关键词： 高浓度CO2   G蛋白   碳酸酐酶   过氧化氢   气孔运动  

摘要： 随着人类社会工业化的快速发展,大气CO2浓度逐年升高,影响植物的生长发育和生理代谢活动。保卫细胞通过感受环境CO2浓度变化进而调控气孔运动,是植物响应大气CO2浓度升高的一个关键反应。前期研究发现,碳酸酐酶（Carbonic anhydrases,CA）是CO2调控气孔运动的上游信号蛋白,且CA通过调控保卫细胞H2O2的生成进而介导高浓度CO2诱导拟南芥气孔关闭。但CO2调控气孔运动的机制仍不完全清楚。本文以NaHCO3作为CO2处理来源,以拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）野生型（Col-0和Ws）、Gα亚基功能缺失突变体（gpa1-1、gpa1-2、gpa1-3和gpa1-4）、Gα亚基过表达株系wGα和Gα亚基组成型活化表达株系cGα、碳酸酐酶（CA）功能缺失突变体（ca1、ca4和ca1ca4）以及NADPH氧化酶亚基突变体（Atrboh D、Atrboh F和Atrboh D/F）为研究对象,采用气孔生物学法、激光共聚焦扫描显微技术和实时荧光定量PCR技术,从药理学和遗传学角度出发,研究G蛋白在高浓度CO2诱导拟南芥气孔关闭中的作用及其与CA和H2O2的关系。主要研究结果如下: 1.以NaHCO3作为CO2处理来源,其诱导拟南芥野生型（Col-0）气孔关闭的最佳浓度为6 mmol/L,最适溶液pH=6.15。 2.Gα亚基抑制剂百日咳毒素（PTX）抑制6 mmol/L NaHCO3诱导拟南芥野生型（Col-0）气孔关闭,而Gα亚基活化剂霍乱毒素（CTX）增强气孔关闭;6 mmol/L NaHCO3不诱导突变体gpa1-1、gpa1-2、gpa1-3和gpa1-4的气孔关闭,但诱导wGα和cGα株系的气孔关闭;6 mmol/L NaHCO3处理的早期阶段诱导拟南芥野生型（Col-0）叶片GPA1基因表达上调。这些结果表明,G蛋白参与高浓度CO2诱导的气孔关闭。 3.6 mmol/L NaHCO3和CTX的单独及复合处理均不能诱导CA抑制剂AZ和EZ处理的拟南芥野生型（Col-0）与CA突变体ca1、ca4和ca1ca4的气孔关闭,且6 mmol/L NaHCO3不诱导杂交突变体w Ga/ca1ca4和c Ga/ca1ca4的气孔关闭;6mmol/L NaHCO3不诱导PTX处理的拟南芥野生型（Col-0）与突变体gpa1-1、gpa1-2、gpa1-3和gpa1-4叶片的CA酶活增加,但诱导CTX处理的拟南芥野生型（Col-0）与wGα和cGα株系叶片的CA酶活增加;6 mmol/L NaHCO3诱导突变体gpa1-2和gpa1-4叶片CA1和CA4基因表达下调,但未改变突变体ca1ca4叶片GPA1基因的表达。这些结果表明,G蛋白位于CA的上游参与高浓度CO2诱导的气孔关闭。 4.6 mmol/L NaHCO3不诱导PTX处理的拟南芥野生型（Col-0）与突变体gpa1-1、gpa1-2、gpa1-3和gpa1-4的气孔关闭和保卫细胞内源H2O2生成,但外源H2O2可恢复6 mmol/L NaHCO3诱导PTX处理的拟南芥野生型（Col-0）与突变体gpa1-1、gpa1-2、gpa1-3和gpa1-4的气孔关闭;6 mmol/L NaHCO3和CTX的单独及复合处理均不能诱导H2O2清除剂CAT和ASA与NADPH氧化酶抑制剂DPI处理的拟南芥野生型（Col-0）及NADPH氧化酶亚基突变体Atrboh D、Atrboh F和Atrboh D/F的气孔关闭和保卫细胞内源H2O2生成,且6 mmol/L NaHCO3不诱导杂交突变体w Ga/DF和c Ga/DF的气孔关闭和保卫细胞内源H2O2生成;6 mmol/L NaHCO3诱导突变体gpa1-2和gpa1-4叶片At RBOHD和At RBOHF基因表达下调,但诱导wGα株系和cGα株系叶片At RBOHD和At RBOHF基因表达上调。这些结果表明,G蛋白通过调控At RBOHD和At RBOHF催化生成H2O2,进而参与高浓度CO2诱导拟南芥气孔关闭。 综上所述,本文结果表明一种CO2调控拟南芥气孔运动的信号通路模型,即CO2→G蛋白→CA→H2O2→气孔。该结果以期丰富CO2调控气孔运动机制和植物CO2信号转导网络。

关键词： 拟南芥   AtRGS1   G蛋白   胞吞作用   生长发育   抗性反应  

摘要： 异源三聚体G蛋白由Gα、Gβ和Gγ 3个亚基组成,是普遍存在于真核细胞中的跨膜信号转导因子。植物细胞通过定位于细胞质膜的G蛋白信号调节子RGS蛋白(regulator of G protein signaling),调控异源三聚体G蛋白的活性,进而参与生长发育、激素和糖信号转导以及抗病反应等多个重要生物学过程。膜蛋白可通过胞吞循环调控其在细胞质膜上的数量,以响应外界环境因子和自身发育信号。近年来,研究表明多种外界信号诱导拟南芥AtRGS1蛋白的胞吞,进而促进其与Gα亚基的解离,游离的Gα-GTP、Gβγ亚基和定位于内含体的AtRGS1蛋白均可能调控下游信号转导,进而影响相应生物学过程。本文综述了AtRGS1通过胞吞作用调控G蛋白参与的生长发育和抗性反应的分子细胞学机制研究进展,以期为深入理解G蛋白信号调节子影响植物发育进程和抗性反应的作用机制提供理论参考,为植物膜蛋白胞吞调控信号转导提供新的视角。

关键词： At3g21380基因   FUS3蛋白   RY元件   凝胶阻滞实验  

摘要： 种子的发育与植物生命体的正常生长息息相关。种子发育是一个极其复杂的过程,种子特异性基因可在种子特定发育阶段特定部位特异性表达,其表达产物在种子发育及成熟过程中发挥着重要作用,因此对种子特异性基因表达调控的研究极为重要。基因表达过程可被多个层次调控,对基因表达转录水平的调控是控制其表达的重要环节之一。由多种转录因子构成的复杂调控网络的严格控制使基因在特定部位特定时间顺利表达,并编码特定产物发挥其功能。因此对转录水平基因表达调控的研究在分析基因功能及解析植物生长发育调控网络中发挥着重要作用。植物LAFL转录因子在调控种子特异性基因表达中发挥不可忽视的作用,其家族成员—FUSCA3(FUS3)转录因子是种子发育阶段的关键调节因子。多项研究表明,FUS3等LAFL家族转录因子通过与种子特异性表达基因启动子中的RY顺式元件相互作用,从而调控基因在种子发育过程中的表达,参与种子贮藏物质积累及早期幼苗生长等过程。RY元件是研究较为深入的种子特异性顺式调控元件之一,在调控种子特异性基因表达过程中发挥重要作用。本实验室前期实验结果发现编码拟南芥甘露糖结合凝集素蛋白的At3g21380基因是种子特异性基因。对At3g21380基因启动子序列分析发现,该启动子中存在多个RY元件,预示该基因的表达可能受FUS3转录因子调控。为了初步探究FUS3蛋白对At3g21380基因表达的调控机理,开展本次实验:主要实验结果如下:(1)RT-PCR检测拟南芥fus3突变体中At3g21380基因表达水平。提取野生型拟南芥及fus3突变体的总RNA,反转录为c DNA,并以其为模板,扩增At3g21380基因。结果显示野生型拟南芥中At3g21380基因的表达量较高,而拟南芥fus3突变体中At3g21380基因的表达量极低,表明FUS3基因突变后严重影响了At3g21380基因表达,FUS3转录因子可能正向调控拟南芥At3g21380基因表达。(2)获得纯化后的His-FUS3重组蛋白。根据TAIR(https://***/)及NCBI(https://***/)网站提供的拟南芥FUS3基因相关信息及DNA编码序列,利用引物设计软件设计引物。PCR扩增FUS3基因,与克隆载体p EASY-Blunt相连构建重组克隆载体,转化感受态细胞并进行鉴定。将FUS3基因与表达载体p ET-28a相连,转化BL21(DE3)感受态细胞,随后进行菌落PCR鉴定、酶切鉴定及公司测序,结果显示成功构建p ET-28a-FUS3重组表达载体。IPTG成功诱导His-FUS3重组蛋白原核表达,经变性、纯化、复性后获得单一的有活性的FUS3蛋白。(3)制备含RY元件或突变RY元件的DNA探针。分析发现At3g21380基因启动子序列中含有4个RY元件(序列为CATGCA)。按照启动子序列中RY元件的位置,将其依次命名为RY1、RY2、RY3、RY4。根据拟南芥At3g21380启动子序列,设计特异性引物。PCR扩增含有RY元件或突变RY元件的DNA片段,扩增成功后,胶回收备用。(4)凝胶阻滞实验(EMSA)分析FUS3蛋白与RY元件的相互作用。将RY元件或突变RY元件、FUS3蛋白共孵育,随后进行凝胶阻滞实验(EMSA)。凝胶阻滞实验(EMSA)结果表明FUS3蛋白可与拟南芥At3g21380启动子序列中的全部RY元件发生特异性结合,但不同RY元件与FUS3蛋白结合力不同,即:RY3>RY2>RY1>RY4。综上所述,FUS3蛋白通过与RY1、RY2、RY3、RY4元件特异性结合从而正向调控At3g21380基因的表达,且在调节At3g21380基因表达过程中4种RY元件与FUS3蛋白的结合能力大小顺序为:RY3>RY2>RY1>RY4。这一发现为进一步探究At3g21380基因表达的调控机理奠定了基础。

关键词： 异三聚体G蛋白   环核苷酸门控通道(CNGC)   GUS染色   基因表达分析   胁迫  

摘要： 异三聚体G蛋白（简称G蛋白）是一类在真核细胞中保守的重要信号转导分子,介导细胞膜外侧的G蛋白偶联型受体（GPCR）与膜内侧效应器之间的跨膜信号转导,由α、β和γ三种亚基组成。经典的G蛋白信号转导模型中,当细胞外信号分子与GPCR结合后,导致G蛋白解离成活化态的Gα和Gβγ二聚体,它们各自与下游效应器分子相互作用,从而传递和放大信号。在动物细胞中,研究已表明G蛋白直接调控的一类重要的下游效应器为质膜离子通道,包括Ca2+通道。在植物中,通过G蛋白各亚基功能缺失突变体的表型分析已揭示其广泛参与植物生长发育和响应生物和非生物胁迫刺激的信号转导过程,也参与植物细胞Ca2+通道活性的调控。但目前关于G蛋白各亚基基因在植物不同器官、不同生长发育阶段和不同刺激下的表达模式却研究较少,对植物G蛋白调控Ca2+通道活性的作用机制更是少之甚少。环核苷酸门控通道（CNGC）是植物中一类重要的钙离子通透性通道,其通过调控胞质Ca2+水平影响着气孔运动、花粉管和根毛的极性生长、叶片衰老以及植物抗病性等多种生理过程。本实验室前期研究表明G蛋白α和γ亚基与CNGC13和CNGC17钙通道存在物理互作,暗示G蛋白可能直接调控CNGC13/17的通道活性,但目前对CNGC13/17的表达部位及其参与的生物学过程却并不清楚。为了后期深入分析G蛋白与CNGC13/17互作的生物学意义,本论文系统分析了 G蛋白各亚基以及CNGC13和CNGC17基因在拟南芥不同器官、不同生长发育阶段和不同胁迫刺激下的表达模式。结果如下:1.在5天龄幼苗中,GPA1在根尖、主根、下胚轴、叶以及保卫细胞中均有表达,但是根尖和主根中的表达高于下胚轴和叶,且下胚轴和主根中维管组织的表达高于周围组织。在12天龄、三周龄和五周龄植株中,GPA1在根尖、主根、下胚轴、叶以及保卫细胞中也均有表达。在五周龄生殖阶段,GPA1在花的萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊中均有表达。对比不同发育阶段后发现,随着植株的发育,GPA1在下胚轴和主根中的表达均呈现上升趋势,且下胚轴和主根伸长区和成熟区维管组织中的表达始终高于周围组织,而在根尖和叶中的表达呈下降的趋势。水杨酸（SA）、NaCl和聚乙二醇（PEG）处理后对5天龄和三周龄植株主根和根尖中GPA1的表达均有不同程度的抑制,对其他部位的表达具有不同的作用;脱落酸（ABA）处理对不同部位GPA1的表达的影响与发育阶段有关,且影响程度不同。2.在5天龄幼苗中,AGB1在叶片、下胚轴、主根和根尖中均表达,下胚轴中的表达高于其他部位;12天龄植株中,AGB1仍在叶片、下胚轴、主根和根尖中表达,在叶片中的表达增加,而其他部位中的表达降低;三周龄植株中,AGB1仅在叶片中表达,且表达量高于12天龄;五周龄时,AGB1在花的雌蕊中表达,在下胚轴皮层组织也表达。ABA处理对5天龄幼苗、叶和下胚轴中AGB1的表达具有抑制作用,而对主根和根尖中AGB1的表达具有促进作用;SA、NaCl和PEG对5天龄和三周龄植株AGB1的表达均有一定程度的抑制作用。3.在5天龄的幼苗中,AGG1在叶片、下胚轴和主根中表达,而且叶片中的表达明显高于下胚轴和主根中。同样,在12天龄的叶片、下胚轴和主根中表达,但表达量均下降。三周龄和五周龄时,AGG1在叶片和根尖中表达。随着植株的发育,AGG1在叶片、下胚轴和主根中的表达呈下降趋势。ABA、NaCl和PEG处理对5天龄和三周龄植株各部位AGG1的表达均具有抑制作用;SA对不同发育阶段以及不同部位AGG1的表达具有不同的影响。4.在5天龄幼苗中,AGG2在根尖、主根和叶片中有表达,且叶片中的表达高于主根和根尖中;在12天龄时,在叶片和根中表达,且表达量较5天龄有所降低;三周龄时,AGG2在各器官中均未检测到表达,但在五周龄时,AGG2在下胚轴以及在主根中出现表达,且表达量较幼苗期有极大的提升。随着植株的发育,AGG2在叶片中的表达逐渐降低,而在根中的表达先降后增。ABA、NaCl和PEG处理对5天龄和三周龄植株叶中AGG2的表达有促进作用,而SA处理对其有抑制作用;SA和PEG处理对5天龄植株下胚轴中AGG2的表达有促进作用,但对三周龄植株下胚轴中的表达有抑制作用;ABA、SA、NaCl和PEG处理对5天龄和三周龄植株主根和根尖中AGG2的表达均有抑制作用。5.在5天龄幼苗中,AGG3在根尖、主根、下胚轴、叶以及保卫细胞中均有表达,但在叶和主根中的表达高于下胚轴和根尖,且下胚轴和主根维管组织的表达高于周围组织。在12天龄、三周龄和五周龄植株中,AGG3在根尖、主根、下胚轴、叶以及保卫细胞中也均有表达。AGG3在花的萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊中均有表达。而且,随着植株的发育,AGG3在下胚轴和主根中的表达均呈先降低而后上升的变化趋势,而在根尖和叶中的表达始终呈下降的

关键词： 异三聚体G蛋白   阿罗酸脱水酶   苯乙酸   葡萄糖信号  

摘要： 由α、β、γ三个亚基组成的异三聚体G蛋白是在真核细胞中保守的信号转导分子，通常与7次跨膜的G蛋白偶联受体一起将胞外信号传递到胞内。拟南芥仅有一个经典的α亚基(GPA1)，一个β亚基(AGB1)和三个γ亚基(AGG1-3)。现有的研究结果表明G蛋白信号通路参与植物生长发育与抗逆等诸多的重要过程，包括介导糖与生长素等信号通路。但G蛋白的作用机制尚不清楚。　　为了回答G蛋白是否参与葡萄糖调控的植物生长发育的问题，我们使用不同浓度的葡萄糖处理野生型与G蛋白功能缺失突变体，包括gpa1、agb1、gpa1agb1和rgs1，结果发现除gpa1和gpa1agb1之外，相较于1％葡萄糖处理，3％葡萄糖能显著地增加野生型、agb1和rgs1的侧根（Lateralrootsemergence，LRE）密度，说明由中低葡萄糖浓度诱导的侧根发育依赖于GPA1。为了解析GPA1介导的作用机制，我们运用酵母双杂交体系以GPA1作诱饵筛选互作蛋白。体内外的实验结果结果表明GPA1与阿罗酸脱水酶(ArogenateDehydratases，ADTs)直接互作。拟南芥基因组一共编码6个ADTs，我们发现除ADT2外的其他5个ADTs均能通过QAVEL基序与GPA1互作，但亲和力随GPA1的不同状态而有所差异。另外，体外酶活分析发现只有ADT4/ADT5活性不受其产物苯丙氨酸的反馈抑制。有趣的是ADT4和ADT5在WT中过表达导致转基因植株生长严重抑制，但在gpa中过表达没有明显的生长缺陷。进一步分析表明GPA1突变导致ADT4的蛋白积累水平剧烈下降，但不影响转基因的mRNA水平，说明GPA1具有增加ADT4蛋白稳定性的作用。这些结果解释了过表达ADT4/5因积累过多的苯丙氨酸及其衍生物而引起植物生长发育缺陷的表型。　　与ADT4相似，ADT3蛋白水平在gpa1中也明显下降。以前的报道表明ADTs的表达受糖诱导，我们的实验结果证明葡萄糖诱导的ADT3蛋白积累也依赖于GPA1。蛋白酶体抑制剂MG132处理能明显提高ADT3和ADT4在gpa1背景下的蛋白水平，说明ADT3和ADT4通过26S蛋白酶体降解。激光共聚焦显微镜三维成像分析结果表明ADT3-GFP的亚细胞定位成点状，主要分布于叶绿体附近与细胞质膜，并且荧光强度依赖于GPA1，说明GPA1与ADT3之间的互作发生在细胞质膜上。为了阐明GPA1与ADTs互作是否也影响他们的催化活性，我们纯化了重组蛋白并分析了不同活性状态的GPA1对ADT3的预苯酸脱水酶（PrephenateDehydratase，PDT）活性的影响，结果表明ADT3具有PDT的活性，而GDP结合状态的GPA1与ADT3的互作能增强其PDT的活性，暗示催化产物苯丙酮酸(PPA)有可能进入苯乙酸(PAA)的合成途径。遗传学实验证据显示GPA1和ADT3位于同一遗传途径参与葡萄糖调控LRE密度。另外，gpa1和adt3对6％葡萄糖超敏感，而PAA处理可以部分恢复gpa1和adt3对葡萄糖响应的表型，说明生长素PAA具有促进成苗的作用。因此，我们的实验结果证明了GPA1-ADT3互作模块在连接糖信号调节的生长素PAA合成中起着重要作用。　　综上所述，本研究结果揭示了GPA1在葡萄糖诱导的侧根发育过程中通过调控ADT3的蛋白稳定性及其PDT活性启动生长素PAA合成的分子机制，为我们认识糖为什么具有类似生长素一样的功能提供了理论依据。

关键词： E3连接酶   基因克隆   诱导表达  

摘要： 逆境胁迫是植物正常生长发育与作物产量提高的重要限制因素,具有锌指结构的E 3泛素连接酶作为一个重要的蛋白家族,在植物逆境胁迫应激中起着重要的调控作用。本文从一个含有锌指结构的蛋白AT 5 g 47610出发,通过PCR对其基因进行克隆,然后连接到PET 32 a原核表达载体,37℃通过0.2 mM IPTG诱导出了目标蛋白,为后续的蛋白功能鉴定研究奠定了基础。

关键词： 干旱胁迫   茉莉酸   磷脂酶Dδ   G蛋白   信号关系  

摘要： 干旱胁迫对植物的生长发育、物质代谢、信号传递、抗氧化酶系等都有非常重要的影响,它使得植物细胞中内源激素茉莉酸（Jasmonic acid,JA）等大量积累,从而提高植物对干旱胁迫的适应性和耐受性。JA与各种信号分子之间的作用关系非常复杂,了解各种信号分子之间的作用关系有助于我们更好地理解生物响应干旱胁迫的机理,也能为增强农作物的抗旱能力、提高农业生产提供理论依据。JA可以诱导多种细胞发育反应,与多种信号分子相互作用,信号网络复杂。脂氧合酶（Lipoxygenase,LOX）是JA生物合成过程中的第一个关键酶,分为9-LOX和13-LOX,其中13-LOX被广泛认为参与JA生物合成,但是9-LOX是否参与该过程仍不清楚。磷脂酶D（Phospholipasee D,PLD）是催化磷脂分子中磷酸二酯键水解以及碱基交换反应的一类酶的总称,其水解产物磷脂酸（Phosphatidic acid,PA）被认为是植物细胞中的第二信使,故PLD也被认为是一种重要的信号酶。拟南芥中有12种基因编码PLD,由于分子结构的差异性,这12种基因在调控植物生长发育及信号转递的过程中分别发挥了不同的作用,其中PLDδ能被高盐和脱水快速激活。已有研究表明,PLDα1和PA参与JA的生物合成过程,那么PLDδ是否也具有和PLDα1相似的作用,在响应干旱胁迫的过程中参与JA的生物合成,与此相关的文献尚未见报道。G蛋白参与多种生物及非生物胁迫信号通路。Gα亚基是G蛋白的功能亚基,能与PLDδ上的DRY基序结合并反应。Gα亚基在调节JA诱导基因的表达中起作用,JA也可能直接作为配体在拟南芥G蛋白信号中起作用。但是,关于干旱胁迫下G蛋白在JA调控的信号中的作用也不明确。因此,我们以拟南芥哥伦比亚野生型（WT）、GPA1缺失型突变体（gpa1-4）、磷脂酶Dδ（PLDδ）缺失型突变体（pldδ）以及脂氧合酶（9-LOX）缺失型突变体（lox1和lox5）种子及实生苗为实验材料,以0.3 mol·L-1甘露醇模拟和传统的土壤缺水法相互结合进行干旱胁迫处理,研究了干旱胁迫下PLDδ和9-LOX参与JA生物合成过程的作用,以及JA、G蛋白与PLDδ的信号传导关系,了解分析它们参与植物抗旱性的作用,旨在阐明干旱胁迫下JA、G蛋白与PLDδ的作用机制和信号响应传导途径。所得实验结果如下:1.干旱胁迫使得PLD和LOX酶活性,PLDδ和LOX1基因表达显著提高;干旱胁迫下,pldδ突变体幼苗的LOX活性和JA含量显著低于WT,外施PA后LOX活性和JA含量显著上升,并高于WT;干旱胁迫显著抑制pldδ、lox1和lox5突变体的种子萌发,其中对lox1的抑制效果最为明显;干旱胁迫下外施PA促进WT、pldδ和lox1的种子萌发,但对lox5没有显著影响;干旱胁迫下外施JA能促进WT和pldδ的种子萌发,但不能促进lox1和lox5的种子萌发。研究表明:干旱胁迫下PLD活性上升与PLDδ基因表达上调有关,LOX活性上升与LOX1和LOX5基因表达上调有关,其中LOX1基因起主要作用;PLDδ/PA位于9-LOX上游参与9-LOX诱导的JA合成过程;PLDδ,LOX1和LOX5基因均参与干旱胁迫下拟南芥的种子萌发,其中LOX1在此过程中作用最为明显;PLDδ和9-LOX均参与了PA和JA介导的种子萌发过程。***通过调节GPA1来影响PLD活性和PLDδ基因的表达;GPA1参与外源MeJA对种子萌发的调控作用,GPA1和PLDδ不参与内源JA对种子萌发的调控作用;外源MeJA降低了WT中的MDA含量和REC水平,并增加了gpa1-4和pldδ两种突变体中的MDA含量和REC水平,JA合成抑制剂对MDA含量和REC水平没有显著影响;干旱胁迫使得WT、gpa1-4和pldδ的气孔密度显著增加、气孔开度显著减小,外施MeJA使得WT、gpa1-4和pldδ的气孔密度显著减少、对WT和gpa1-4的气孔开度无显著影响,但使得pldδ的气孔开度显著减小;干旱胁迫下,WT中干旱响应基因RD29A的基因表达量显著高于pldδ,外施MeJA后,WT和pldδ中RD29A的基因表达量均显著上调。研究表明:干旱胁迫下,JA对PLD活性以及PLDδ基因表达的调节具有浓度依赖性,且G蛋白也参与此调节过程;GPA1和PLDδ参与JA对种子萌发的调控过程;GPA1和PLDδ在MeJA对细胞膜的保护中发挥作用;MeJA能够通过降低气孔密度和减小气孔开度来增加植物的耐旱性,并推测此过程的调节依赖于G蛋白;pldδ突变体植株不耐旱的原因之一是响应干旱胁迫的基因RD29A的表达量不高,外施MeJA能够上调RD29A基因表达,增加植物的耐旱性。

关键词： 拟南芥CBP60g   表达纯化   大肠杆菌表达系统   昆虫细胞表达系统  

摘要： 植物通过调节胞内钙离子浓度对外界不良环境因素进行防御。钙调素(CaM)是一类最主要的钙离子感受器,钙离子-钙调素(Ca2+-CaM)复合体与钙调素结合蛋白(CBPs)结合构象发生变化后参与植物对生物和非生物胁迫的响应。CBP60g蛋白作为CBPs蛋白家族中的重要一员,在抗病、抗旱、正向调节ABA和SA介导的信号途径以及负调控花青素的合成过程中起着非常重要的作用。本研究尝试了在大肠杆菌和昆虫细胞内进行可溶性表达和纯化拟南芥CBP60g蛋白,期望为今后解析其三维结构提供依据。具体结果如下:1.对CBP60g的氨基酸序列进行分析和预测表明,其含有11个糖基化位点、76个磷酸化位点、没有跨膜结构域。2.以野生拟南芥cDNA为模板,利用PCR扩增技术得到拟南芥CBP60g故基因,其cDNA 全长为 1689 bp。3.利用TEV-LIC技术分别构建大肠杆菌表达载体,并转化到表达菌株BL21(DE3)。经不同浓度IPTG进行诱导,SDS-PAGE检测发现,目的蛋白CBP60g主要以包涵体的形式存在。4.成功构建杆状病毒转移载体,转化到*** DH1OBac后得到重组杆状病毒质粒,转染到昆虫细胞中进行表达蛋白。SDS-PAGE检测目的蛋白大小约为75 KDa,比预测蛋白大小(62 KDa)略大。经过阴离子交换纯化后,根据所建立的蛋白标准曲线计算蛋白浓度为996.5 ng/mL,经过Western Blotting验证,所纯化的蛋白质为CBP60g。

关键词： 植物免疫学   异源三聚体G蛋白   G蛋白效应蛋白   信号通路   调控机制  

摘要： 异源三聚体G蛋白由α、β和γ三个亚基组成，在真核细胞中具有广泛的调控作用。静息状态下，结合GDP的Gα与Gβγ形成异源三聚体。动物中具有七次跨膜结构域的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)接收胞外信号，并通过具有鸟苷酸交换因子(Guanine Nucleotide Exchange Factor，GEF)活性的胞内结构使Gα结合的GDP被GTP替换而激活G蛋白。激活的Gα与Gβγ发生解离，分别作用于下游靶标，称之为G蛋白的效应蛋白(effector)。G蛋白回到静息状态依赖Gα的GTP水解酶(GTPase)活性，Gα能够在一类具有GTPase加速(GTPase-Accelerating Protein,GAP)活性的RGS(Regulator of G Protein Signaling)蛋白协助下，迅速水解GTP变为GDP。植物中不存在典型的GPCR，并且植物Gα具有不依赖于GEF的自激活活性。植物G蛋白在信号刺激前后是如何被调控的目前仍是植物科学研究还未解决的一个重要问题。　　拟南芥基因组编码四个Gα亚基GPA1、XLG1、XLG2和XLG3，一个Gβ亚基AGB1，三个Gγ亚基AGG1、AGG2和AGG3，一个RGS蛋白RGS1。越来越多的研究表明植物G蛋白与位于细胞膜上具有单次跨膜结构域的受体激酶(Receptor Kinase，RK)或受体蛋白(Receptor-Like Protein,RLP)偶联。FLS2是具有单次跨膜结构域的受体激酶，能识别细菌鞭毛蛋白(flg22)并激活下游的免疫反应。本实验室发现XLG2与FLS2互作，免疫激活前后通过不同方式参与FLS2介导的免疫响应。本研究以FLS2介导的免疫信号转导为例，探索拟南芥G蛋白在跨膜信号转导中的调控机制并寻找G蛋白的效应蛋白揭示其调控植物免疫的机理。　　类似动物中配体诱导的G蛋白解离激活，拟南芥中flg22也能诱导G蛋白的解离。进一步研究发现GTP处理Gα与Gβ的互作减弱，GTP结合结构域缺失的Gα与Gβ的互作增强，并且XLG2的GTP结合结构域对其免疫功能的发挥必不可少。这说明植物G蛋白的激活同样受Gα不同鸟苷酸结合形式的调控。　　本研究发现rgs1突变体中flg22诱导的免疫反应增强，表明RGS1负调控植物的免疫响应;RGS1与FLS2和Gα都存在蛋白互作，表明RGS1可能通过免疫受体来实现对G蛋白的调控。进一步研究发现，rgs1中Gα与Gβ的互作减弱，其中回补野生型RGS1能恢复互作而GAP活性缺失的RGS1则不能，说明RGS1通过其GAP活性维持G蛋白异源三聚体的稳定，暗示静息状态下RGS1依赖其GAP活性抑制G蛋白在FLS2介导的免疫信号通路中的激活。　　为检测RGS1在植物免疫信号通路中是否受到调控，本研究通过蛋白互作体系发现flg22能诱导RGS1与FLS2和G蛋白的解离，这与flg22诱导G蛋白激活相互对照，暗示RGS1与G蛋白的解离导致RGS1对G蛋白的去抑制。进一步通过质谱结果发现，flg22诱导RGS1的C端Ser431等多个位点发生磷酸化修饰;将Ser431位突变为不能被磷酸化的Ala(S431A)能增强静息状态下RGS1与Gα和FLS2的互作，并且flg22不再能诱导RGS1与Gα和FLS2的解离;相反地，将RGS1的C端多个磷酸化位点突变为模拟磷酸化形式的天冬氨酸Asp(4D)会减弱RGS1与Gα和FLS2的互作;说明RGS1的磷酸化修饰对flg22诱导的RGS1与Gα和FLS2的解离是充分而必要的。本研究还发现除flg22以外，其他病原菌相关分子模式也能诱导RGS1C端Ser431的磷酸化;进一步通过原生质体体系以及体外激酶反应证实，蛋白激酶BIK1/PBLs参与上述磷酸化修饰过程。接下来本研究利用磷酸化位点突变形式的RGS1检测RGS1的解离是否导致G蛋白的去抑制，在RGS1S431A存在时Gα与Gβ的解离受到抑制，而RGS14D存在时Gα与Gβ的互作受到抑制;并且RGS1S431A的稳定转基因植株表现出与G蛋白突变体类似的免疫缺陷表型，表明RGS1的磷酸化导致G蛋白的激活，因此得出结论:RGS1抑制G蛋白的解离激活，flg22能诱导RGS1发生磷酸化修饰导致与Gα发生解离而解除对G蛋白的抑制并激活植物免疫。　　为进一步探索植物G蛋白下游的效应蛋白，本组前期通过XLG2的质谱分析筛选出与XLG2存在互作的一类蛋白，我们称之为XAP(XLG2-Associated Protein)。本研究发现xap多重突变体对细菌诱导的抗性明显高于Col-0而XAP过表达的转基因材料明显低于Col-0。根据已有结果推测，激活形式的XLG2进入细胞核与XAP互作，并通过某种未知的机制调控下游免疫反应。　　

关键词： BES1   AGB1   蛋白互作   磷酸化   细胞伸长  

摘要： 在植物体中有一类类固醇类激素油菜素甾醇(brassinosteroid,BR),它能够调控植物细胞的伸长和分裂,植物开花,抗旱抗病以及光形态建成等生理过程,对植物的生长发育至关重要。之前的研究表明:BR信号能与G蛋白信号相互作用进而影响植物的生命活动,但与此相关的调控机制尚不明确。本文发现G蛋白β亚基AGB1能与BR信号通路的关键转录因子BES1互作,并阐明了这两种重要信号交叉作用的调控机制。首先,酵母双杂交实验、体外Pull-down以及Co-IP蛋白互作技术的结果表明AGB1能与BES1蛋白在细胞体内和体外发生互作。此外,BR敏感性实验分析发现agb1-2对BR极不敏感,而对BR的合成抑制剂BRZ(brassinazole)高度敏感,这些结果证明AGB1参与了BR信号通路并且能够促进下胚轴伸长。为了揭示AGB1调控BR信号促进细胞下胚轴伸长的分子机制,我们进行了qRT-PCR,酵母单杂,Dual-LUC试验分析和Western-Blot试验,发现AGB1能够影响BES1蛋白的磷酸化状态,提高去磷酸化BES1蛋白与磷酸化BES1蛋白的比值,促进活性形式的去磷酸化BES1进入细胞核,激活BES1的转录活性,增强BR信号的输出。本文利用遗传、分子和生化等手段揭示了关于AGB1与BES1互作共同调控BR信号通路的分子机制,既加深了对BR信号转导机理以及植物G蛋白作用机理的认识,同时为进一步研究G蛋白信号与植物激素相互作用调控植物发育的机制拓宽了新的思路。