芥基因组有六个编码阿罗酸脱水酶的基因，命名为ADT1-ADT6。荧光定位结果显示ADT1-5与GFP融合蛋白均定位于叶绿体，而ADT6-GFP则定位于细胞核。组织特异性表达分析结果显示ADT1-ADT6在植物各个生长时期和组织器官中均有表达，ADT4和ADT5的表达水平较高。虽然遗传学及代谢产物分析表明ADT1-6具有功能冗余性，但ADT1、ADT2和ADT3在蔗糖诱导和冷胁迫诱导的花青素合成中发挥主要作用，而ADT4和ADT5在木质素和原花青素合成中发挥主要作用。\n 在所有ADT过表达的转基因植株中，只有ADT4/ADT5在野生型中过表达具有很严重的表型，例如真叶形状狭长，新叶颜色变淡，生长期滞后，乃至不育。有趣的是当ADT4或者ADT5在G蛋白突变体gpa1、agb1和rgs1背景中过表达可使表型减轻或消失。分离完整叶绿体和Western blot实验结果证明ADT4-GFP融合蛋白在gpa1突变体叶绿体中的含量同野生型比减少接近一半。体外叶绿体蛋白转运实验证明，激活态形式的GPA1-GTP可以调控ADT4/ADT5从细胞质到叶绿体的蛋白转运。进一步分析表明ADT4/ADT5通过atToc120/atToc132转运进入叶绿体，尽管体外的叶绿体蛋白转运分析的结果显示ADT4在野生型和突变体之间的蛋白转运效率没有差别。\n 以上实验结果显示了ADT4/ADT5蛋白转运进入叶绿体有两条途径:一条途径依赖G蛋白，一条途径不依赖G蛋白。依赖G蛋白的途径是由Gαβγ异三聚体和RGS1共同介导的。不依赖G蛋白的转运途径通过Toc120/Toc132，依赖G蛋白的转运途径是否通过Toc120/Toc132还有待验证。生理学及遗传学的数据表明ADT4/ADT5转运进入叶绿体受到光信号的调控，G蛋白复合体如何参与光信号的传递也有待于进一步的探索。

关键词： 水稻   拟南芥   核质间转运   小G蛋白Ran   Dof转录因子   细胞增殖   环境响应机理   基因改良  

摘要： 植物作为固着生长的生物，必须对外界环境的变化做出适度的反应。盐害、干旱、冷害及病害等环境胁迫都会严重影响植物生长发育，造成农业减产。植物进化出对环境胁迫信号感知，传导，整合和响应的一系列机制。本论文从信号分子小G蛋白Ran和植物特有的DOF转录因子着手研究植物响应环境胁迫的机制及其与生长发育之间的联系，为农作物的基因改良和提高植物对环境胁迫耐受提供理论依据。\n 研究内容包括以下几个部分:\n 1.水稻小G蛋白OsRAN1和拟南芥AtRAN1功能研究\n 小G蛋白Ran是importinβ受体家族介导的核质间转运过程中一个必须的调控蛋白。此外它在细胞有丝分裂过程以及分裂后核膜组装过程都有重要作用。很多报道显示，调控蛋白在核质间的分隔在植物生长发育及响应外界环境变化的信号传导过程中起重要的调控作用。我们的研究发现Ran参与细胞周期调控在植物响应低温胁迫中发挥重要作用。该功能在单子叶植物水稻和双子叶植物拟南芥中有一定的保守性。\n (1)水稻小G蛋白OsRAN1的功能研究\n 关于植物中Ran的研究在拟南芥，番茄，小麦，水稻中已有报道。但水稻中的OsRAN1蛋白目前为止还未见报道。我们实验结果发现:(i)水稻Ran家族（包括OsRAN1，OsRAN2和OsRAN3）与人类Ran/TC4以及拟南芥或者小麦中的同源基因享有保守的蛋白序列和结构特征，OsRAN1主要定位在细胞核内，部分定位在细胞质中。(ii)低温胁迫、外源IAA处理会上调OsRAN1的转录表达。(iii)高表达OsRAN1的转基因水稻和拟南芥植株对冷害耐受能力增强。(iv)OsRAN1高表达的转基因植株还表现出分枝增多，株高降低等生长发育表型。(v)进一步研究显示OsRAN1提高了水稻根尖细胞有丝分裂指数和增多了处于分裂期细胞数目从而提高对冷害的耐受。\n (2)拟南芥AtRAN1调控发育和冷胁迫响应研究\n 由于拟南芥和水稻Ran蛋白序列上的保守型可能预示着功能上的保守性，再者拟南芥中编码Ran蛋白的基因报道的有四个(AtRAN1，AtRAN2，AtRAN3和AtRAN4)，所以拟南芥中哪个/些Ran参与了低温信号传导，以及功能上的冗余性和特异性值得进一步研究。我们的实验结果显示:(i)在低温条件下，AtRAN1和AtRAN3基因表达被上调6倍左右，而AtRAN2和AtRAN4基因的表达不受影响。(ii)进一步的突变体结果分析显示atran1 atran3双突变体经过4℃低温驯化后对冻害的敏感性明显提高了，而atran1，atran2，atran3单突变体和野生型相比差异不明显，验证了AtRAN1和AtRAN3可能冗余地参与拟南芥对冻害的耐受。(iii)AtRAN1但不是AtRAN3过表达提高了拟南芥对冻害的耐受。(iv)AtRAN1参与冻害下细胞周期的进程和细胞核膜稳定性维持。(v) AtRAN1基因在开花时间调控和促进营养生长中有重要作用。\n 2.拟南芥DOF转录因子研究\n DOF(DNA binding with one finger)蛋白是植物所特有的一类转录因子。它含有一个独特的富含Cys残基的单锌指保守结构域，命名为DOF结构域。DOF结构域是一个双功能的结构域，它不仅介导与DNA的结合，而且介导蛋白与蛋白之间的相互作用。Zhang等最先报道了拟南芥的DOF蛋白OBP1就是通过其与bZIP(basic leucine-zipper)蛋白OBF4、OBF5的特异性相互作用而分离到的，另外OBP2，OBP3，OBP4相继被报道，这方面的工作我们重点围绕OBP4基因在调控细胞周期的新功能进行研究。\n 我们发现一个新的参与细胞周期调控的DOF转录因子OBP4(DOF5.4)，OBP4在分裂旺盛组织表达较强，其定位于细胞核。组成型表达的转基因植株表现出极矮化表型，细胞明显变小，生长发育受到抑制;我们在用雌激素诱导的转基因株系中诱导表达OBP4同样抑制了植株的生长;显示OBP4可能是细胞增殖的负调控因子。进一步的芯片结果显示OBP4能够抑制了G2-M期有重要作用的CYCB周期蛋白，CDKB激酶的表达以及和细胞延伸有关因子的表达水平(XTHs，EXPs)。流式细胞检测显示:过量表达OBP4导致细胞增殖能力降低，更多的细胞脱离细胞周期进程而进入了内复制过程，同时细胞壁延伸因子表达明显抑制。OBP4可能是通过对细胞周期核心调节基因控制细胞周期进程和细胞的扩张。该研究对于揭示植物细胞周期调控与植物生长发育之间联系具有重要意义。