关键词： 琵琶甲虫   三阴性乳腺癌   JKW-13   侵袭   迁移  

摘要： 三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)是指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)表达均为阴性的乳腺癌,发病率约为12-17%,是女性中死亡率最高的癌症类型。TNBC的瘤体较大、分级偏高、有较强浸润和转移特征,且发病人群年轻化,导致TNBC成为癌症治疗中面临的重大挑战。结构多样的天然产物是新药开发的重要来源,多数抗肿瘤药物都是天然产物或其衍生物。在新药研发时经常以天然产物为先导化合物,进行结构优化即可获得具有成药性的药物分子。课题组前期选用天然昆虫药日本琵琶甲虫,通过提取、分离及纯化后获得具有活性的先导化合物,经过结构修饰、活性筛选等步骤,得到一系列高效低毒的抗TNBC转移化合物,有望为抗乳腺癌的新药研发提供具有前景的候选化合物。 本文从日本琵琶甲虫中获得具有抗TNBC活性的小分子化合物JKW-14,通过结构优化获得了73个JKW-14衍生物(课题组他人完成)。采用CCK8法检测不同化合物对TNBC细胞的毒性,通过划痕实验评价化合物的迁移抑制活性,并优选出活性最佳化合物JKW-13。通过转录组测序分析JKW-13对TNBC细胞基因表达谱的影响,KEGG通路富集分析JKW-13影响TNBC细胞的相关信号通路,并采用免疫印迹法(Western blot,WB)验证这些信号通路相关蛋白的表达情况。通过荧光染色观察JKW-13对细胞线粒体膜电位和活性氧水平的影响。划痕实验评价JKW-13探针的活性,基于活性的蛋白质组分析(Activity-based protein profiling,ABPP)法筛选小分子探针与蛋白结合的最佳浓度。 结果显示,JKW-13能显著抑制TNBC细胞HCC1806、MDA-MB-231、BT549的迁移侵袭,影响细胞内部分基因的m RNA水平,通过TGF-β通路抑制EMT进程,诱导细胞线粒体损伤、膜电位下降及活性氧(ROS)水平升高。经生物素修饰制备了4种JKW-13的小分子探针,部分探针保留了迁移抑制活性,为后续的靶标垂钓工作奠定了物质基础。因此我们认为,JKW-13抑制乳腺癌细胞迁移活性良好,可能通过TGF-β信号通路、线粒体损伤、激发ROS等途径影响乳腺癌细胞迁移和侵袭,修饰合成的JKW-13探针为其靶点发现奠定了物质基础。

关键词： 虫草素   转录组   三阴性乳腺癌   Hedgehog   Hippo  

摘要： 前期研究表明,蛹虫草活性成分虫草素能有效抑制乳腺癌移植瘤的生长和转移,但其作用机制未清楚。本研究取三阴性乳腺癌移植瘤样品,通过转录组测序技术分析虫草素抗乳腺癌移植瘤的分子作用机制。结果表明,以P<0.05、log2|FC|>1为标准,筛选获得584个差异表达基因,其中上调基因69个,下调基因515个;KEGG分析表明,虫草素对乳腺癌移植瘤的分子调控涉及Hippo signaling pathway、Hedgehog signaling pathway、ECM-receptor interction、TGF-beta signaling pathway等多条癌症相关信号通路;GO分析表明,这些差异基因富集在biological adhesion、growth、metabolic process、locomotion和biological process等16个生物学过程中,提示虫草素对乳腺癌移植瘤生长与转移有极显著的调节作用;进一步对生长和转移过程的基因进行PPI互作分析,提示Hedgehog signaling pathway、Hippo signaling pathway是虫草素抗三阴性乳腺癌的重要潜在作用通路。研究结果提示Hippo-Yap/TAZ信号通路和Hedgehog-Gli信号通路为潜在作用通路,为进一步理解虫草素治疗三阴性乳腺癌的分子机制奠定了基础。

关键词： 黄芪解毒汤   三阴性乳腺癌   术后复发转移   不良反应   糖类抗原153   癌胚抗原  

摘要： 目的探讨黄芪解毒汤抗三阴性乳腺癌术后复发转移的临床效果。方法选取2016年2月至2018年2月大连市中西医结合医院收治的56例原发性三阴性乳腺癌术后患者作为研究对象,按照电脑随机分组方法将其分为对照组与观察组,每组各28例。对照组患者采用紫杉醇周期性化疗或手术治疗,观察组患者在对照组的基础上采用黄芪解毒汤治疗。比较两组患者治疗前后的血清肿瘤标志物、电子计算机断层扫描(CT)下实体瘤体积、不良反应及长期治疗结果。结果治疗后,观察组患者的糖类抗原153(CA153)、癌胚抗原(CEA)高于对照组,CT下实体瘤体积小于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组患者的不良反应总发生率低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组患者治疗后6、12、18个月复发转移率低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在三阴性乳腺癌术后患者的治疗中,使用黄芪解毒汤,不仅可以有效降低患者的CA153、CEA水平,还可以减少术后不良反应发生的概率,同时有助于降低术后复发转移的概率。

关键词： 木犀草素   顺铂   三阴性乳腺癌   Nrf2-ARE   协同作用  

摘要： 目的通过木犀草素协同顺铂调控Nrf2-ARE信号探讨其抗三阴性乳腺癌(TNBC)细胞MDA-MB-231的作用。方法MTT法检测木犀草素和顺铂单用或联用对TNBC细胞MDA-MB-231活力影响,并采用Compusyn计算协同指数(CI);AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测木犀草素和顺铂单用或联用对MDA-MB-231细胞凋亡影响;Transwell侵袭与迁移实验检测木犀草素和顺铂单用或联用对MDA-MB-231细胞侵袭与迁移能力影响;流式细胞术分析木犀草素和顺铂单用或联用对MDA-MB-231细胞CD24^(+)/CD44^(+)表达量的影响;蛋白质印迹法检测Nrf2-ARE信号关键蛋白核因子E2相关因子(Nrf2)、编码还原型辅酶/醌氧化还原酶(NQO1)、血红素氧合酶-1(HO-1)和人谷胱甘肽S转移酶A1(GSTA1)表达的变化。结果24、48及72h下木犀草素(40μmol/L)和顺铂(5μg/mL)联合给药细胞存活率最低,且CI<1,表明木犀草素与顺铂给药24h后两药即具有协同效应,差异有统计学意义,P<0.05;木犀草素(20μmol/L)和顺铂(5μg/mL)共同处理下细胞凋亡率最高,表明两药联用促进细胞凋亡;木犀草素(20μmol/L)和顺铂(5μg/mL)共同处理下细胞侵袭与迁移能力最弱,差异有统计学意义,P<0.05;木犀草素(40μmol/L)和顺铂(5μg/mL)共同处理下CD24^(+)/CD44^(+)表达量最低,表明两药联合具有增强抑制细胞迁移作用;木犀草素(40μmol/L)和顺铂(5μg/mL)联合处理下Nrf2、NQO1、HO-1和GSTA1表达量最低,表明其通过抑制Nrf2蛋白从而抑制Nrf2-ARE通路下游耐药关键酶系NQO1、HO-1及GSTA1的表达,增加细胞用药敏感性,且具有联合效应。结论木犀草素通过调控Nrf2-ARE信号通路能够提高MDA-MB-231细胞对顺铂敏感性,提示木犀草素可作为化疗增敏剂与顺铂联合应用于TNBC的治疗。

关键词： 三阴性乳腺癌   中药   活性成分   中药复方   作用机制  

摘要： 三阴性乳腺癌(TNBC)作为乳腺癌的一种亚型,具有侵袭性强、复发转移率高等特点,严重威胁女性身心健康,由于缺乏明确的分子靶标,目前仍以化疗为主,但临床治愈率低。中药可通过多途径、多靶点抑制TNBC的生长、降低其复发转移率,具有独特的治疗优势。文章结合国内外的最新研究成果,对中药及其活性成分抗TNBC的作用及其机制进行综述,为中药新药的开发及临床应用提供参考。

关键词： Antimycin   MDA⁃MB⁃231   MCF⁃10A   IC50  

摘要： 研究Antimycin类天然产物对三阴性乳腺癌细胞MDA⁃MB⁃231特异性生长抑制和杀伤作用.三种结构类似的天然产物Antimycin⁃1,⁃2和⁃3对MDA⁃MB⁃231细胞生长都有很强的抑制作用,其IC50分别为1.34±0.07,160±20和180±50 nmol·L^(-1),Antimycin⁃1活性是Antimycin⁃2和Antimycin⁃3的一百多倍.10 nmol·L^(-1)的Antimycin⁃1就可有效抑制MDA⁃MB⁃231细胞增殖,药物处理细胞24和48 h后的抑制率分别达到约80%和90%.显微镜下可以观察到,10和100 nmol·L^(-1)的Antimycin⁃1都不同程度地杀伤MDA⁃MB⁃231细胞,1000 nmol·L^(-1)的Antimycin⁃1甚至使细胞几乎消溶,只留下突起的核和胞质残骸.而同样浓度药物造成的乳腺正常细胞MCF⁃10A和结肠癌细胞HCT116形态的改变不明显.1和5 nmol·L^(-1)的Antimycin⁃1对细胞集落抑制率分别达到52%和95%.20和50 nmol·L^(-1)的Antimycin⁃1也明显改变MDA⁃MB⁃231细胞核形态,核呈畸形,皱缩严重,核膜破损.5,10和100 nmol·L^(-1)的Antimycin⁃1处理MDA⁃MB⁃231细胞12,24和48 h引发细胞凋亡和坏死数量增加,并呈现时间和剂量依赖性.5,10和20 nmol·L^(-1)的Antimycin⁃1处理MDA⁃MB⁃231细胞6,12和24 h后,没有观察到对细胞周期时相的明显影响.20 nmol·L^(-1)的Antimycin⁃1处理MDA⁃MB⁃231细胞12,16,20和24 h后,引起胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平随处理时间延长呈逐渐下降趋势.以上结果证明,纳摩尔级的Antimycin⁃1能有效抑制和杀伤三阴性乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞.

关键词： 三阴性乳腺癌   Beclin-1   小分子激动剂   自噬   凋亡  

摘要： 细胞自噬(Autophagy)是一种进化上保守的溶酶体降解途径,在细胞内环境稳态、细胞发育、细胞免疫、能量代谢、抑制肿瘤、预防神经退行性病变和延长寿命方面起着至关重要的作用。细胞自噬的药理学激活可能是治疗乳腺癌等人类癌症的有效方法之一。Beclin-1是自噬过程中的关键调控蛋白,作为III型磷脂酰肌醇3-激酶(class III phosphatidylinositol 3-kinase,PI3KC3)复合体的关键亚基调节自噬过程中关键的限速步骤。作为肿瘤抑制因子,BECN1基因的单等位基因缺失与多种癌症相关,因此Beclin-1是包括乳腺癌在内的多种癌症的潜在治疗靶点。然而由于其BH3(Bcl-2-homology-3)结构域,CCD(Coiled coil domain)结构域为螺旋结构,ECD(Evolutionary conserved domain)结构域的可药口袋浅,Beclin-1与PI3KC3复合体的人源高分率的结构信息尚未解析等原因,Beclin-1的靶向药物设计比较困难。本研究基于Beclin-1已有的晶体结构,分析其在形成PI3KC3复合体过程中的结构变化过程和关键的蛋白质相互作用界面。利用多种变构位点识别方法在其ECD结构域表征了一个潜在的变构位点。进一步采用分子对接的高通量虚拟筛选方法将SPECS库中的小分子化合物对接到变构位点,筛选候选的小分子激动剂。经过三轮的分子对接筛选,挑选了32个化合物作为候选的小分子激动剂。通过对细胞水平的自噬激活活性筛选和抗乳腺癌细胞增殖活性筛选,我们发现化合物10能够诱导乳腺癌细胞自噬,上调Beclin-1的水平。同时对MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-468,BT-549细胞都具有较好的抗增殖活性,对MDA-MB-231细胞尤为明显(IC=15.22μmol·L)。我们发现化合物10能够完美的对接到变构位点中,并且形成了稳定的相互作用。分子动力学模拟结果表明化合物10-Beclin-1复合体是一个稳定的系统。体外机制研究表明,化合物10能够诱导MDA-MB-231细胞发生自噬相关性死亡。同时还发现化合物10激活自噬后,还伴随细胞凋亡的发生。本研究确定了候选化合物10作为开发有效的、具有选择性靶向Beclin-1激活细胞自噬的先导化合物,为进一步开发和优化用于临床治疗的靶向Beclin-1激活自噬小分子药物提供依据。

关键词： 三阴性乳腺癌   光热治疗   PD-1/PD-L1通路   CD47-SIRPα通路   肿瘤相关巨噬细胞  

摘要： 三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是具有高侵袭、易转移特性的一种恶性肿瘤。由于缺乏雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)的表达,在病理组织和分子表型方面极具异质性。其治疗仍然是肿瘤学中的一个挑战,亟待开发高效、特异的治疗手段。TNBC在乳腺癌各亚型中最具免疫原性,并且具有较高水平的TILs和PD-L1蛋白的表达,可能从免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor,ICI)治疗中获益。然而肿瘤微环境中的各种免疫抑制细胞、多免疫检查点的上调均限制了单一ICI疗法在TNBC中的作用。TNBC上同时存在PD-L1和CD47的过表达,意味着其抗肿瘤固有免疫和适应性免疫均受到抑制。联合应用PD-1和CD47两种ICI,同时唤醒TNBC肿瘤局部的固有和适应性免疫应答,同时逆转肿瘤微环境中M2型肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)等免疫抑制细胞的功能,为治疗TNBC带来了诱人的前景。本项目中,我们构建了一个刺激响应多功能抗TNBC纳米平台(ZIF-PQ-PDA-AUN),发挥光热协同双ICI效应。ZIF-PQ-PDA-AUN的光热疗法可以热消融肿瘤细胞,同时促进TILs向肿瘤的浸润;AUNP-12和PQ912通过切断PD-L1和CD47信号,恢复了肿瘤中的固有和适应性免疫应答,并进一步增强M1型TAMs的吞噬作用、诱导了促肿瘤的M2型TAMs向抗肿瘤的M1型TAMs的极化。与单一ICI免疫疗法相比,该纳米递送系统呈现出更强的抗肿瘤免疫效应、更低的自身免疫副反应,以期为TNBC的治疗提供可借鉴的新策略。

关键词： 梅花参   三阴性乳腺癌   海参皂苷   丝裂原活化蛋白激酶  

摘要： 目的:从中药梅花参的次生代谢产物中发现抗乳腺肿瘤的活性三萜类皂苷化合物,鉴定其化学结构并研究其抗乳腺癌作用机制。方法:结合生物学与化学的技术和方法,开展中药梅花参来源的海参皂苷作用机理研究。采用活性追踪分离结合多维化学导向技术,快速定位目标皂苷分子;充分利用各种正反相硅胶柱色谱、凝胶色谱、制备HPLC等色谱分离方法,分离纯化获得海参皂苷单体;综合运用核磁共振波谱、高分辨质谱等方法,确定单体化合物的化学结构。继而以活性分子为生物体内探针,发现药物作用新靶标或新的作用机制,并在细胞水平上进行功能确证,研究海参皂苷化合物对乳腺癌细胞株MDA-MB-231等细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响,以及该化合物对肿瘤细胞信号通路的影响和分子机制,从而探寻海参皂苷的抗肿瘤机制。结果:1.成功从采自中国南海西沙群岛的梅花参样品中分离并鉴定得到Stichoposide C2(STC2)、Stichoposide B1(STB1)、Stichoposide C1(STC1)、Stichoposide A(STA)四种具有抗肿瘤活性的三萜类皂苷化合物,选取其中对正常细胞毒性较小的STC2进行后续研究;***2能够较为显著地抑制MDA-MB-231和4T1两种乳腺癌细胞的增殖能力和克隆形成能力,且呈剂量依赖性;***2能够诱导MDA-MB-231和4T1两种乳腺癌细胞的细胞周期阻滞,将其分别阻滞在G2/M期和S期,且能诱导两种乳腺癌细胞凋亡;***2能够诱导两种乳腺癌细胞的DNA损伤,显著增加其DNA双链断裂标志物γ-H2AX的蛋白表达水平;***2能够分别下调MDA-MB-231和4T1细胞的p-cdc2、Cyclin B1以及CDK2、Cyclin A2蛋白表达水平;STC2能够上调两种乳腺癌细胞的Bax、Cleaved PARP蛋白表达水平,能够上调MAPK信号通路相关蛋白p38、JNK、ERK1/2的磷酸化水平以及下调Akt的磷酸化水平,推测STC2的抗乳腺肿瘤活性可能与此有所关联。结论:中药梅花参中含有丰富的抗肿瘤活性皂苷产物,从中药梅花参中分离得到的海参皂苷化合物STC2能够对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞的增殖形成抑制现象,对其细胞周期的阻滞以及细胞凋亡的发生也有着明显的诱导和促进作用,其作用机制可能与抑制细胞周期相关蛋白以及MAPK信号通路相关。

关键词： 白头翁皂苷A3   三阴性乳腺癌   M2型巨噬细胞   4T1-Luc三阴性乳腺癌肺转移模型  

摘要： 目的:本研究的目的旨在研究白头翁皂苷A3通过抑制巨噬细胞M2型极化发挥抗三阴性乳腺癌转移的作用。通过体外构建巨噬细胞M2极化模型,考察白头翁皂苷A3对巨噬细胞M2型极化的影响及其作用机制;通过体外研究白头翁皂苷A3通过抑制巨噬细胞M2型极化对三阴性乳腺癌迁移能力的影响,同时体内研究白头翁皂苷A3对4T1-Luc三阴性乳腺癌肺转移小鼠的抗转移作用及其机制,为治疗三阴性乳腺癌转移提供新的研究思路与实验根据。第一部分:白头翁皂苷A3对巨噬细胞M2型极化的作用及其机制研究方法:本研究采用原代巨噬细胞BMDM来构建巨噬细胞M2型极化模型,以评价白头翁皂苷A3对巨噬细胞M2型极化的影响。采用CCK-8法考察白头翁皂苷A3对BMDM细胞存活率的影响;采用流式细胞术考察白头翁皂苷A3对M2型巨噬细胞标志性抗原CD206表达的影响;采用RT-PCR法考察白头翁皂苷A3对M2型巨噬细胞标志性基因CD206、Fizz1、Ym1、Arg-1的m RNA表达水平的影响;采用Western-blot检测白头翁皂苷A3对JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达水平的影响;采用分子对接方法预测白头翁皂苷A3抑制巨噬细胞M2型极化的作用靶标;采用si RNA转染BMDM细胞,将其STAT3基因敲低,加入白头翁皂苷A3干预后,RT-PCR法检测M2型巨噬细胞标志性基因CD206、Fizz1、Ym1、Arg-1的m RNA表达水平。结果:CCK-8结果发现,白头翁皂苷A3在0-100μg/ml浓度范围内对BMDM细胞的存活率无明显影响;IL-4诱导BMDM细胞后,F4/80+CD206+双阳性比例从2.92%±0.09%上升到46.4%±1.72%(P<0.01),而同时给予低、高剂量的白头翁皂苷A3干预后,F4/80+CD206+双阳性比例从46.4%±1.72%分别下降至28.2%±0.92、17.6%±0.34(P<0.01);IL-4诱导BMDM细胞后,M2型巨噬细胞标志性基因CD206、Fizz1、Ym1、Arg-1的m RNA表达水平显著上升(P<0.01),同时给予白头翁皂苷A3后,BMDM细胞内CD206、Arg-1、Fizz1、Ym1的m RNA表达水平显著降低(P<0.01);IL-4诱导BMDM细胞后,BMDM细胞内JAK2、STAT3蛋白磷酸化表达水平显著上调(P<0.01),同时给予白头翁皂苷A3干预后,BMDM细胞内JAK2蛋白磷酸化表达水平无明显变化,但同时给予白头翁皂苷A3组干预后,BMDM细胞内STAT3蛋白磷酸化表达水平显著降低(P<0.05);分子对接显示,白头翁皂苷A3与STAT3蛋白对接活性较好,STAT3可能为白头翁皂苷抑制巨噬细胞M2型极化的作用靶标;STAT3-si RNA转染BMDM细胞后,与IL-4-STAT3-si RNA组比较,IL-4+白头翁皂A3-STAT3-si RNA组M2型巨噬细胞标志性基因的m RNA表达显著下调(P<0.01)。第二部分:白头翁皂苷A3通过抑制巨噬细胞M2型极化对三阴性乳腺癌转移的影响方法:本研究通过体内外实验考察白头翁皂苷A3通过抑制巨噬细胞M2型极化对三阴性乳腺癌转移的作用。体外实验中收集IL-4与白头翁皂苷A3单独或共同孵育巨噬细胞的条件培养基,将其作用于4T1细胞,通过Transwell小室迁移实验与细胞划痕实验考查其迁移运动能力,同时考察白头翁皂苷A3本身对4T1细胞迁移运动能力的影响;体内实验中构建4T1-Luc三阴性乳腺癌细胞Balb/c小鼠肺转移模型,采用小动物活体成像术及HE染色法观察小鼠三阴性乳腺癌肺转移情况,以考察白头翁皂苷A3体内抗三阴性乳腺癌转移的作用。采用免疫组织化学染色法测定肺组织中的巨噬细胞M2型极化相关表面抗原CD206的表达。结果:体外Transwell小室迁移实验结果表明,IL-4诱导的条件培养基能显著增加迁移至小室底部的4T1细胞数量,从每个视野109±15增加至231±32个(P<0.01),与IL-4诱导的条件培养基比较,同时给予高剂量的白头翁皂苷A3与IL-4孵育BMDM细胞得到的条件培养基能显著降低迁移至小室底部的4T1细胞数量,从每个视野231±32个分别下降至187±34个(P<0.05);细胞划痕实验发现,IL-4诱导的条件培养基能显著增加4T1细胞的划痕愈合能力(P<0.01),与IL-4诱导的条件培养基比较,同时给予高剂量的白头翁皂苷A3及IL-4孵育BMDM细胞得到的条件培养基能显著降低4T1细胞划痕愈合率(P<0.05);而白头翁皂苷A3本身对4T1细胞的迁移能力无明显影响。三阴性乳腺癌肺转移结果显示,经过白头翁皂苷A3干预后,与4T1-Luc乳腺癌肺转移模型组小鼠比较,白头翁皂苷A3高剂量组4T1-Luc小鼠体重显著