关键词： 5'UTR   内部核糖体进入位点   上游开放阅读框   上游起始密码子   二级结构   5'UTR内含子  

摘要： 5'非翻译区(5'Untranslated Region,5'UTR)在基因表达调控中发挥重要作用,其不仅在翻译水平调控基因表达,还参与真核基因转录、转录后加工、成熟RNA运输等水平的调控。5'UTR介导的基因表达与自身存在的相关调控元件有关,主要包括内部核糖体进入位点、5'UTR二级结构、上游开放阅读框、上游起始密码子以及5'UTR内含子等元件,5'UTR异常可引起基因表达异常并引发疾病。本文综述了5'UTR调控基因表达的研究进展,以期为今后5'UTR的作用机制及相关疾病的诊断与治疗提供新的方向和理论依据。

关键词： 上游开放阅读框   翻译调控   转基因抗病育种   效应因子  

摘要： 在许多真核生物的转录本中广泛存在一类调控元件——上游开放阅读框(upstream open reading frame,uORF),它是位于信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,m RNA)5’非编码区的小开放阅读框,其起始密码子位于编码区起始密码子的上游,对下游编码区的翻译具有重要的影响。在农业生产中,农作物受到真菌、细菌、病毒等病原菌的侵染,引起多种病害,导致产量降低、品质不高,甚至人畜中毒。培育抗病品种是防治作物病害最经济环保有效的措施,转基因育种是植物抗病育种的重大突破,它通过将来源于其它生物的基因转入作物中使作物提高抗病性,但是植物在获得抗性的同时往往会对植物的生长发育产生不良影响。为了解决这个问题,本研究中提出了uORF介导的转基因育种新策略,期望通过利用uORF的调控作用使转基因植物的抗性与生长达到平衡。此外,疫霉菌是多种作物上危害比较严重的一类病原菌,在植物与疫霉菌互作过程中,疫霉菌分泌的效应因子是对植物致病的重要武器,本研究中以疫霉菌的效应因子作为切入点,利用了拟南芥(Arabidopsis thaliana)与丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae ***,Pst)DC3000的互作系统展开研究,具体研究内容如下:建立研究uORF功能的体系及ACD11-uORFs功能的初步探索:本研究选择了一种重要的拟南芥免疫系统调控因子加速细胞死亡11(accelerated cell death11,ACD11)的uORFs作为研究对象,通过将ACD11-uORFs、绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)、荧光素酶报告基因(luciferase,LUC)构建到p SUPER载体上,得到改造后的载体uORFs-GFP,将其在烟草中表达,通过活体成像仪观察到GFP的绿色荧光和LUC催化底物氧化时发出的生物荧光,并通过蛋白Western blot检测到与目的蛋白相同大小的目的带,说明了重组载体uORFs-GFP可以正常表达,本研究建立的研究uORF功能的体系是成功的。运用建立的体系,对uORFs-GFP以及uORFs-GFP突变获得的七个突变体进行研究,发现uORFs的不同组合对下游GFP的翻译具有不同的抑制效果,并且uORFs是作为调控元件在m RNA翻译水平上调控GFP的表达。uORFs在转基因抗病育种中的探索:利用uORFs的不同组合与抗病基因凝集素受体激酶Lec RK4.1串联表达,发现不同组合中Lec RK4.1的表达量不同,引起烟草细胞死亡情况不同,对辣椒疫霉菌都具有抗性,但是抗性强弱不同;利用uORFs的不同组合与感病基因BZR1串联表达,可以使烟草获得不同强度的抗性。利用拟南芥与DC3000的互作系统筛选疫霉菌的效应因子:利用实验室前期建立的筛选系统,采用两种筛选方案筛选疫霉菌的效应因子,第一种是将效应因子转入DC3000突变体菌株D36E中,筛选引起拟南芥黄化等表型的疫霉菌效应因子,筛选了9个辣椒疫霉菌的效应因子和4个大豆疫霉菌的效应因子,与对照相比,将Ps CRN63转入D36E之后,接种的拟南芥叶片出现了黄化现象,其余没有明显表型;第二种筛选方案是将效应因子转入DC3000菌株中,筛选引起接种三天后的拟南芥叶片中DC3000数量明显变化的效应因子,筛选了5个效应因子,与对照相比,细菌数量没有明显差异。

关键词： 脊椎动物基因   上游开放阅读框   Hippo信号通路   PPP1CB基因   蛋白翻译  

摘要： 上游开放阅读框(upstreamopenreadingframe，uORF)是一段起始密码子位于基因上5非翻译区(5untranslatedregion，5UTR)的序列，具有编码肽段的能力，可以通过调控mRNA稳定性或翻译效率等方式，影响其下游CDS产生的蛋白丰度，因此是一种重要的基因表达调控元件。但目前针对uORFs的研究还比较有限，大部分uORFs的功能还有待阐明，这阻碍了对蛋白翻译调控过程的深入探究。uORF的起始密码子不仅可以是ATG，还可以是CTG、GTG、TTG或ACG，但之前的研究对非ATG密码子起始的uORFs的关注还较少。本项目结合生物信息学与实验生物学的方法，系统鉴定了脊椎动物多组织中翻译的uORFs，分析了翻译的uORFs的序列特征和保守性，同时解析了uORFs对翻译的影响，为后续的研究奠定了基础。　　我们系统预测了人、小鼠和斑马鱼等13个具有完整测序基因组的脊椎动物物种中以ATG、CTG、GTG、TTG或ACG密码子起始的uORFs。为了更精准地鉴定翻译的uORFs，我们改进了常用的通过Ribo-seq数据鉴定翻译的uORFs的流程，并结合Ribo-seq数据对翻译的uORFs的起始密码子进行鉴定。我们从人类7个正常组织或细胞类型和1个癌症组织中一共鉴定到10124个翻译的uORFs，占比不足预测的总uORFs数量的4％，表明大部分预测的uORFs并不翻译，需要进一步探究翻译的uORFs。　　相比于不翻译的uORFs，翻译的uORFs倾向于使用ATG作为起始密码子，而且翻译的uORFs的长度更长，序列中GC含量更高。人中75％以上翻译的uORFs仅在一种组织中翻译，但也有部分uORFs在多个组织中均翻译，表明uORFs的翻译兼具组织特异性和广泛性。相比于人中不翻译的uORFs，翻译的uORFs中具有同源序列的比例显著增加，表明翻译的uORFs比不翻译的uORFs具有更高的序列保守性。但是，翻译的uORFs仍比CDS的序列保守性低。　　翻译的uORFs的起始密码子、长度和GC含量等序列特征不仅影响自身的翻译效率，也与其下游CDS的翻译效率相关。广泛翻译的uORFs的翻译效率显著高于仅在一种组织中翻译的uORFs，并且广泛翻译的uORFs所在基因的翻译效率没有显著低于无翻译的uORFs所在基因的翻译效率。翻译的uORFs所在的基因参与了众多生物学过程，其中广泛翻译的uORFs所在基因参与了自噬和泛素介导的蛋白降解过程，翻译且序列保守的uORFs参与了细胞周期和部分信号通路调节过程。而且，在至少4个物种的特定组织中均翻译的uORFs的同源基因的功能与该组织的生理功能相关。　　我们进一步分析了神经细胞分化过程中翻译的uORFs，发现uORFs调控了Wnt信号通路、Hippo信号通路和FGF信号通路中部分的基因表达，表明uORFs参与了神经发育过程的调控。同时，我们还分析了肝癌组织中翻译的uORFs，并且解析了细胞周期相关基因上uORFs的翻译情况。此外，我们还通过实验验证了Hippo信号通路中PPP1CB基因、转录抑制基因DR1、细胞周期调控基因EP300和SMAD4基因上的uORFs抑制了下游CDS的翻译，表明uORFs参与调控Hippo信号通路、转录过程和细胞周期相关基因的表达。这些研究结果为深入探索蛋白翻译的调控过程奠定了基础，同时为细胞分化研究和癌症治疗提供了新思路。

关键词： 玉米   核糖体图谱   翻译组   上游开放阅读框   下游开放阅读框   可变翻译  

摘要： 生命体遗传信息传递主要遵循中心法则。目前对生物体相关功能机制的系统解析多集中于基因组、转录组和蛋白质组水平。翻译组作为一种新兴的重要的遗传信息组学状态,其在动物中已得到广泛认识。然而,玉米作为重要的粮饲兼用作物,其全生育期的翻译组还未得到系统地注释。本研究对玉米B73自交系全生育期的21个组织进行了RNA-seq和Ribo-seq,从而对玉米全生育期的转录组和翻译组进行系统分析。我们构建了玉米翻译组图谱,鉴定了影响翻译水平变异的调控元件,解析了优势转录本在两个组学的变异特点以及可变翻译对玉米发育的可能影响。主要研究结果如下:1.收集了B73全生育期21个组织的高质量转录组和翻译组数据集,为探究玉米全生育期翻译元件及其变异规律提供了可能。全生育期Ribo-seq数据鉴定到94.98%的B73参考基因组Ref Gen＿v4的注释转录本,并发现了9,027个未被注释的新的转录本,完善了玉米全基因组功能元件的注释。2.构建了编码蛋白的mRNA、长链非编码RNA(lncRNA)、环状RNA(circRNA)和微小RNA(miRNA)的翻译组表达变异图谱,发现非编码RNA的组织特异性更强。在翻译组水平构建了包含3,533,777个基因共表达边的网络并划分出2,959个模块,对基因数目≥30的78个模块进行了可视化并分别做了GO富集分析,得到了基因的互作关系以及各个模块的富集途径。3.探究了上游开放阅读框(uORF)、下游开放阅读框(dORF)和多聚腺苷酸(polyA)这三个元件对基因翻译水平变异的可能关系。发现uORF和dORF对转录本编码区(CDS)翻译效率可能有抑制作用,uORF的抑制能力可能比dORF的更强,这种抑制性是由其序列背景确定的。将B73的基因分为原有polyA基因和修饰添加polyA基因两类,发现原有polyA基因更倾向于被翻译。4.探究了转录组和翻译组之间优势转录本的变化规律,发现转录组的每个基因平均表达的转录本个数远高于翻译组。所有组织中有50%左右的优势转录本在两个组学上是不保守的,说明从转录到翻译的过程转录本的表达受到较大的变异调控,并且保守的转录本含有更利于翻译的序列结构。5.探究了不同剪接模式在两个组学上的变化,发现转录组和翻译组剪接事件发生的比例类似。内含子保留是最常见的剪接事件,其次是可变受体,再次是可变供体。比较了茎尖分生组织(SAM)到雌穗分生组织(ear)以及SAM到雄穗分生组织(tassel)之间的可变翻译事件,找到了它们CDS使用差异的基因。SAM与ear的CDS使用差异基因主要富集在胞质途径,而SAM与tassel的CDS使用差异基因主要富集在与翻译相关的途径。本研究收集了B73全生育期的转录组和翻译组数据,并且从表达图谱、变异元件以及可变翻译等方面详细地对翻译组数据进行了分析,为玉米生长发育以及性状变异的分子机制研究提供了重要的数据资源和新的视角。

关键词： 基因表达调控   艺术性   C肽   四级结构   选择性剪接   上游开放阅读框  

摘要： 基因表达的过程通常包括RNA的转录和蛋白质翻译,这个过程受到严格的调控。课堂教学中,教师一般比较注重转录水平及转录后加工等几个基本层面的表达调控。事实上,基因表达调控的方式和策略非常复杂,甚至超乎我们的想象,表现出极高的艺术性。本文拟就基因表达过程中的几种有趣的调节方式来探讨基因表达背后的艺术性,让学生加深对基因表达的理解,敬佩生命的神奇。

关键词： 生长素调控   叶片形态   核糖体突变   翻译   上游开放阅读框  

摘要： 水稻是重要的粮食作物,为世界上一半的人口提供主粮。叶型、穗型、穗粒数和可育分蘖数等农艺性状对水稻产量有重要影响。其中,叶片形态直接影响光合作用、蒸腾作用,最终影响作物产量。叶型是一类复杂的数量性状,由多个基因控制,受细胞大小、数目和非生物因素等影响。近年来已报道了一些窄叶控制基因,但叶片发育的分子机制仍不清楚。因此,克隆更多与叶片宽度相关的基因将为进一步研究叶片发育的分子机制奠定坚实的基础。本研究克隆了一个水稻窄叶基因NARROW-LEAF21(NAL21),该基因编码核糖体蛋白RPS3A。主要结果如下:nal21突变体叶片宽度降低约50%,同时叶长和株高降低,分蘖数增加,根系发育延迟。nal21突变体籽粒长度明显减少,但宽度无变化。nal21突变体中叶片大叶脉和小叶脉数量均明显减少,细胞宽度和沿叶宽方向的细胞数量也明显减少。遗传分析表明,nal21突变体的表型受单隐性基因控制。候选基因定位于3号染色体短臂的一个59-kb区域内。通过图位克隆和测序分析发现,在LOCs03g10340基因的第2外显子和第2内含子之间的剪接位点由G突变为A。互补试验证实LOCs03g10340上的突变是导致nal21突变体表型的原因。以下将该基因命名为NAL21。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和组织学染色分析表明,NAL21基因在茎、叶片、叶鞘和穗等幼嫩组织中均有表达。从NAL21-GFP的转基因互补植株中提取原生质体,观察证实NAL21-GFP蛋白定位于内质网核糖体和细胞质中。通过野生型和nal21突变体对一系列不同浓度的核糖体靶向抗生素的反应表明,nal21的突变改变了突变体解码中心周围的核糖体结构。核糖体谱分析表明,nal21突变体中RPS3A的缺失导致40S核糖体小亚基的生物合成缺陷。通过野生型和nal21突变体对外源生长素的响应试验表明,野生型中主根和幼苗的伸长受到抑制,侧根的形成得到促进,冠根数量增加,而在nal21突变体中,这些反应减弱。生长素响应报告基因DR5:GUS的组织化学染色显示,与野生型相比,nal21突变体在根尖和茎尖表现出较弱的信号,一些早期生长素响应基因,如OsLAA20、OsSAUR13和OsGH3.1的诱导率在nal21突变体中明显下降。以上结果表明,nal21突变表型与生长素相关。通过对野生型和nal21突变体原生质体的瞬时表达检测,发现在nal21突变体中含有多个上游开放阅读框(uORFs)的生长素应答因子基因(ARFs)在翻译水平上受到抑制。体内翻译调控实验表明,由OsARF11和OsARF16启动子驱动的GUS基因表达信号在nal21突变体中较野生型弱。蛋白印迹直接显示,与野生型相比,nal21突变体中的OsARF11和OsARF16蛋白水平较低。OsWOX3A是NAL21介导的翻译调控的另一个靶点。对水稻叶片原生质体的瞬时表达检测表明,nal21突变体中融合OsWOX3A 5’UTR的荧光素酶基因LUC的翻译效率明显低于野生型。与ARF相似,OsWOX3A的翻译调控在体内也降低。OsWOX3A启动子驱动的GUS基因组织化学染色显示,nal21突变体诱导翻译抑制。免疫印迹显示,与野生型相比,nal21突变体中OsWOX3A蛋白水平降低。对NAL21和OsWOX3A在叶片发育过程中的遗传互作研究表明,OsWOX3A位于叶片调控网络中NAL21的下游。此外,对ARFs和OsWOX3A关系的研究发现,Os WOX3A能被ARFs正向调控,同时Os WOX3A也能负调控ARFs。综上所述,RPS3A(NAL21)通过上游开放阅读框介导的生长素响应因子(ARFs)以及叶片侧向扩张关键调节因子Os WOX3A的翻译调控来控制叶片发育。对NAL21在叶片宽度调控中的功能研究增强了我们对水稻叶片发育调控网络的认识。

关键词： uORF   NMD   ZNRD1-AS1   ceRNA   胶质瘤细胞   血管生成拟态  

摘要： 目的:人类中枢神经系统中80%的恶性原发肿瘤是脑胶质瘤,其预后极差。胶质瘤作为一种血管生成实体瘤,其恶性进展依赖于肿瘤组织中血管的生成。尽管临床上胶质瘤的抗血管生成治疗取得了一些进展,但效果仍不理想。限制抗血管生成疗效的原因之一与胶质瘤细胞的血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)的生成相关。上游开放阅读框(upstream open reading frames,uORFs),常见于真核生物基因的5′UTR,在翻译起始中发挥重要作用。研究发现,人类44%-49%的基因中存在uORFs,一些基因中的uORF会激活无意义密码子介导RNA降解(Nonsense-mediated RNA Decay,NMD),进而促进该基因的降解。锌带蛋白基因反义核糖核酸(zinc ribbon domain-containing 1 antisense RNA 1,ZNRD1-AS1)位于6p22.1号染色体上。有证据表明,ZNRD1-AS1在肺癌组织中高表达,并且ZNRD1-AS1和其功能性Cis-eQTL促进肺癌的发生。研究发现ZNRD1-AS1的5′UTR存在编码144个氨基酸序列长度的uORF(ZNRD1-AS1-144aa-uORF,以下简称144aa-uORF)。目前尚未见144aa-uORF及ZNRD1-AS1在胶质瘤中表达并参与功能调控的研究报道。MicroRNAs(miRNAs)由18-25个核苷酸组成,是一类短链非编码RNA分子。miR-449a-5p位于5q11.2染色体上,最新研究表明,miR-499a-5p在脑胶质瘤中发挥抑癌作用,抑制胶质瘤细胞迁移、侵袭,而促进细胞的凋亡。ELF1(E74 like ETS transcription factor 1),属于ETS家族,位于13q13.3-13q14.11区域。ELF1在子宫内膜癌和卵巢癌中高表达。EMI1(early mitotic inhibitor-1)也称为FBXO5(F-box only protein 5),是一种重要的细胞周期调节因子。EMI1在肝细胞癌、乳腺癌、卵巢透明细胞癌组织中高表达。目前,尚无ELF1和EMI1在胶质瘤中的表达与功能的相关研究报道。本研究旨在研究ZNRD1-AS1-144aa-uORF通过ZNRD1-AS1/miR-499a-5p/ELF1/EMI1途径调控胶质瘤细胞血管生成拟态等生物学行为的分子机制。为胶质瘤的发生发展提供新的依据,同时也为胶质瘤的分子靶向治疗提供新靶标。研究方法:以人正常星型胶质细胞、人胶质瘤细胞U87、U251和人胚肾细胞HEK293T作为研究对象。应用Real-time PCR方法检测ZNRD1-AS1、miR-499a-5p、ELF1和EMI1,应用Western blot方法检测144aa-uORF、ELF1和EMI1在正常脑组织、胶质瘤组织、人正常星型胶质细胞、胶质瘤细胞中的表达水平。应用CCK-8、Transwell、管形成实验分别检测细胞的增殖、迁移侵袭、管形成能力的改变。通过细胞转染方法构建并筛选144aa-uORF过表达的细胞系,ZNRD1-AS1、EMI1沉默的细胞系,以及ELF1、miR-499a-5p过表达和表达沉默的细胞系,研究其在胶质瘤细胞的血管生成拟态等恶性生物学行为中的作用。Real-time PCR方法检测ZNRD1-AS1、ELF1的mRNA和miR-499a-5p的表达变化。Western Blot方法检测144aa-uORF、ELF1、EMI1蛋白的表达变化。RIP和RNA pull down实验验证ZNRD1-AS1和UPF1存在结合作用。放线菌素D法检测ZNRD1-AS1半衰期的改变。双荧光素酶基因报告系统检测ZNRD1-AS1与miR-499a-5p、miR-499a-5p与ELF1的靶向结合作用。ChIP实验分析ELF1与EMI1启动子区的直接结合作用。裸鼠移植瘤实验检测144aa-uORF,ZNRD1-AS1及ELF1对裸鼠皮下移植瘤的生长和原位移植瘤裸鼠生存时间的影响。结果:本研究发现144aa-uORF在胶质瘤组织和细胞中低表达,过表达144aa-uORF能够抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及血管生成拟态形成。ZNRD1-AS1在胶质瘤组织和细胞中高表达,沉默ZNRD1-AS1能够抑制U87和U251细胞的增殖、迁移、侵袭及血管生成拟态形成。144aa-uORF通过降低ZNRD1-AS1的稳定性,降低其表达发挥抑癌基因的作用。miR-499a-5p在胶质瘤组织和细胞中低表达,过表达miR-499a-5p能显著抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及血管生成拟态形成。ZNRD1-AS1 3'UTR与miR-499a-5p存在靶向结合作用。ELF

关键词： 上游开放阅读框   TFAP4   LINC00520   miR-520f-3p   胶质瘤  

摘要： 目的:脑胶质瘤是中枢神经系统中的原发性颅脑内肿瘤,并且具有较高的恶性程度。在胶质瘤的治疗上包含了多种方法,例如,放疗、化疗以及手术等治疗方法,但其治疗效果并不理想,复发率仍然很高。上游开放阅读框(uORF)是位于真核mRNA 5'非翻译区(5'UTR)的翻译起始元件,研究发现,uORF在肿瘤中表达异常,并参与各种在肿瘤发生以及发展中的过程。在整个真核生物的基因组中,与没有uORF的基因相比,含有uORF的基因在CDS区域中表现出更低的翻译效率,uORF通过滞留核糖体或与mRNA解离,抑制下游CDS区的翻译起始速率。本研究旨在研究以TFAP4-66aa-uORF为起点的揭示了调控胶质瘤细胞生物学行为的新机制,即TFAP4-66aa-uORF是否通过抑制TFAP4的表达,进而抑制TFAP4/LINC00520/miR-520f-3p反馈环路,抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为。研究方法:人胶质瘤U87和U251细胞以及HEK293T细胞进行培养。Real-time PCR实验检测LINC00520和miR-520f-3p在胶质瘤组织及细胞中的表达。Western blot实验检测66aa-uORF、TFAP4和LASP1在胶质瘤中蛋白的表达水平。运用CCK-8实验法、Transwell实验方法、以及流式细胞仪检测法检测胶质瘤细胞的恶性生物学行。构建TFAP4-66aa-uORF过表达质粒、LINC00520沉默质粒以及miR-520f-3p、TFAP4和LASP1过表达和沉默质粒。RIP实验验证66aa与TFAP4 mRNA存在结合。双荧光素酶基因报告系统检测LINC00520和mi R-520f-3p、mi R-520f-3p和TFAP4的靶向结合作用。ChIP实验表明TFAP4分别与LINC00520、LASP1的启动子区存在结合。裸鼠移植瘤实验检测TFAP4-66aa-uORF、TFAP4和LINC00520对细胞移植瘤体的生长情况和裸鼠生存率的影响。结果:TFAP4-66aa-uORF在胶质瘤组织和细胞中低表达。过表达TFAP4-66aa-uORF能够显著抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,但促进细胞凋亡率。TFAP4在胶质瘤组织和细胞中表达上调,TFAP4的过表达可以显著地增强胶质瘤细胞的恶性生物学行为。66aa通过与TFAP4 mRNA的结合抑制TFAP4的表达。LASP1在胶质瘤组织和细胞中高表达,LASP1过表达后能够有效的促进恶性胶质瘤细胞的生物学行为。LINC00520在胶质瘤中高表达,沉默LINC00520能够显著抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,但促进细胞的凋亡率。miR-520f-3p在胶质瘤中发挥抑癌基因的作用,沉默miR-520f-3p促进胶质瘤细胞的恶性生物行为。LINC00520靶向结合miR-520f-3p,沉默miR-520f-3p能够逆转单独沉默LINC00520对胶质瘤细胞恶性生物学行为的抑制作用。mi R-520f-3p与TFAP4 mRNA3’UTR区域具有特异性结合位点,TFAP4的过表达能够逆转由单独过表达miR-520f-3p对胶质瘤细胞的恶性生物学行为的抑制的作用。沉默LINC00520通过负性调控mi R-520f-3p,进而抑制TFAP4的表达。TFAP4与LINC00520的启动子区存在结合,转录激活其表达,形成TFAP4/LINC00520/miR-520f-3p正反馈环路。TFAP4与LASP1的启动子相结合,转录激活LASP1的表达。miR-520f-3p通过与TFAP4 m RNA 3’UTR区结合抑制LASP1的表达。沉默LINC00520通过调控TFAP4,进而抑制LASP1的表达。沉默LINC00520、TFAP4,过表达TFAP4-66aa-uORF的单独和联合应用抑制裸鼠肿瘤瘤的生长,延长裸鼠生存期。结论:***4-66aa-uORF和miR-520f-3p在胶质瘤组织和细胞中表达下调,TFAP4、LASP1和LINC00520在胶质瘤组织和细胞中高表达。过表达TFAP4-66aa-uORF、miR-520f-3p以及沉默LINC00520、TFAP4、LASP1能够显著的抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡。2.66aa结合TFAP4 mRNA,抑制TFAP4的翻译。***00520结合miR-520f-3p。miR-520f-3p与TFAP4 mRNA的3’UTR区相结合。沉默LINC00520通过结合miR-520f-3p,减弱miR-520f-3p对TFAP4负性调控作用,进而抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为。TFAP4与LASP1和LINC00520的启动子区相结合,转录激活LASP1和LINC00520的表达,形成反馈环

关键词： 上游开放阅读框   uORF   长链非编码RNA   lnc-UCA1   miR-627-5p   胶质瘤  

摘要： 目的:胶质瘤是中枢神经系统内最常见的原发恶性肿瘤,在所有的颅内肿瘤中占有比例高达10%-15%。目前,手术治疗结合放化疗是治疗胶质瘤主要手段,但是由于胶质瘤恶性程度高且极易复发,导致患者的中位生存期为12-15个月。本研究旨在研究NR2C2-5'UTR-47aa-ORF、UCA1,miR-627-5p和NR2C2在调控胶质瘤细胞生物学行为的作用,并探讨其分子机制,即NR2C2-47aa-uORF通过UCA1能否通过miR-627-5p调节转录因子NR2C2并影响下游蛋白SPOCK1的表达调节胶质瘤细胞生物学行为,直接调控NR2C2的表达并以此抑制环路发挥的对胶质瘤细胞生物学行为的调控作用。研究方法:首先对人正常星型胶质细胞(NHA)、U87、U251胶质瘤细胞和人胚肾细胞HEK293T进行细胞培养。应用Real-timePCR实验检测lnc-UCA1、miR-627-5p、NR2C2和GAPDH的表达水平。应用Western blot方法检测NR2C2、SPOCK1、uORF和GAPDH在正常脑组织(NBTs)、胶质瘤组织(GTs)、人正常星型胶质细胞和胶质瘤细胞中的表达。免疫组织化学实验检测47aa-uORF在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达水平。应用Cell Counting Kit-8、Transwell小室、流式细胞仪等仪器和试剂盒分别检测U87和U251胶质瘤细胞的增殖能力、迁移侵袭能力和凋亡能力的变化,通过细胞转染方法构建lnc-UCA1沉默的胶质瘤细胞系,构建miR-627-5p过表达和表达沉默的瞬时转染细胞系、NR2C2过表达和表达沉默的细胞系,构建47aa-uORF过表达细胞系;Real-time PCR实验方法检测lnc-UCA1、miR-627-5p、NR2C2和GAPDH的RNA表达水平,应用Western blot方法检测NR2C2、SPOCK1、47aa-uORF和GAPDH的表达水平。研究其在胶质瘤细胞生物学行为中的作用。双荧光素酶基因报告系统检测lnc-UCA1和miR-627-5p、mi R-627-5p和NR2C2的靶向结合作用。ChIP实验验证NR2C2分别与SPOCK1和lnc-UCA1的启动子区的结合作用。裸鼠肿瘤移植实验检测lnc-UCA1、NR2C2和47aa-uORF对肿瘤的生长以及对荷瘤裸鼠的生存时间的影响。结果:本研究发现lnc-UCA1在胶质瘤组织和胶质瘤细胞中表达增加,发挥促癌基因作用。沉默lnc-UCA1能够导致U87和U251细胞的增殖、迁移和侵袭能力受到抑制但是可以促进细胞发生凋亡。MiR-627-5p在胶质瘤组织和细胞中表达水平较低,起到抑癌基因的作用。过表达miR-627-5p导致胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力受到抑制并可以促进细胞发生凋亡;而沉默mi R-627-5p则导致胶质瘤细胞的增殖能力,迁移和侵袭能力受到促进但抑制了胶质瘤细胞发生凋亡。同时本文首次发现lnc-UCA1可以靶向结合miR-627-5p并调控其表达,沉默lnc-UCA1或过表达miR-627-5p降低NR2C2的表达。NR2C2在胶质瘤组织及细胞中表达水平增加。沉默NR2C2导致U87和U251细胞的增殖能力、迁移和侵袭能力受到抑制并促进胶质瘤细胞的凋亡;而过表达NR2C2导致相反结果:促进U87和U251细胞的增殖、迁移和侵袭但是抑制胶质瘤细胞发生凋亡。SPOCK1在胶质瘤组织和细胞中高表达。MiR-627-5p与NR2C2 mRNA的3,UTR区结合。沉默lnc-UCA1通过增加miR-627-5p的水平,抑制NR2C2蛋白的表达,抑制胶质瘤细胞的生物学行为。转录因子NR2C2通过与SPOCK1的启动子区结合增加SPOCK1的表达。过表达NR2C2促进SPOCK1的表达,沉默NR2C2减少SPOCK1的表达。过表达miR-627-5p通过负性调控NR2C2降低SPOCK1的表达,沉默miR-627-5p通过上调NR2C2促进SPOCK1的表达,以此调控胶质瘤细胞的增殖、迁移侵袭和凋亡。NR2C2能够与lnc-UCA1的启动子区结合,过表达NR2C2能显著上调lnc-UCA1的表达,形成反馈环路调控胶质瘤细胞生物学行为。47aa-uORF在胶质瘤组织和胶质瘤细胞中低表达,过表达47aa-uORF抑制NR2C2的表达,抑制反馈环路产生的生物学功能从而调控胶质瘤生物学行为。沉默UCA1联合过表达47aa-uORF和沉默NR2C2抑制裸鼠移植瘤生长和延长荷瘤裸鼠的生存期。结论:***-UCA1在胶质瘤组织和细胞中高表达,miR-627-5p低表达。沉默lnc-UCA1、过表达miR-627-5p抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力,促进细胞凋亡。***-UCA1特异性结合miR-627

关键词： 斑马鱼   生长激素基因   上游开放阅读框   起始密码子   基因编辑  

摘要： 上游开放阅读框架(uORF)是真核生物中普遍存在的调控元件，并具有广泛的翻译活性。uORF通过隔离核糖体来调节下游编码序列(CDS)的翻译起始率。已有研究证实uORF介导的翻译调控是一种常见的基因表达抑制机制。中国科学家最近在植物中通过CRISPR/Cas9技术高效编辑uORF来操纵mRNA翻译而调控蛋白质水平，最终影响表型。这为植物分子生物学研究及遗传育种提供了新的途径。由于uORF在动植物基因中都普遍存在。在斑马鱼中超过62.6%的基因的上游区域存在至少一个uORF。因此，在鱼类中通过编辑uORF来调控鱼类性状成为可能。改善鱼类生长一直是基因工程的主要目标之一，这一过程主要通过调控脑垂体合成和分泌生长激素(GH)来进行。本文使用CRISPR/Cas9系统对斑马鱼生长激素(GH1)基因的上游开放阅读框的起始密码子(ATGs)进行基因编辑。探讨了在鱼类中通过编辑uORF操控基因的表达。　　主要内容如下：　　1.斑马鱼GH1基因uORF可突变位点筛选　　斑马鱼GH1基因共检索出起始密码子为‘ATG’的uORF序列共21条，选取8条长度小于等于60bp碱基的正向uORF序列作为基因编辑的候选序列。通过比对PAM(NGG)所处位置，找出可能编辑序列包含uORF起始密码子‘ATG’的所有gRNA可能位点。最终筛选出4个基因敲除靶位点，分别位于uORF6和uORF9上。经过比对分析，所有4条候选gRNA预测没有脱靶，并且都位于3号染色体上。　　2.斑马鱼GH1基因uORF定点基因编辑　　我们通过体外转录获得Cas9mRNA与4条候选的gRNA。然后利用显微注射技术对斑马鱼胚胎进行基因编辑。实验共进行了10次，每次显微注射胚胎200-300枚。显微注射后的斑马鱼胚胎发育正常，并能饲养至性成熟。在受精后24小时，收集上述显微注射的斑马鱼胚胎，测序检测基因编辑是否成功。根据测序的峰图和碱基序列来初步获得插入或缺失的信息。结果显示gRNA1引导的基因编辑对uORF起始密码子ATG进行了精准敲除。如GH1-1号、GH1-3号和GH1-4号个体起始密码子完全敲除，GH1-2号个体的‘ATG’被替换为‘ATT’。　　选择gRNA1作为引导链进行基因编辑实验，将基因编辑的斑马鱼胚胎精心培养至3月龄。所有成活的斑马鱼每条单独剪尾鳍后采用碱性裂解法提取DNA。采用PCR方法扩增出目的编辑片段，然后测序分析。一共检测50尾鱼，47条基因编辑成功，敲除效率达到94%。　　3.斑马鱼GH1基因uORF突变体的检测　　首先，通过荧光定量PCR检测mRNA水平。结果显示，在48hpf时，GH1刚刚开始转录，此时，基因编辑实验组和对照组的mRNA水平没有变化。从100hpf往后至15dpf，基因编辑实验组比对照组的GH1转录水平要高。且在5dpf时，实验组GH1的转录水平达到最大值，约为对照组的20倍。综上结果显示，GH1基因的uORF的起始密码子敲除后，可以影响下游的GH1基因的表达。　　其次，通过蛋白免疫印迹技术检测蛋白水平。结果显示，基因编辑后基因型纯合个体(uORF6GH1-AA)的自交后代与对照组AB野生型相比，GH1蛋白水平明显要高。　　最后，检测基因编辑后的个体发育水平。结果显示，不管是GH1基因差异表较大时期的幼体，还是性成熟的个体。在个体发育水平上实验组和野生型斑马鱼并没有区别。说明尽管基因编辑成功，但是没有出现具有表型的个体。　　本论文利用CRISPR/Cas9系统编辑斑马鱼生长激素基因的上游开放阅读框，通过提高蛋白质翻译效率，增加了目标基因蛋白表达的水平。虽然没有明显改善斑马鱼的生长发育，但是也证明了CRISPR/Cas9系统对鱼类基因的上游开放阅读框的编辑是有效的。本研究扩大了CRISPR/Cas9系统对鱼类等动物在基因组上调控区域的编辑来影响基因表达的使用方法，而非传统的突变该基因致使该基因降低或失去功能，为CRISPR/Cas9体系应用于鱼类遗传育种提供了新的思路。