关键词： β-地中海贫血   突变   5′端非编码区   上游开放阅读框  

摘要： β-地中海贫血症是一种珠蛋白生成障碍的常染色体隐性遗传病。而γ珠蛋白基因的开放表达和胎儿血红蛋白的合成,是缓解β地中海贫血病人临床表型的一个重要因素。本研究针对202个血红蛋白相关调控基因或mi RNA,对1802个β-地中海贫血症患者进行了目标区域捕获测序。通过生物信息学的分析,检测出了所有捕获区域内的突变。进一步对位于5′端非编码区(5′untranslated region,5′UTR)的突变进行系统扫描,共计寻找到41个影响u ORF(upstream open reading frame,u ORF)有或无的功能性突变。从中选取了CHTOP基因(chr1:153606541 C>T)和TGFB1基因(chr19:41859418 G>A)的两个突变,通过定点诱变和双荧光素酶报告实验,在体外证实这两个突变均可显著地改变下游基因的表达。该研究结果为β-地中海贫血症临床表型的精确诊断提供了潜在的筛查靶点。

关键词： 上游开放阅读框   翻译调控   靶点基因  

摘要： 研究背景与目的在真核生物体内,以DNA作为模板合成RNA的过程称为转录。绝大多数细胞体内的RNA主要包括三大部分：信使RNA (messenger RNA, mRNA)作为翻译的模板,指导蛋白质的生物合成;核糖体RNA(ribosomeal RNA, rRNA),与核糖体蛋白一起形成核糖体在mRNA上进行扫描,成为蛋白质翻译的场所;转运RNA (transfer RNA, tRNA),作为适配器根据mRNA上密码子携带相应的氨基酸进入到核糖体内参与多肽链的组装。此外,还有一些核小RNA(sn RNA)和微小RNA(mi RNA)分别与mRNA的剪切和基因表达调控有关。可见,mRNA在蛋白质生物合成中占据着举足轻重的地位。基因的表达是一个十分复杂过程,一个基因能否表达以及表达量的高低,在很大程度上受到多个层次、多方面水平调控,从DNA的复制,RNA的转录,mRNA的剪接加工,蛋白质的翻译,到翻译后的修饰等均可参与基因的表达调控。其中,转录后的调控机制是研究较为透彻的。刚转录出来的前体mRNA (precursor mRNA)必须完成加工剪接后才能成为成熟mRNA (Mature mRNA)并作为模板指导蛋白质生物合成。在真核细胞中,一个成熟的mRNA包括5’端的7-甲基鸟嘌呤的帽结构,5’端的非翻译区(5’untranslated region,5’UTR),编码蛋白质的翻译序列,3’端的非翻译区(3’untranslated region,,3’UTR)和PolyA尾。作为成熟mRNA的一部分,在5’UTR内存在着一些可以影响下游蛋白编码区—主要开放阅读框(main open reading frame, mORF)翻译的顺式作用元件,例如某些较长的5’UTR序列可能会形成妨碍核糖体在mRNA上扫描的二级结构、与不依赖帽结构(Cap-independent translation initiation)参与翻译相关的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites, IRESs),发夹结构,某些蛋白结合位点以及上游开放阅读框(upstream open reading frame, uORF)。到目前为止,作为翻译调控元件的uORFs的研究是最为广泛,据文献报道,uORF普遍存在哺乳动物的转录本中,大约49%的人类基因和44%的小鼠基因转录本的5’UTR中至少包含有一个uORF。研究表明,uORF可以通过多种调控机制减低对下游基因翻译起始的效率或是引发mRNA的降解来对蛋白表达产生抑制作用。这些调控机制主要涉及到uORF的长度、个数、序列在物种间的保守性、与5’末端帽结构相对位置、与下游编码序列的距离以及uAUG周围的序列文本。研究还表明,uORFs序列上位点的多态性会影响基因的表达,这可能会与人类疾病表型存在一定的相关性。例如凝血因子Ⅻ,该基因的uORF上存在一个等位基因的C/T的多态性位点,其中含有碱基T的那条等位基因的经体外实验验证蛋白表达降低了大约50%。这说明,自然发生在uORF上多态性似乎能够改变下游基因的表达。此外,已有的文献还报道,来自遗传与生物信息学的研究表明,某些人类疾病的发生与uORFs序列上突变有着密切关系,突变的发生可以导致uORFs的产生或消失,显著影响下游基因的表达。其中已报道的由多态性或突变产生uORFs导致人类疾病共有14种,反之,由多态性或突变致使uORFs消失的引起的人类疾病有2种,此外还包括其他一些间接的因素如uORFs编码的短肽、翻译起始因子的磷酸化等均可围绕uORFs对下游基因表达产生显著的影响。到目前为止,对于人类多种疾病的变化与uORF之间关系尚无系统性的研究,为此,在前期应用生物信息学的手段对几个现有的公共数据库中人类基因转录本上uORF进行研究,通过数据过滤、筛选、GO功能注释和Kozak序列特征的分析,以及ClinVar、TCGA、COSMIC三个疾病数据库分析的基础上,在多形性胶质母细胞瘤、子宫内膜癌与头颈部鳞状细胞癌病人的突变基因中随机挑选出高度怀疑蛋白表达的改变与uORF密切相关的靶点基因,并进行实验验证。我们希望通过这项研究,让更多的研究者关注人类疾病与uORF的关系,有助于理解疾病的表型与基因型的关系,为研究疾病发生的机制提供新的思路,也为疾病的临床治疗提供新的方向。材料与方法1.在前期生物信息学数据分析的基础上的研究我们利用现有的refGene、Genebank等数据库计算并注释出所有经实验验证的基因的5’UTR的起始和终止坐标并提取其序列,经过一致性校对,筛选出两套数据集中完整性和一致性高的序列条目,然后扫描含有uORF的转录本及其对应的基因名。对遴选出来含有uORF的基因进行GO功能注释与富集,对翻译起始位点(translati

关键词： 上游开放阅读框   5’端非翻译区   功能富集   突变注释  

摘要： 背景与目的 根据中心法则,转录是以基因组上的DNA序列为模板,合成为RNA序列的过程。其中产生的信使RNA(messenger RNA,mRNA)携带遗传信息,翻译出相应的蛋白质,作为生命活动的承担者。 与原核生物不同的是,真核生物的转录过程,经历了以下步骤：1.以基因组DNA为模板复制出一段mRNA前体,即pre-mRNA。2.在pre-mRNA的5’端加上经过甲基化修饰的鸟嘌呤(5’capping)。5’端帽结构对mRNA的翻译起始具有重要的作用,它参与核糖体复合物(ribosome)对mRNA的识别,介导核糖体复合物与mRNA的结合,使核糖体复合物浏览mRNA序列并选择识别AUG起始密码子而开始相应肽链的合成,这个过程被称为“依赖于帽结构的翻译起始"(cap-dependent translation initiation)。另外,5’帽结构亦增强了mRNA的稳定性,避免新合成的mRNA因核酸外切酶所降解。***剪接(mRNA splicing),即pre-mRNA去除内含子保留外显子的过程。同一段pre-mRNA可具有不同的剪接方式,从而最后呈现为序列各异的成熟uRNA,即选择性剪接。4.多聚腺苷酸化(pohyadenylation),即通过polyA聚合酶,在pre-mRNA的3端加上一段腺苷酸(数目各异,通常为几百个),即poryA序列。这段序列会被多聚腺苷酸结合蛋白结合并产生保护作用。 从序列特征而言,一个典型的编码蛋白的人类成熟nRNA可以分成以下几个部分(从5’端到3’端)：5’端帽结构;5’端非翻译区序列,即5’UTR(5’untranslatedregion);编码蛋白质的序列(CDS,coding sequence,以起始密码子开头,以终止密码子结束),也叫开放阅读框(ORF,open reading frame);3’端非翻译区序列,即3’UTR(3’untranslated region);以及PolyA尾。 成熟rnRNA的5’UTR序列,包含着调控元件,影响着下游主要开放阅读框的翻译。不同的mRNA其5’UTR序列长度各异,从几十到数千个碱基不等。 5’UTR序列含有多种影响下游主要开放阅读框翻译的调控元件,包括uAUG(upstream AUG), uORF(upstream open reading frame), IRES(internal ribosome entry site)以及hairpin结构。一条mRNA链翻译的开始,是核糖体40S亚基首先识别InRNA的5’帽结构并结合在mRNA分子上,然后从5’端至3’端方向浏览InRNA,寻找合适的AUG起始密码子并开始翻译[7]。于是,在真正的翻译起始密码子与5’帽结构之间,还可能会存在AUG,我们将这些AUG称为uAUG,当uAUG与其后的序列形成一个开放阅读框(AUG开头,终止密码子结尾,并且总的碱基数为3的倍数)时,则称这个开放阅读框为uORF,它是相对于下游主要开放阅读框(main open reading frame)而言的[8]。 过去对包括人类的哺乳动物的成熟mRNA的5’UTR研究发现,5’UTR中存在uAUG和uORF并非罕见的现象,存在uAUG或uORF的5’UTR占已研究对象总数的12%50%[13]。其中uORF的存在对下游主要开放阅读框的翻译效率起着重要调控作用,它主要是通过引发nRNA的降解(mRNA decay)或调节翻译来控制基因的表达水平。有研究表明,当一个mRNA存在uORF调控的机制时,那么uORF结构的破坏,会导致许多人类疾病的发生,包括肿瘤,代谢或神经系统疾病等[10]。如HR和TPO基因,这两个基因的转录本5’UTR上均含有uORF结构,但当它们的结构被破坏(前者是uORF的起始密码子突变,后者是uORF序列产生了一个新的终止密码子),分别导致了MUHH遗传性稀发症和血小板增多[4]。 与之相对的,当一个基因的5’UTR序列在野生型状态下没有uORF结构但是突变产生了uORF序列,同样会显著影响下游主要开放阅读框的生理性表达,而导致疾病。截至2013年,共报道14例这样的突变,其中包括HBB, POMC等基因,由于它们突变后产生了新的uORF,而分别导致了p地中海贫血(β-thalassemia)和阿黑皮素原缺陷症(Proopiomelanocortin deficiency)。 在现有的数据库中,人类基因组有多少含有uORF的基因?含有uORF的基因是否富集于某个功能亚类中?uORF的起始密码子两侧序列文本是否与真正的翻译起始密码子序列文本有明显的差异?最后,目前主流的疾病和肿瘤数据库中,所报道的基因组的variation,还有哪些是和uORF的产生或消失相关?并且实验验证,这些突变是

关键词： 上游开放阅读框   翻译调控   进化   转录因子   转录物  

摘要： 基因组中约有20%的基因具有上游开放阅读框(upstream open reading frame,uORF),它位于成熟mRNA 5’端非编码区(5’-UTR)。本文简介了uORF同源群的挖掘方法、分类和进化,以及调控下游mORF翻译的研究进展。植物(拟南芥和水稻等)和昆虫(果蝇等)基因组中普遍存在保守肽uORFs,并且在序列多样性方面有相似之处。但它们在平均长度、基因组聚类、与甲基转移酶的关联性上有所不同。植物uORF的长度通常短于昆虫uORF。借助拟南芥和水稻全长cDNA序列比较,不同的uORF同源群对其下游如转录因子,信号转导因子、发育信号分子和翻译起始因子eIF5等编码基因的mORF具有调控功能。对于真核生物基因组中包含CHCH域的uORF进行贝叶斯系统发育分析,结果表明,同源群8-like分属5个物种(绿藻、节肢动物、线虫、无脊椎动物和真菌)。在真核生物生长、发育和生理过程中,uORF通常作为反式因子对mORF表达起调节器作用,例如,在植物蔗糖、多胺、磷脂酰胆碱,以及甲基转移酶反应中,相当大比例的uORF参与介导mORF的翻译调控。