关键词： VSP-17   三阴性乳腺癌   PPARγ   AMPK   EMT过程  

摘要： 目的:探讨新型PPARγ激动剂VSP-17对PPARγ信号通路的激活作用和对三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer,TNBC）转移的抑制作用及其潜在的作用机制。方法:（1）使用PBS重悬MDA-MB-231细胞,并将细胞悬液注射至雌性裸小鼠左右乳房的脂肪垫中,建立MDA-MB-231异种移植模型,两周后分别口服给药VSP-17（20 mg/kg）或罗格列酮（20 mg/kg）,七周后解剖小鼠并提取原位肿瘤的RNA,同时提取经过VSP-17（1,3,10μM）或ROS（1μM）处理后的MDA-MB-231细胞中的RNA,使用RT-q PCR分别对原位肿瘤和细胞中的PPARγ靶基因CD36的表达进行分析;荧光素酶报告基因检测VSP-17（10μM）或ROS（1μM）对PPARγ报告基因活性的影响;TR-FRET竞争性结合测试VSP-17或ROS与PPARγ的结合能力（2）以人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞为研究对象,使用VSP-17（0.01,0.03,0.1,0.3,1,3,10,30,100μM）培养细胞24 h后,加入MTT试剂检测细胞活性并筛选出合适的给药浓度;根据MTT试验的结果,使用VSP-17（1,3,10μM）或ROS（1μM）处理MDA-MB-231细胞24 h后使用RT-q PCR法检测细胞中肿瘤转移相关因子:BRMS1、E-cadherin、CXCL-12、MMP9、Orai1、Stim1、TGF-β和VEGF的表达;细胞迁移和侵袭试验用于检测VSP-17抑制MDAMB-231细胞转移的能力。以MDA-MB-231异种移植模型为研究对象,提取原位肿瘤的RNA并对相关因子的表达进行测定;对肝脏进行H＆E染色,分析VSP-17（20 mg/kg）和ROS（20 mg/kg）对肿瘤细胞肝脏转移的影响。（3）以人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞和MDA-MB-453细胞为研究对象,使用Western blot检测VSP-17（1,3,10μM）对三阴性乳腺癌细胞系中腺苷酸活化蛋白激酶AMPK信号通路的激活作用;使用AMPK抑制剂compound C（1μM）或si AMPK和/或VSP-17（10μM）处理MDA-MB-231细胞和MDAMB-453细胞,细胞迁移和侵袭试验检测AMPK信号通路对VSP-17抗迁移和侵袭作用的影响;Western blot和免疫荧光试验用于检测AMPK信号通路对VSP-17抑制EMT过程的影响;RT-q PCR用于测定AMPK信号通路抑制后,VSP-17对MDA-MB-231细胞和MDA-MB-453细胞中E-cadherin m RNA表达的影响。使用PPARγ抑制剂GW9662（1μM）或si PPARγ和/或VSP-17（10μM）处理MDA-MB-231细胞和MDA-MB-453细胞,使用Western blot检测PPARγ对VSP-17对激活AMPK信号通路的影响;另外使用迁移和侵袭试验、Western blot、RT-q PCR和免疫荧光试验检测PPARγ信号通路对VSP-17抗转移作用的影响。结果:（1）VSP-17升高了MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231异种移植小鼠原位肿瘤中CD36的m RNA表达。（2）VSP-17升高了PPARγ报告基因的活性。（3）VSP-17与PPARγ的结合动力学抑制常数（Kinetic inhibition constant,Ki）为0.27。（4）VSP-17升高了MDAMB-231异种移植小鼠原位肿瘤中E-cadherin的m RNA表达。（5）VSP-17抑制了MDA-MB-231异种移植小鼠肿瘤细胞的肝转移。（6）VSP-17抑制了MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭。（7）VSP-17升高了MDA-MB-231细胞中E-cadherin的m RNA表达。（8）VSP-17升高了MDA-MB-231细胞和MDA-MB-453细胞中AMPK的磷酸化水平。（9）AMPK信号通路的抑制逆转了VSP-17对MDA-MB-231细胞和MDA-MB-453细胞迁移和侵袭的抑制作用。（10）AMPK信号通路的抑制逆转了VSP-17对MDA-MB-231细胞和MDA-MB-453细胞中EMT过程的影响。（11）PPARγ信号通路的抑制逆转了VSP-17升高MDA-MB-231细胞和MDA-MB-453细胞中AMPK磷酸化水平的作用。（12）PPARγ信号通路的抑制逆转了VSP-17对MDA-MB-231细胞和MDA-MB-453细胞迁移和侵袭的抑制作用。（13）PPARγ信号通路的抑制逆转了VSP-17对MDA-MB-231细胞和MDA-MB-453细胞中EMT过程的影响。结论:（1）VSP-1

关键词： 三阴性乳腺癌   木犀草素   上皮间质转化   Hippo-YAP/TAZ信号通路  

摘要： 目的:三阴性乳腺癌(TNBC)是所有乳腺癌中恶性程度最高的一种亚型,现有的内分泌治疗和靶向治疗对TNBC均无疗效,因此急需开发新的的治疗靶点和药物。Hippo-YAP/TAZ信号通路的异常激活与TNBC的发展和转移密切相关,我们前期研究从天然化合物文库中筛选YAP/TAZ抑制剂,发现木犀草素可以有效抑制YAP/TAZ的转录活性,本课题拟进一步探索木犀草素在TNBC细胞中抑制YAP/TAZ活性的作用与机制,为基于Hippo-YAP/TAZ通路抗三阴性乳腺癌的细胞增殖与转移的天然药物的研发提供参考。方法:(1)筛选调控TNBC细胞中Hippo-YAP/TAZ信号通路的小分子化合物:将MDA-MB-231细胞作为细胞模型,通过荧光素酶报告基因检测法筛选天然化合物文库,并发掘YAP/TAZ的潜在的抑制剂;利用RT-qPCR检测木犀草素对TNBC细胞中YAP/TAZ下游的两个基因CTGF和CYR61的mRNA水平的影响。(2)木犀草素对TNBC细胞的增殖抑制的检测方法:用SRB检测木犀草素(0-80 μM)对MCF10A、MDA-MB-231、4T1细胞的抑制率,在药物作用24h,48h,72h后测定并计算出药物半数抑制浓度;用细胞克隆形成法检测不同浓度的木犀草素作用于TNBC细胞,14天后计数不同药物浓度作用下的细胞克隆。(3)研究木犀草素抑制TNBC细胞增殖的作用机制:用免疫荧光染色观察木犀草素对TNBC细胞中YAP/TAZ的核定位的影响;通过RT-qPCR和WB检测木犀草素对TNBC细胞中Hippo-YAP/TAZ信号通路中主要分子的mRNA水平和蛋白水平的作用;分别构建MDA-MB-231细胞的过高表达TAZS89A细胞系和敲低TAZ细胞系,测定构建成功后的细胞系对木犀草素的敏感性;通过WB验证蛋白酶体抑制剂MG132逆转木犀草素对YAP/TAZ的抑制作用。(4)研究木犀草素抑制TNBC细胞的上皮间质转化(EMT)与迁移的作用机制:通过细胞划痕实验和Transwell实验检测木犀草素对TNBC细胞迁移能力的影响;利用RT-qPCR和WB检测木犀草素对TNBC细胞和过表达TAZS89A细胞中EMT相关标志物的mRNA水平和蛋白水平的影响。(5)验证木犀草素抑制TNBC细胞的体内增殖作用:将4T1细胞接种于裸鼠腋下,成瘤后随机分组,通过腹腔注射木犀草素干预实验组裸鼠移植瘤的生长,实验期测量小鼠体重和瘤体大小;用免疫组化检测木犀草素对小鼠移植瘤的YAP和TAZ的表达水平的影响。结果:(1)木犀草素是天然来源的YAP/TAZ抑制剂:我们利用荧光素酶报告基因检测了天然化合物文库中的木犀草素是YAP/TAZ潜在抑制剂;通过RT-qPCR检测出木犀草素可有效抑制TNBC细胞中YAP/TAZ下游的两个基因CTGF和CYR61的mRNA表达水平。(2)木犀草素可有效抑制TNBC细胞的增殖能力:用SRB检测木犀草素(0-80 μM)在MCF10A、MDA-MB-231、4T1细胞中24h,48h,72h的IC50值;相对于正常乳腺上皮细胞MCF10A,TNBC细胞对木犀草素比较敏感。木犀草素对TNBC细胞的抑制作用且与药物浓度和作用时间呈正相关;细胞克隆形成实验显示木犀草素能有效抑制TNBC细胞的克隆形成。(3)YAP/TAZ介导了木犀草素对TNBC细胞生长的抑制作用:木犀草素可降低TNBC细胞中YAP/TAZ的总体水平和核定位,并下调了 Hippo-YAP/TAZ下游分子的mRNA水平和蛋白水平。木犀草素对Hippo信号通路上游激酶无明显调控。MDA-MB-231高表达TAZS89A后出现药物抵抗,而MDA-MB-231细胞敲低TAZ后对木犀草素更敏感。木犀草素上调YAP/TAZ的磷酸化并促进pYAP/pTAZ以蛋白酶体途径降解。(4)木犀草素抑制TNBC细胞的EMT和迁移:细胞划痕实验和Transwell实验显示木犀草素减弱了 TNBC细胞迁移能力;RT-qPCR和WB证实了木犀草素通过下调TNBC细胞和MCF10A-TAZS89A细胞中间充质标志物的表达和上调上皮细胞标志物水平,从而实现了对TNBC细胞EMT的抑制和逆转。(5)木犀草素抑制TNBC细胞移植瘤的生长并降低YAP/TAZ的活性:木犀草素作用于实验组裸鼠18天后,实验组裸鼠移植瘤大小和重量均显著小于对照组,免疫组化结果显示实验组裸鼠移植瘤中YAP/TAZ的表达水平均明显低于对照组。结论:木犀草素可以降低YAP/TAZ的转录活性,并有效抑制TNBC的细胞增殖、EMT和迁移能力;木犀草素诱导YAP/TAZ磷酸化并促进pYAP/pTAZ以蛋白酶体途径降解;木犀草素可以抑制TNBC细胞移植瘤生长,并降低肿瘤组织中YAP/TAZ的蛋白表达水平。本文揭示了木犀草素靶向Hippo-YAP/TAZ

关键词： 三阴性乳腺癌   Antimycin   核损伤   K-Ras  

摘要： 背景:乳腺癌已成为全球最常见的癌症,其中三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是恶性程度最高的一种分型。由于TNBC缺少常用激素治疗的靶标,且具有异质性高、易转移、易耐药等特点,急需寻找明确有效的靶向治疗方法。天然化合物一直是抗癌小分子药物的重要来源,抗霉素(Antimycin)家族是由放线菌中分离得到的一类重要天然小分子化合物,近年来越来越多的研究开始关注它的抗肿瘤效果。研究发现Antimycin类化合物可以通过多种方式产生抗肿瘤活性,但目前缺少其对三阴性乳腺癌的作用效果及作用机制研究。有研究表明含3-甲酰基水杨酸基团的Antimycin类化合物可能通过抑制K-Ras膜定位而发挥抗肿瘤活性。Ras蛋白在维持细胞正常生长增殖等重要生理功能中起重要作用,Ras异常高表达可显著提升TNBC的耐药性,最常发生突变的Ras是K-Ras亚型。本实验室前期实验中筛选出三种抗霉素化合物,分别命名为Antimycin-1、Antimycin-2、Antimycin-3,它们均特异性的显著抑制三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468和MDA-MB-453)活力,其中尤以含3-甲酰基水杨酸基团的Antimycin-1的抑制作用最强,但具体药物作用机制仍需进一步探究。目的:本课题旨在明确前期实验中筛选得到的三种Antimycin类化合物对TNBC细胞的特异性杀伤作用,分析抑制作用最强的Antimycin-1对TNBC细胞功能的影响,并探索Antimycin-1抑制TNBC细胞的作用机制及其动物安全性。方法:1、通过CCK8检测三种Antimycin类药物对多种肿瘤细胞的抑制效果,观察药物对细胞形态和细胞骨架的影响,通过克隆形成实验检测和划痕实验分别检测低浓度的Antimycin-1对三阴性乳腺癌细胞克隆生成能力及迁移能力的影响。2、通过流式细胞术检测Antimycin-1处理三种三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453)和正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)后,各细胞凋亡或坏死的比例及细胞周期时相的变化,通过q PCR检测细胞周期相关关键蛋白的基因水平变化。3、用20 nmol·L的Antimycin-1处理三种三阴性乳腺癌细胞后,使用流式细胞术检测细胞ROS水平的变化,使用免疫荧光显微镜观察细胞线粒体膜电位水平变化,并通过激光共聚焦显微镜观察细胞核形态变化及DNA损伤情况。4、通过蛋白质免疫印迹实验检测Antimycin-1处理三阴性乳腺癌细胞后,细胞中Akt、Mek、Erk总蛋白及其相应蛋白磷酸化水平和凋亡相关蛋白表达水平的变化。5、构建稳定表达外源e GFP-KRas蛋白的三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞株,观察Antimycin-1处理后K-Ras定位变化。6、给昆明小鼠隔日腹腔注射不同剂量的Antimycin-1,观察小鼠存活情况。分别使用Antimycin-1进行高剂量单次和低剂量多次的方式处理小鼠,取心、肝、脾、肺、肾组织并进行H&E染色,观察小鼠重要脏器损伤情况。7、所有实验重复三次,用Graph Prism8统计软件分析数据,使用Student’s t检验分析两组间差异,使用One-way ANOVA分析多组间差异,P<0.05时差异具有统计学意义。结果:1、Antimycin类药物特异性抑制三阴性乳腺癌细胞的活力:三种Antimycin类药物均特异性的显著抑制三阴性乳腺癌细胞增殖,其中Antimycin-1的抑制效果最强,对三种三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468、MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞的IC50(半数抑制浓度)均达到纳摩尔级别。Antimycin-1处理细胞后,对照细胞形态无明显改变,但三阴性乳腺癌细胞显著皱缩,细胞骨架也遭到明显破坏。同时,5 nmol·L的Antimycin-1即可显著抑制三阴性乳腺癌细胞的克隆生长能力与迁移能力。2、Antimycin-1影响三阴性乳腺癌细胞多种细胞功能:纳摩尔级浓度的Antimycin-1即可在短时间内引起三阴性乳腺癌细胞大量死亡,但对其细胞周期的影响不大。20 nmol·L的Antimycin-1处理4 h内,三阴性乳腺癌细胞已经出现明显的DNA损伤。同时Antimycin-1处理三阴性乳腺癌细胞24 h内其ROS水平保持不变或略有下降,处理20 h后线粒体膜电位才开始下降。3、Antimycin-1抑制三阴性乳腺癌细胞中K-Ras膜定位并降低K-Ras信号下游关键蛋白的磷酸化水平:20 nmol·L的Antimycin-1处理5 h内即可显著降低三阴性乳腺癌中K-Ras下游Akt、Mek、Erk蛋白的磷酸化水平。正常情况下K-Ras稳定分布于细胞膜上,

关键词： 熊果酸   三阴性乳腺癌   抗肿瘤   网络药理学   分子对接  

摘要： 目的:本研究运用系统生物信息学工具与网络药理学分析方法,以阐释熊果酸(Ursolic acid,UA)干预三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)的潜在分子机制及关键靶点,并通过体外实验进一步验证有效性,为UA作为中药天然化合物治疗TNBC提供药理学证据及新药研发指导。方法:***对TNBC细胞系功能学影响:通过CCK8法分别测试不同药物浓度下的UA干预TNBC细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468后细胞活力的变化。伤口愈合实验和体外侵袭实验分别检测不同浓度UA对MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系迁移能力及侵袭能力产生的影响。流式细胞术检测被用来评估在接受不同浓度UA处理后MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞凋亡情况。***微阵列基因芯片获取和处理:运用R语言在GEO数据库下载TNBC相关芯片数据,并借助Rstudio中的“affy”软件包进行标准化处理。随后,使用“limma”语言包进行差异表达分析(differentially expressed genes analysis,DEGs)。DAVID数据库被用来对DEGs基因进行富集分析。同时,DEGs基因被导入STRING在线工具以构建蛋白质相互作用网络,最后,通过拓扑分析获得TNBC的候选靶点基因。3.分子对接,预后价值评估及GSEA富集分析:将本研究获得的TNBC候选差异基因与UA小分子化合物进行分子对接,通过对接打分,选择具有最高结合度的关键靶基因作为研究对象,并进行预后价值分析及GSEA富集分析。***对TNBC关键靶点的影响:通过实时荧光定量PCR及Western Blot分别检测不同浓度UA对TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468后关键靶点在转录和蛋白表达水平的影响。结果:1.本研究的细胞功能学实验显示,TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468经过UA处理后细胞增殖受到抑制,且具有时间和浓度依赖性(P<0.05);细胞伤口愈合实验和侵袭实验显示,UA可以显著TNBC细胞的迁移及侵袭能力(P<0.05);流式细胞术检测结果表明,经过UA处理后,TNBC细胞的凋亡百分比呈浓度依赖的方式显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.运用R语言在GEO数据库中筛选获得2张TNBC相关基因芯片GSE45827和GSE65194,整合并去除批次效应后进行差异表达分析,得到724个DEGs基因。根据靶点连通度(degree)最高等级进行的综合排名的拓扑分析结果,确定前15个DEGs基因作为进一步分析的候选靶基因,包括CDK1、CCNA2、CDC20、CCNB1、CCNB2、MAD2L1、AURKB、TOP2A、BUB1B、KIF11、PLK1、CDCA8、NCAPG、KIF2C和UBE2C。3.分子对接表明,在15个候选靶点与UA小分子化合物的对接结果中,PLK1(对接得分:5.9357)和CCNB1(对接得分:5.2448)与UA的结合度最佳,故PLK1和CCNB1被确定为关键靶点。预后分析显示,PLK1和CCNB1的高表达与患者不良预后呈负相关(P<0.05)。同时,GSEA富集结果显示,PLK1和CCNB1共同显著富集于P53信号通路,其中PLK1和CCNB1可能通过P53基因调控。因此,PLK1,CCNB1和P53被作为后续实验验证的核心靶点。4.实时荧光定量PCR和Western Blot检测显示,相较于空白对照组,经过UA处理后,TNBC细胞中PLK1和CCNB1的mRNA和蛋白表达均呈浓度依赖性降低,P53的mRNA和蛋白表达随着浓度增加而上调。差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:本研究表明,UA作为中药天然化合物可以显著抑制TNBC细胞的增殖,迁移,侵袭并诱导细胞凋亡。其中UA干预TNBC的潜在分子机制可能涉及调控P53来影响PLK1和CCNB1的表达,从而在TNBC治疗中发挥关键作用。这些发现从系统的角度阐释了UA治疗TNBC的分子和药理机制,为UA通过多靶点干预TNBC提供了有力的证据。

关键词： 白皮杉醇   三阴性乳腺癌   抗肿瘤作用   抗血管生成   Wnt/β-Catenin信号通路  

摘要： 目的:探究白皮杉醇（Piceatannol,PIC）体外对三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及其抗血管生成作用,并基于Wnt/β-Catenin信号通路通过体内外实验探讨PIC对TNBC抗肿瘤作用的机制研究。 方法:通过MTT实验考察PIC在不同浓度（0、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160）μM对TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468增殖的影响及经VEGF165诱导的人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖能力的影响;利用流式细胞术检测PIC对TNBC细胞周期和凋亡的影响;通过transwell invasion和划痕损伤修复实验观察PIC对MDA-MB-231、MDA-MB-468及VEGF165诱导的HUVEC细胞侵袭和迁移能力的影响;通过小管生成和大鼠主动脉环实验考察PIC对VEGF165诱导的HUVEC细胞小管生成和微血管出芽生成能力的影响;利用Western blot和免疫荧光实验探究PIC体外抗肿瘤作用机制;通过建立荷人乳腺癌（MDA-MB-231）裸鼠模型,利用免疫组化和免疫荧光实验进一步验证PIC抗肿瘤及抗血管生成作用及机制。 结果:PIC可有效抑制TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的增殖,其IC50分别为:74.98μM和26.36μM,并且能够明显的抑制VEGF165诱导的HUVEC细胞的增殖;与空白对照组进行比较,PIC能将MDA-MB-231细胞阻滞在G2/M期,MDA-MB-468细胞阻滞在G0/G1期,同时促进TNBC细胞的凋亡,在PIC高浓度作用48 h后,MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的凋亡率分别为24.40%和49.87%;PIC抑制TNBC和VEGF165诱导的HUVEC细胞的侵袭与迁移能力及VEGF165诱导的HUVEC细胞的小管形成和大鼠主动脉环出芽的微血管生成能力,PIC高浓度作用48 h,MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞和VEGF165诱导的HUVEC细胞的侵袭能力的抑制率分别为:90.33%、60.33%和86.33%;Western blot实验结果表明,PIC能明显抑制TNBC细胞增殖、凋亡相关蛋白Akt、Erk1/2、p38MAPK蛋白磷酸化及Bcl-2蛋白表达,促进Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达,抑制VEGF165诱导的HUVEC细胞中血管生成相关蛋白FAK、VECFR2蛋白磷酸化和VEGFA蛋白表达,减少Wnt/β-Catenin通路相关蛋白CD44、C-Myc、Survivin、VEGFA和β-Catenin蛋白表达,细胞免疫荧光和Western blot的实验结果一致,表明PIC能抑制TNBC细胞中β-Catenin蛋白表达。以上结果提示,PIC可有效抑制TNBC细胞中Wnt/β-Catenin信号通路激活,抑制肿瘤细胞增殖,且具有抑制血管生成的能力;裸鼠移植瘤实验结果表明,PIC对小鼠TNBC肿瘤的生长具有很好的抑制效果。免疫组化实验结果发现,PIC能减少肿瘤组织中Ki-67的表达量,减少细胞中β-Catenin累积,和细胞水平实验结果一致。通过免疫组化和免疫荧光实验结果发现,PIC能降低VEGFA和CD31的表达,表明PIC具有较强的抗血管生成的作用。 结论:PIC通过抑制Wnt/β-Catenin信号通路激活表现出良好的抗TNBC及抗血管生成活性,进一步确证了PIC具有良好的抗肿瘤作用。

关键词： 组蛋白去乙酰化酶抑制剂   脯氨酸氧化酶   AMPK   细胞自噬   细胞凋亡   三阴性乳腺癌  

摘要： 三阴性乳腺癌（TNBC）是最为严重的一种乳腺癌类型,目前并没有靶向的治疗药物,且临床预后性最差。许多研究报道表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂在三阴性乳腺癌的治疗中可能会发挥作用。脯氨酸氧化酶,又称脯氨酸脱氢酶,是脯氨酸代谢途径中的关键酶,在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。我们研究发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA,SAHA可以显著诱导脯氨酸氧化酶的产生,并通过激活AMPK信号通路诱导细胞自噬的发生。我们在三阴性乳腺癌细胞中敲低脯氨酸氧化酶,联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA,SAHA处理后,发现细胞自噬的减少以及细胞凋亡的增加。这些结果表明在组蛋白去乙酰化酶抑制剂的处理下脯氨酸氧化酶促进细胞的存活有可能成为三阴性乳腺癌潜在的治疗靶点。

关键词： Cyclin D1   胞内抗体   三阴性乳腺癌   增殖   凋亡   转移   分子机制  

摘要： 乳腺癌是全球女性最常见的癌症类型,亦是我国女性发病率最高、引起癌症相关性死亡的主要病因。三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)是一种缺乏雌激素受体、孕激素受体和表皮生长因子受体2表达的特殊类型乳腺癌,具有高侵袭性、高转移性和显著耐药性等特点。TNBC发病率占乳腺癌总发病率的20%,死亡率占乳腺癌总死亡率的83%,与其他类型的乳腺癌相比,TNBC患者的愈后差、远期生存率低,目前TNBC尚无标准的治疗方案。因此开展三阴性乳腺癌的新型治疗策略及分子机制的研究具有重要的科学意义和临床应用价值。Cyclin D1是由CCND1基因编码的细胞周期蛋白,具有促进细胞增殖和基因转录等功能,可在多种癌症中呈高表达。现有研究表明,阻断Cyclin D1的治疗策略将有助于干扰多种癌症特异性信号通路达到癌症治疗的目的。但是Cyclin D1在三阴性乳腺癌中的表达及其与愈后的关系尚存在争议,且Cyclin D1在TNBC发生、发展中的作用机制尚未明确。因此,深入研究TNBC中Cyclin D1的表达以及靶向拮抗Cyclin D1的作用效能,对于进一步理解TNBC发生和发展的分子机制,改善TNBC的治疗效果具有重要意义。胞内抗体技术是在细胞内表达且作用于同一细胞内靶抗原的具有功能的抗体分子,通过阻断或调节靶蛋白的活性,在翻译后水平实现蛋白质的敲低,作为RNA干扰(RNAi)和小分子抑制剂等靶分子敲低技术的互补手段,在蛋白质功能的研究中发挥重要作用。越来越多的研究表明,可以通过对胞内抗体进行工程化修饰等手段,将抗体蛋白定位于细胞各区间内,从而在多种疾病(例如病毒感染、退行性疾病和肿瘤)中发挥诊断和治疗作用。本实验室前期工作中构建了内质网滞留型抗Cyclin D1胞内抗体(命名为ER-ADκ),能够在ER阳性乳腺癌及肝癌细胞内结合并抑制Cyclin D1活性,有效抑制MCF-7、Hep G2等肿瘤细胞系增殖并诱导细胞凋亡的发生。但ER-ADκ能否在TNBC中发挥抑制肿瘤生长及转移的作用尚不清楚。因此,为了深入研究TNBC中Cyclin D1的致癌机制以及ER-ADκ能否作为改善TNBC患者愈后的有效治疗策略,本研究拟通过分析GEO数据库中TNBC患者m RNA转录组学数据,明确CCND1在TNBC组织中的转录水平及可能参与调控的信号通路,利用胞内抗体技术识别并结合TNBC细胞内Cyclin D1后,分别在细胞水平及裸鼠体内探究ER-ADκ的表达对三阴性乳腺癌生长、转移之间的关系及具体分子机制。主要研究结果如下:一、明确Cyclin D1在TNBC癌和癌旁组织中的表达特性。通过GEO数据库下载TNBC患者m RNA芯片数据并利用R语言进行生物学分析,研究结果表明,CCND1在TNBC组织中呈高表达,通过STRING网站行PPI网络构建、通过R语言行GO功能注释及KEGG富集通路分析发现,Cyclin D1在TNBC中参与调控细胞周期、细胞衰老、乳腺癌的发生以及在PI3K-AKT、Wnt等信号通路中发挥作用。乳腺癌组织芯片的免疫组织化学染色实验进一步证实:Cyclin D1在TNBC组织中的表达高于癌旁组织,预示Cyclin D1可能成为TNBC靶向治疗的分子靶点。二、证实抗Cyclin D1胞内抗体(ER-ADκ)能够有效抑制TNBC增殖和转移,促进TNBC凋亡。(1)在MDA-MB-231和BT-549两种TNBC细胞中转染ER-ADκ的质粒,进行Western blot、co-IP和间接免疫荧试验,结果表明,ER-ADκ在TNBC中成功表达并定位在细胞内质网;(2)流式细胞术分析结果表明:ER-ADκ能诱导MDA-MB-231细胞发生G1/S期细胞周期阻滞和细胞凋亡;(3)细胞划痕试验、Transwell小室等实验发现,ER-ADκ能抑制MDA-MB-231和BT-549细胞的迁移、侵袭和浸润能力。三、探究ER-ADκ抑制TNBC发生发展中的分子机制。结果表明:(1)TNBC细胞中,ER-ADκ抑制成视网膜细胞瘤抑癌蛋白(Retinoblastoma Protein,Rb)磷酸化水平,并上调抑制细胞周期相关因子p21(Cyclin inhibition protein 1)、p27(Kinase inhibition protein 1)的转录,进而抑制TNBC细胞周期进程;(2)ER-ADκ通过内质网应激途径,促进TNBC细胞发生凋亡;(3)ER-ADκ通过抑制β-catenin的核易位,下调TNBC细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程相关转录因子Slug、Snail的表达,抑制EMT相关蛋白N-钙黏着蛋白(N-cadherin)、基质金属蛋白酶

关键词： 橙皮素   黄酮   合成   抗炎   抗乳腺癌  

摘要： 目的:来自青天葵的2个黄酮苷Nervilifordin-F、G具有良好抗炎活性(IC为15.15、30.82μM),且基本无细胞毒性(EC>40μM),但其自然植物资源珍贵稀缺且植物中含量很低。为获得大量样品以便进行深入研究,现进行由廉价易得的橙皮素半合成其衍生物,并初步进行体外抗炎活性和抗乳腺癌活性研究,为下一步合成其衍生物和发掘黄酮类化合物其他的生物活性,寻找可能的黄酮类药物或先导化合物提供参考,促进黄酮类化合物潜在的药用价值的开发利用。方法:以廉价、易大量获得的天然二氢黄酮橙皮素为原料,通过甲氧基化、氧化、苄基保护、糖苷缩合反应、去苄基和乙酰基保护基等步骤合成黄酮及其衍生物,并经ESI-MS、HNMR、C NMR等进行结构表征。采用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞炎症模型,测定化合物对刺激后的细胞释放炎症介质一氧化氮(NO)和炎症因子肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)的抑制作用,评价化合物的体外抗炎活性;同时用CCK8法检测化合物对细胞正常生长的影响。采用MTS法测试了化合物对人炎性三阴性乳腺癌细胞系SUM 149的生长抑制作用,初步评价其抗人炎性三阴性乳腺癌活性。结果:(1)经ESI-MS、HNMR、C NMR等确证成功合成32个黄酮类化合物(1a-1m,2a,1-18),包括15个已知化合物(1a-1d、1f、1g、1j-1l、2a、13-16)和17个未见文献报道的新黄酮(1e、1h、1i、1-12、17、18)。(2)化合物1c,1g,1i,1j,1l,1-18在无明显细胞毒活性的前提下对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7释放NO表现出一定程度的抑制作用,其中化合物1,7,9,17抑制活性最强,其IC值分别为46.32±1.29μM,47.23±1.05μM,35.71±1.06μM,45.88±3.60μM。其余的化合物则无明显抑制作用,在最大测试浓度(20μM)下的NO抑制率<25%,且15、30、60μM的浓度梯度的抑制率没有统计学意义(P>0.05)。此外,在浓度为30μM下,化合物1,7,9,17均能明显抑制LPS刺激后的RAW264.7细胞释放TNF-α、IL-6(P<0.01或P<0.001),表现出一定的体外抗炎活性。(3)MST结果显示,化合物1b,1f,1h,1j-1m,1p,1具有一定的抗人炎性三阴性乳腺癌活性,其IC值在16.61μM以下,其中化合物1i活性最强,IC值为1.38±0.31μM。其余的化合物则无明显细胞毒活性,在最大测试浓度(20μM)下的抑制率<50%。结论:(1)经ESI-MS、HNMR、C NMR等确证成功合成32个黄酮化合物,其中有17个为新的黄酮类化合物。(2)化合物1c,1g,1i,1j,1l,1-18对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7释放NO具有不同程度的抑制作用。(3)化合物1b,1f,1h,1j-1m,1,3具有不同程度的对人炎性三阴性乳腺癌的生长抑制作用。(4)3位羟基葡萄糖基化及糖基乙酰化具有促进抗炎活性作用,且葡萄糖的促进作用比半乳糖强;2,3双键,3ˊ位羟基,7位羟基适当的脂溶性修饰增强TNBC活性;而3位羟基、5位羟基、3位羟基糖基化使抗TNBC活性下降。

关键词： 二代测序   高通量筛选   三阴性乳腺癌   余甘子   抗肿瘤  

摘要： 目的:乳腺癌治疗中的一个世界性难题是三阴性乳腺癌的临床治疗目前没有特效药物。本研究以MDA-MB-231细胞为模型,应用基于二代测序的高通量筛选技术发现中药余甘子具有抗三阴性乳腺癌作用,并进一步研究余甘子抗三阴性乳腺癌机理。方法:1.以二代测序为基础的高通量技术筛选出余甘子,进行差异表达基因KEGG富集分析。2.设置实验组和对照组,在体外培养人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞,采用四氮唑蓝（MTT）比色法检测经余甘子（320、160、80、40、20、10、5μg/m L）处理MDA-MB-231细胞24 h后的细胞活性并计算IC50;3.流式细胞术分析经余甘子（20μg/m L）处理MDA-MB-231细胞24 h后的细胞的周期变化;4.细胞划痕实验判断余甘子（20μg/m L）处理后MDA-MB-231细胞迁移能力;5.荧光定量PCR（Real-time PCR）法检测经余甘子（20μg/m L）处理MDA-MB-231细胞24 h后的Cyclin G2和细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子p21的表达水平;***数据库分析三阴性乳腺癌患者Cyclin G2、p21的表达与预后情况。结果:与对照组比较,余甘子（320、160、80、40、20、10、5μg/m L）在体外对MDA-MB-231细胞活性具有明显的抑制作用（P＜0.05）,且这种抑制作用呈浓度依赖效应;余甘子（20μg/m L）可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞体外增殖,细胞周期阻滞在G1/S期;余甘子（20μg/m L）能显著上调MDA-MB-231细胞中Cyclin G2、p21 m RNA的表达水平（P＜0.05）;余甘子（20μg/m L）细胞划痕间伤口愈合距离百分比明显高于对照组,而抑制后细胞划痕间伤口愈合距离百分比明显低于对照组;通过KMplot分析临床数据提示高表达Cyclin G2、p21水平具有潜在增加三阴性乳腺癌患者良好预后的作用。结论:应用基于二代测序的高通量筛选技术发现中药余甘子（20μg/m L）具有抗三阴性乳腺癌作用,其机制可能与上调Cyclin G2、p21 m RNA水平有关。

关键词： 穿心莲内酯   三阴性乳腺癌   转移侵袭   UCP2   糖酵解   抑制作用  

摘要： 目的：穿心莲常见于中国、印度等亚洲国家。小分子化合物穿心莲内酯（Andrographolide，Andro）是其主要活性成分，最初应用于抗炎、神经保护，目前抗肿瘤作用已成为研究热点。本论文主要针对三阴性乳腺癌（Triple-negativebreastcancer,TNBC）的增殖、侵袭与转移，研究穿心莲内酯的抑制作用，探究其抑制作用与能量代谢的关系，为抗乳腺癌药物研发提供新的策略。　　方法：在体水平，选择BALB/c小鼠，共32只，将鼠源性乳腺癌4T1细胞注射入小鼠左侧第四乳房垫中建立乳腺癌原位模型，待小鼠第四乳房内肿瘤体积长到一定程度后，将小鼠随机分为四组，每组8只，分别给予生理盐水、5-Fu（20mg/kg）和不同浓度Andro（5，10mg/kg），每天称重以及游标卡尺检测瘤体体积。10天后，取肿瘤组织以及肝脏、胸腺、脾脏等组织，通过组织切片以及计算肝脏、胸腺、脾脏指数检测Andro的抑瘤作用和毒副作用;Westernblot检测肿瘤组织内解偶联蛋白-2（UCP2）以及丙酮酸脱氢酶（PDH）的表达，乳酸试剂盒检测小鼠血清中乳酸含量;乙酰辅酶A试剂盒检测小鼠肿瘤组织中乙酰辅酶A的含量;ATP检测试剂盒检测小鼠血清中ATP含量。　　离体水平，选取了TNBC细胞MDA-MB-231、非转移性乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HepG2以及胃癌细胞SGC四种肿瘤细胞，采用MTT法检测细胞活力，比较Andro对不同种类的肿瘤细胞生存活性的抑制作用，计算抑制率及其IC50值;比较Andro对TNBC细胞MDA-MB-231和正常乳腺上皮细胞MCF-10A的活力抑制作用的差异;伤口愈合实验、Transwell小室实验检测Andro对MDA-MB-231细胞的转移侵袭能力的影响;RT-PCR及WesternBlot检测线粒体内UCP2的mRNA水平及蛋白水平的变化，探究Andro对MDA-MB-231细胞转移与侵袭的能力是否与UCP2有关。　　接着使用乳酸试剂盒检测细胞内乳酸的水平，Westernblot检测细胞内PDH的表达;乙酰辅酶A试剂盒检测细胞中乙酰辅酶A的水平;JC-1荧光染料检测细胞线粒体膜电位变化;ATP试剂盒检测细胞内ATP含量以及DCFH-DA染色检测细胞内活性氧（ROS）水平;采用Westernblot检测肿瘤组织以及细胞中AMPK以及HIF-1α的表达，探究Andro调控TNBC细胞能量代谢方式的可能机制。　　结果：1、成功建立乳腺癌原位小鼠模型，发现5-Fu及Andro处理组均呈现出较为显著的抑制肿瘤增长的作用，各组抑瘤率分别为21.79%（Andro5mg/kg），35.89%（Andro10mg/kg），57.69%（5-Fu组）。但是，5-Fu处理组小鼠第七天出现体重下降、食欲不振、毛发暗沉，严重的甚至出现脱水，死亡，小鼠胸腺、脾脏重量均显著减轻，肝脏颜色异常。而5mg/kg和10mg/kg的Andro组对小鼠体重无明显影响，且脏器指标均显示正常。同时Hamp;E染色结果证明，Andro对乳腺癌组织有明显的破坏作用。　　2、肿瘤细胞活性检测MTT结果显示，Andro能够抑制多种肿瘤细胞的活力，IC50值分别为：MDA-MB-23122.36μM，SGC40.81μM，HepG230.94μM，MCF-743.51μM。其中对MDA-MB-231细胞的抑制效果最好。更为重要的是，相同浓度处理时，Andro对正常乳腺上皮细胞MCF-10A的活性没有明显影响，说明Andro对肿瘤细胞有一定的选择性。　　3、通过伤口愈合实验我们观察到，随着药物浓度的增加或处理时间延长，细胞伤口愈合能力逐渐减弱;Transwell小室实验结果表明随着Andro浓度的升高，细胞侵入到下室的数量较少，说明Andro能够抑制MDA-MB-231细胞的转移与侵袭。　　4、分子对接模拟结果显示，Andro与UCP2的结合常数为-5.4089kcal/mol。RT-PCR以及WesternBlot发现，随着Andro浓度的升高，无论是肿瘤组织还是细胞内UCP2的表达均呈现下降趋势，且乳酸试剂盒检测的小鼠血清以及细胞内乳酸的含量均明显下降，提示Andro抑制TNBC转移与侵袭可能与调控UCP2，抑制肿瘤细胞糖酵解水平有关。　　5、DCFH-DA荧光探针检测发现Andro能够上调细胞内ROS水平，但细胞内ROS的增加趋势并不明显，JC-1荧光探针检测发现随着Andro浓度的升高，线粒体膜电位升高，则提示我们TNBC细胞线粒体功能得到改善，随着Andro浓度的升高，细胞内ATP的含量升高，PDH的表达量升高，乙酰辅酶A的含量升高。说明Andro能够上调TNBC细胞氧化磷酸化水平。最后，Andro调控TNBC能量代谢方式可能与上调AMPK，下调HIF-1