关键词： 斑马鱼   生长激素受体基因   上游开放阅读框   基因编辑   生长发育  

摘要： 上游开放阅读框(uORF)作为真核生物基因5′非翻译区(5′-UTR)的重要组成部分,近年来因其在基因表达调控中的重要作用而备受关注。但是,目前在鱼类中对uORF的研究相对匮乏。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对斑马鱼生长激素受体(ghr)基因中的uORF进行敲除,以探究uORF去除后对ghr表达及斑马鱼生长发育的影响。通过构建ghr-uORF缺失的斑马鱼模型,我们发现敲除uORF后,ghr基因的mRNA和蛋白表达水平升高,且突变体斑马鱼在生长后期表现出生长优势。此外,突变体斑马鱼的肌肉组织发育也发生了变化,肌纤维形态接近圆形,排列较为紧密。这些结果表明,uORF在调控ghr基因表达中发挥了抑制作用,且敲除uORF可能促进斑马鱼的生长和肌肉发育。本研究为理解uORF在动物中的调控机制提供了新的视角,并为鱼类遗传改良提供了新的策略。

关键词： 内部核糖体进入位点   非帽依赖翻译   反式作用因子   G-四链体   上游开放阅读框  

摘要： 内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site,IRES)是一种存在于RNA内部的特殊功能元件,其可在不依赖5’端帽子结构的情况下直接招募核糖体启动蛋白翻译,已被发现与多种细胞过程密切相关。近来,越来越多的证据表明IRES在环形RNA翻译调控中扮演着极其重要的角色,由此IRES引起人们的极大关注。本文针对目前真核细胞中IRES介导的翻译调控机制进行了综述,并对IRES元件相关生物信息学工具进行了总结。

关键词： 5′UTR   上游开放阅读框   内含子   二级结构   基因表达调控  

摘要： 植物5′非翻译区(untranslated region,UTR)存在众多的调控元件,如内部核糖体进入位点、上游开放阅读框、内含子及各种二级结构,在基因表达调控中发挥重要作用。5′UTR还能够通过保留、删除或突变调控元件产生多个mRNA变体,从而影响翻译效率。本文对植物5′UTR中涉及的各种调控元件及二级结构的作用机制进行了总结归纳,期望较为全面展示植物5′UTR的结构和功能,并为研究植物5′UTR的调控机制提供参考。

关键词： 肝内胆管癌   非编码RNA   MP48   预后   PI3K/AKT通路   CD34  

摘要： 一、研究背景及目的 肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是仅次于肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的第二大原发性肝脏恶性肿瘤,在全部肝脏肿瘤中约占20%,其发病率在过去的几十年间持续增长。ICC发病诱因多样,常见的危险因素包括肝内胆管结石、原发性硬化性胆管炎、病毒性肝炎、肝硬化、寄生虫感染、非酒精性脂肪肝等。ICC恶性程度极高,绝大多数患者在诊断时肿瘤已经进展到中晚期,失去了手术机会。手术切除是ICC患者最主要的根治性方式,但患者术后的5年生存率也不超过35%,预后极差。 核糖体图谱(ribosome profiling,Ribo-Seq)基于高通量测序来检测分析核糖体结合的短RNA片段,是翻译组学研究的主要方法之一。传统观点认为非编码RNA(non-coding RNA,nc RNA)通常不具备编码能力,翻译组学的深入研究使越来越多的nc RNA编码产物被发掘出来。nc RNA中可能包含长度通常小于300nt的小开放阅读框(short open reading frame,s ORF),具有翻译长度通常小于100个氨基酸的小肽的潜能。这些小肽参与调控人类的多种生理和病理过程,尤其是在癌症的发生发展中发挥了重要的作用。一些小肽已被证实与患者的治疗反应及预后相关,可能作为癌症治疗的潜在靶点和预后生物标志物。 据了解,ICC相关小肽的研究尚未有过报道。本研究基于Ribo-Seq技术挖掘ICC相关的小肽,探究其与患者总生存期(overall survival,OS)和无复发生存期(recurrence-free survival,RFS)的相关性,并对其调控ICC进展的功能和分子机制进行研究。 二、研究方法 1.基于Ribo-Seq测序,明确ICC中编码基因的翻译丰度,并进行差异分析,结合转录组测序,计算各个基因的翻译效率,探索ICC的翻译特征。 2.利用ORFscore,核糖体释放评分(ribosome release score,RRS)等多种s ORF编码能力打分系统,对ICC癌和癌旁组织中差异表达的s ORF进行多维度筛选,明确具有编码潜能的目标s ORF及其编码小肽。 3.制备MP48小肽的抗体,验证其在不同ICC细胞和组织中的内源性表达情况。 4.通过免疫组化(immunohistochemistry,IHC)对90位ICC患者的MP48表达量进行评分,分为高表达组和低表达组,通过Kaplan-Meier生存分析和Cox回归分析探究MP48的表达水平与ICC患者临床预后的相关性。 5.构建稳定低表达和高表达MP48的ICC细胞株,通过体外细胞功能实验(克隆形成、CCK-8、Transwell实验)探究MP48对ICC细胞的增殖和侵袭能力的影响。 6.建立BALB/c裸鼠皮下成瘤模型和肺转移模型,探索MP48在体内对ICC生长和转移能力的影响。 7.对稳定低表达MP48的ICC细胞株进行转录组测序,通过差异分析明确显著差异表达的基因,并对差异基因进行GO和KEGG富集分析,探索MP48可能影响的生物学过程和关键分子。 8.对于富集分析得到的关键通路,采用western blotting实验验证其表达情况,对于可能存在相互作用的关键分子,采用CO-IP实验验证其与MP48的相互作用。 三、研究结果 本研究的第一个部分是对9对ICC癌和癌旁组织进行Ribo-seq和转录组测序分析。在翻译层面共鉴定出12124个显著差异表达的基因,远高于转录层面差异表达的基因数量,提示ICC发展过程存在极其复杂的翻译调控。ICC癌和癌旁组织在整体的翻译效率上没有显著差异,且编码基因的翻译效率与转录丰度没有显著相关性。对癌和癌旁组织在翻译层面、翻译-转录同向变化层面,以及翻译效率层面显著差异表达的基因分别进行富集分析,结果在免疫、炎症、代谢等生物学过程中出现了显著富集,表明ICC发生发展过程中,这些生物学过程出现了明显的改变。之后,基于Ribo-seq检索非编码区的s ORF,利用ORFscore,RRS等工具结合差异分析从多个维度对s ORF的编码潜能进行打分,并不断缩小范围,最终从15个最具有编码潜能的u ORF中选择差异倍数最高的SOX4-u ORF,其可能编码一个长度为48个氨基酸的小肽,我们将其命名为MP48。 在第二个部分中,我们首先制备了MP48的单克隆抗体,在ICC细胞系RBE,HCCC-9810,QBC939,Hu CCT1以及正常肝内胆管上皮HIBEC中通过western blotting实验验证了MP48的表达情况,并在12对ICC的癌和癌旁组织中进行了验证,结果发现,MP48在ICC细胞系和组织中内源性表达,在H

关键词： uORF   翻译调控   核糖体   生长发育   作物育种  

摘要： 上游开放阅读框(upstream open reading frame, uORF)是一类能够精确控制蛋白质翻译的mRNA元件,位于mRNA的5'端前导区,主要通过抑制翻译起始来调节下游主体开放阅读框(main open reading frame, mORF)的翻译。目前对植物uORF的预测和鉴定主要集中于生物信息学和翻译组学鉴定技术。植物uORF广泛参与调节生长发育、营养代谢、抗病免疫等多个生命活动过程。本文对植物uORF的分类、功能机制、预测和鉴定方法、植物规避uORF的方式以及植物uORF的工程应用等进行综述归纳,旨在更系统和深入地理解植物uORF的功能与机制,并为uORF应用于作物分子育种工作提供参考。

关键词： 鸡   PPARγ基因   5’非翻译区   上游开放阅读框   翻译抑制  

摘要： 前期研究发现,鸡PPARγ基因转录本5(c PPARγ5)的5’非翻译区(5’untranslated region,5’UTR)存在两个上游开放阅读框(uORF1和uORF2)。为揭示这两个uORFs在鸡PPARγ基因表达转录后调控作用,试验使用报告基因、定点突变、q RT-PCR和Western blot等技术,分析两个uORFs对报告基因活性及PPARγmRNA和蛋白表达的影响。结果表明,与野生型相比,uORF1和uORF2分别突变和同时突变均显著促进报告基因活性及PPARγm RNA和蛋白表达(P<0.05)。mRNA稳定性分析发现,两个uORFs突变对报告基因mRNA稳定性无显著影响。启动子活性分析发现,c PPARγ的5’UTR区具有启动子活性。研究结果表明,cPPARγ5的两个u ORFs抑制其翻译。

关键词： 核糖体图谱   翻译调控   上游开放阅读框  

摘要： 随着高通量测序技术的持续发展和进步,开发出很多新颖的测序技术,为诸多悬而未决的生物学难题提供了解决方案。其中,核糖体图谱技术能够在全基因组水平和单核苷酸分辨率上监控细胞内的翻译事件,填补了转录组学和蛋白质组学研究之间的空隙。核糖体图谱技术不仅能够鉴定处于翻译状态的RNA分子,还能够精确定位RNA分子上正在翻译的核苷酸,进而准确描绘RNA分子上的开放阅读框。此外,结合转录组测序数据,核糖体图谱技术还可以确定每个转录本上的核糖体数量,从而计算每个转录本的翻译效率。目前,核糖体图谱技术已成功应用于动物、植物和微生物等研究领域,加深了人们对翻译调控机制的认识。然而,由于植物细胞和组织的特性,核糖体图谱技术在植物学研究中的应用仍然存在局限。该文综述了核糖体图谱技术的实验原理,以及在植物学研究中的相关进展。

关键词： 放疗皮肤辐射损伤   桥粒   PKP1   细胞压力应激   选择性翻译   上游开放阅读框  

摘要： 放疗在杀伤肿瘤组织的同时会损伤正常组织,从而造成如皮肤损伤等副作用。然而市面上多种防护剂对于放疗区域的皮肤防护效果并不好,因此对于电离辐射(Ionizing radiation,IR)引起的皮肤辐射损伤(radiation skin damage)的机制研究就显得尤为重要。我们实验室前期的工作发现细胞骨架角蛋白K17在大鼠/小鼠脚部皮肤辐射损伤后会先下调后显著上调,E-cadherin/β-catenin介导的粘附连接被Src/Abl激酶磷酸化而降解。然而电离辐射是否影响桥粒连接尚不明确。 小鼠背部皮肤和人永久上皮细胞(Ha Ca T)的磷酸化蛋白质组均显示:PKP1(Plakophilin 1,桥粒斑菲素蛋白1)的磷酸化在电离辐射后上升。我们验证了其磷酸化的上升,并且PKP1在IR作用下磷酸化后即从桥粒连接释放到细胞质。接着我们用活细胞成像技术观察GFP-PKP1在辐照后的动态反应,检测到电离辐射、H2O2以及生长因子EGF处理GFP-PKP1有类似的变化。而在电离辐射前加一些通路抑制剂处理,显示MAPK通路抑制剂有抑制PKP1脱离桥粒的效果。5Gy辐照后4h的WT/PKP1 KO Ha Ca T蛋白质组相比辐照前下调蛋白均富集在核糖体通路。WT上调蛋白富集在细胞信号转导以及氧化还原反应,而PKP1 KO上调蛋白富集在炎症通路,WT上调蛋白在照射的PKP1 KO细胞系无差异变化。转录组数据显示,WT差异表达蛋白的m RNA水平没有显著变化。IR上调蛋白中的METTL16/ADK/MED9/STAT1在PKP1 KO细胞上升受阻,m RNA在两细胞系均不受IR调节。免疫沉淀结合质谱技术显示PKP1与翻译相关蛋白的结合,其中肽段数较多的是蛋白质翻译延伸因子EEF1A1。PKP1与EEF1A1在IR后相互作用并共定位。通过离心分离出核糖体,发现IR增加了PKP1蛋白在核糖体上的结合。并且相较于PKP1 KO细胞,编码WT细胞上调蛋白的基因的上游开放阅读框u ORF(upstream open reading frame)含量有所增加,这对于应激状态下的选择性翻译十分重要。 综上所述,本研究揭示了桥粒组成蛋白PKP1对于电离辐射十分敏感。电离辐射诱导的MAPK信号激活PKP1磷酸化对于调节PKP1定位及功能的重要性,细胞质PKP1通过结合EEF1A1参与电离辐射下的翻译调节。本研究加深了对辐射损伤皮肤机制及桥粒电离辐射敏感性以及应激下翻译调节的认识,为缓解和治疗辐射损伤提供了新思路。

关键词： 乙肝病毒   nt1846突变   上游开放阅读框   Gibson组装   质粒构建  

摘要： 乙肝病毒作为逆转录病毒,容易发生基因突变并影响肝病进展。近年有研究发现B/C基因型HBV A1846T突变与慢加急性肝衰竭的发生独立相关,原因可能与nt1846突变引起HBV核心启动子上游开放阅读框起始密码子消除有关,如明确其具体机制,或许可以更科学地预测肝病进展和指导治疗。由于HBV特殊的复制和转录形式,体外进行HBV病毒学研究常常需要构建HBV 2.0质粒用于基因表达,而传统方法构建HBV 2.0质粒步骤繁琐,因此,开辟一种更简便的HBV 2.0质粒构建途径十分有意义。注意到近年来Gibson组装技术在分子生物学领域的广泛应用,本研究目的:运用Gibson组装技术构建HBV 2.0表达质粒来探究nt1846突变对HBV基因表型的影响。方法:从一名HBV感染者血清中提取出野生型HBV并将其克隆于pGEMTEasy载体,根据野生型HBV DNA测序结果设计定点突变引物,通过常规点突变得到A1846G(非A1846T)突变型质粒,创新性地运用Gibson组装(无缝克隆)技术构建了野生型和A1846G突变型pUC18-HBV Sph Ⅰ双体质粒并将其转染HepG2细胞,最终通过WB和qPCR来对比两组蛋白表达和HBV DNA复制水平的差异。实验结果:与野生组相比,A1846G突变组的HBcAg表达明显增加,HBV DNA复制水平增高。结论:***组装(无缝克隆)技术可以用来构建pUC18-HBV SphⅠ双体表达质粒并且比传统限制性酶切方法更加简单;2.B/C型HBV nt1846突变很可能通过消除CO-ORF而解除了 CO-ORF对下游C-ORF的抑制作用,引起C-ORF编码HBcAg增多,引起免疫反应增强,最终导致肝损害加重甚至慢加急性肝衰竭(ACLF)的发生。

关键词： 5'UTR   内部核糖体进入位点   上游开放阅读框   上游起始密码子   二级结构   5'UTR内含子  

摘要： 5'非翻译区(5'Untranslated Region,5'UTR)在基因表达调控中发挥重要作用,其不仅在翻译水平调控基因表达,还参与真核基因转录、转录后加工、成熟RNA运输等水平的调控。5'UTR介导的基因表达与自身存在的相关调控元件有关,主要包括内部核糖体进入位点、5'UTR二级结构、上游开放阅读框、上游起始密码子以及5'UTR内含子等元件,5'UTR异常可引起基因表达异常并引发疾病。本文综述了5'UTR调控基因表达的研究进展,以期为今后5'UTR的作用机制及相关疾病的诊断与治疗提供新的方向和理论依据。