关键词： 补骨脂乙素   三阴性乳腺癌   SIRT2   氧化应激   周期阻滞  

摘要： 目的:补骨脂乙素（IBC）是一种天然查尔酮,本课题旨在研究IBC对三阴性乳腺癌的细胞毒性,并对其在体内外抗三阴性乳腺癌作用及分子机制进行探索。 方法:1.利用MTT法检测IBC对乳腺癌细胞的细胞毒性,并计算其IC50。2.运用酶活性检测和分子对接实验确定IBC作用的分子靶点。3.利用蛋白免疫印迹实验检测IBC对乳腺癌细胞内蛋白信号的调控作用。4.运用Hoechst 33258染色和Annexin V-FITC/PI染色检测IBC对乳腺癌细胞造成的细胞核形态变化和凋亡百分比。5.利用流式细胞术检测IBC对活性氧（ROS）生成和细胞周期阻滞的影响,并探讨二者的关系。6.利用MDA-MB-231细胞异种移植鼠模型评价IBC对乳腺癌细胞的体内活性作用,并确定其量效关系。7.通过免疫组织化学、组织病理学检测等方法,评估了IBC体内抗乳腺癌的有效性和安全性。 结果:***以剂量依赖方式抑制TNBC细胞MDA-MB-231增殖,IC50为9.63±1.58μM。***能在SITR2活性袋中与VAL233和ALA1352氨基酸的氨基以氢键作用力的方式结合。在亚微摩尔浓度下抑制SIRT2酶活性,IC50为0.84±0.39μM。3.蛋白分子印迹结果显示,IBC可以使α-tubulin的乙酰化水平升高,而P-STAT3和C-myc的表达显著降低。*** 33258染色结果表明,IBC可导致MDA-MB-231细胞的细胞核萎缩,凋亡小体数目增多。Annexin V-FITC/PI染色进一步验证了IBC可诱导细胞凋亡,凋亡细胞比例由6.74±1.05%增加到47.32±4.86%。5.流式细胞仪检测结果显示,IBC能明显诱导MDA-MB-231细胞中ROS生成,IBC治疗组S期细胞数量从29.3±3.60%增加到36.2±6.01%,导致细胞周期阻滞在S期。抗氧化剂NAC能明显逆转S期阻滞效应,产生G0/G1期阻滞。6.在对MDA-MB-231细胞异种移植小鼠模型给药12天后,IBC对小鼠肿瘤生长有显著的抑制作用,30 mg/kg和60 mg/kg IBC治疗组的抑制率分别为25%和53%。7.免疫组化结果显示,高剂量IBC处理组的Ki67+细胞比例显著降低,TUNEL+细胞明显增多。提示IBC对小鼠体内三阴性乳腺癌细胞具有抑制增殖和促进凋亡作用。 结论:补骨脂乙素能通过靶向抑制SIRT2去乙酰化活性和诱导ROS产生从而诱导三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞凋亡和周期阻滞,对人MDA-MB-231异种移植小鼠肿瘤模型有较好的抑制作用。

关键词： 三阴性乳腺癌   淋巴管生成   VEGFR3   PARP   双靶点抑制剂  

摘要： 三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）作为乳腺癌的一种特殊分子分型,占整体乳腺癌的15%左右,具有特殊的分子表达特征、生物学行为以及临床病理特征。目前临床上常用的TNBC治疗手段仍然是手术和常规的全身细胞毒化疗,但是密集型,高剂量的化疗会产生巨大的毒性,且肿瘤复发或转移后往往缺乏有效的药物,治疗效果不理想,预后依然很差。肿瘤血管和淋巴管生成在TNBC的发生和发展过程中起关键作用,诸多研究表明抗血管内皮生长因子受体（Vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR）通路介导的血管和淋巴管生成是TNBC治疗领域富有潜力的策略。然而,VEGFR抑制剂的缺点也非常突出,包括抑制生理性血管生成而导致的严重不良反应（如出血、伤口愈合延迟、胃肠道穿孔、血栓栓塞并发症、蛋白尿等）、抗肿瘤效果持续时间短,血管生成代偿信号通路激活导致的治疗性耐药,这些都在一定程度上限制了该类抑制剂的临床应用。因此,设计和发现具有高效价、高选择性和低毒性的VEGFR抑制剂,不仅能够为抗TNBC的治疗药物研究提供科学策略,也能有助于进一步探索VEGFR通路在TNBC发生和发展中的具体机制和功能。本人在攻读博士学位期间,围绕VEGFR介导肿瘤血管和淋巴管生成,开展了新型VEGFR3选择性和VEGFR/PARP双靶标抑制剂的设计、合成和构效关系研究,并对优选化合物开展体内外抗TNBC药效学、作用机制和药代动力学性质研究。具体内容简介如下: 一、选择性VEGFR3抑制剂的设计、合成及抗TNBC活性研究 TNBC的转移是一个多步骤、多基因参与的过程,一旦患者发生远端转移常提示预后差,生存时间短,远端转移也是晚期TNBC的主要致死原因。淋巴管生成和重塑在TNBC的远端转移过程中发挥关键作用,原发肿瘤通过异常生成的瘤周淋巴管与淋巴结进行连接,促进肿瘤细胞进入淋巴结、全身循环和远端转移。诸多研究表明抗VEGFR通路介导的淋巴管生成是TNBC转移治疗领域富有潜力的策略。相对于同家族的VEGFR1/2,VEGFR3在TNBC转移相关的淋巴管生成过程中发挥着关键作用,是抗TNBC转移的一个潜力靶标。目前,国内外针对VEGFR3进行选择性抑制剂的药物设计还较少,尚无进入临床试验阶段的候选药物。SAR131675是唯一被报道的选择性VEGFR3抑制剂,体内研究表明其能够有效地抑制淋巴结侵袭和肺部转移,但其低体内药效和积蓄毒性,阻碍了它的进一步临床评估。研究发现SAR131675结构中的乙炔基团通过烷基化CYP450的合成血红素生色基团或关键残基,使肝脏CYP450酶失活,从而不可逆地抑制药物代谢系统,造成累积性毒性。因此,有必要研发具有更高亲和力、更高选择性,更好安全性的VEGFR3抑制剂。 在本章中,我们通过对活性小分子库进行VEGFR3激酶抑制活性随机筛选,以此确定了具有中等抑制活性的苗头化合物1,其对VEGFR3酶水平抑制活性(IC50)为3.5μM。紧接着,我们通过分子对接研究化合物1与VEGFR3的结合模式,以此对化合物1的结构进行优化和构效关系研究。第一步,通过对化合物1的噻吩并[2,3-d]嘧啶环骨架进行骨架跃迁,我们锁定噻吩并[2,3-d]嘧啶为优势骨架结构;第二步,我们对噻吩并[2,3-d]嘧啶的6位取代部分进行详细考察,找到N-甲基-4-（对苯基）哌嗪取代能够使生物活性显著提升;第三步,我们对噻吩并[2,3-d]嘧啶的2位取代部分进行探究,发现在该位置引入疏水基团可以提高抗增殖活性,但不利于VEGFR3抑制活性;第四步,我们对链接基团哌嗪进行结构修饰,以此考察对生物活性的影响。构效研究发现,对哌嗪基团的结构修饰会导致哌嗪发生不利于分子与蛋白结合的构象变化;最后,我们对头部基团进行优化,发现引入含有脲基的大位阻基团能够显著提高生物活性。整个研究过程共计合成52个化合物,最终发现优选化合物22k,该化合物对VEGFR3酶水平抑制活性为110.4 n M,并具有较优的抗TNBC细胞增殖活性(MDA-MB-231,IC50=2.2μM;MDA-MB-436,IC50=3.5μM)。另外,化合物22k对VEGFR3具有良好的选择性(VEGFR1,IC50>10μM;VEGFR2,IC50>10μM),优于阳性对照SAR131675(VEGFR1,IC50=3100 n M;VEGFR2,IC50=220 n M)。此外,化合物22k具有可接受的口服药代性质,口服生物利用度达到30.9%。 随后,我们利用多种分子生物学实验对化合物22k的作用机制及体内药效进行深入研究。体外机制研究表明,在VEGFC诱导的人表皮淋巴管内皮细胞HDLEC中,22k通过靶向VEGFR3抑制细胞迁移和淋

关键词： 三阴性乳腺癌   Pin1-YAP/TAZ信号通路   华蟾素注射液  

摘要： 三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌中最具侵袭性的分子亚型。其特征是孕激素受体(progesterone receptor,PR)、雌激素受体(estrogen receptor,ER)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)不表达。国内外目前主要采用放、化疗的方式进行治疗,但毒副作用明显,而且化疗药物容易产生耐药性。因此,迫切需要使用更有效、毒性更小的药物来治疗TNBC。中药在肿瘤的预防和治疗方面具有独特的优势,中药复方中蕴含多种活性成分,可通过多个靶点、多种途径发挥增效作用,且作用温和。华蟾素注射液(cinobufacini injection,CI)是由中华大蟾蜍皮加工制成的,微黄色或淡黄色的水溶性制剂,具有抗癌谱广、高效低毒的特点。临床上用于包括TNBC在内的多种肿瘤的治疗,但其分子机制及作用靶点尚不明确。Pin1-YAP/TAZ是近年来研发抗肿瘤药物的热点信号通路。其中,肽基脯氨酰顺反异构酶NIMA相互作用蛋白1(peptidylprolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1,Pin1)被认为是一种新的诊断TNBC的生物标志物,Yes相关蛋白(Yes-Associated Protein,YAP)/PDZ结合域的转录共刺激因子(transcriptional co-activator with PDZbinding motif,TAZ),作为Hippo通路的两个核心成分在肿瘤发生和耐药性中起关键作用。有研究发现,在TNBC中Pin1可以与YAP/TAZ相互作用,提示靶向Pin1-YAP/TAZ信号通路的药物,可能有助于TNBC的临床治疗。首先,研究华蟾素注射液在体内外对TNBC的影响。动物实验表明,华蟾素注射液对荷瘤小鼠肿瘤起到抑制生长的作用,与阿霉素相比,华蟾素注射液对小鼠的体重、脏器没有影响,提示药物的毒副作用小;TNBC细胞的CCK8、克隆形成实验表明,华蟾素注射液可以抑制人源的MDA-MB-231细胞和鼠源的4T1细胞的增殖,且具有一定的时间、剂量依赖性;通过流式细胞分析术进行细胞凋亡、周期检测,结果表明华蟾素注射液可以诱导TNBC细胞周期阻滞,使MDA-MB-231细胞在G2/M期受到阻滞,4T1细胞在S期受到阻滞,最终诱导TNBC细胞发生凋亡;western blot的结果证实,华蟾素注射液通过下调CDK1、CDK2和Bcl-2/Bax蛋白水平,诱导细胞发生周期阻滞和凋亡。其次,基于癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库进行临床数据挖掘,结果表明,与正常组织相比,Pin1和TAZ在乳腺癌中过表达;与其他乳腺癌相比,晚期乳腺癌中Pin1和TAZ的表达水平升高,在第4期最为显著;与正常组织以及其他乳腺癌亚型的组织相比,Pin1和TAZ在TNBC中表达更高,表达水平与生存率负相关。尽管YAP的表达在TNBC患者中不是最高的,但在TNBC患者中,YAP表达越高,患者生存率也越低。利用免疫组织化学法将虚拟数据与现实世界的真实病例对接,结果显示,TNBC组织中Pin1、YAP和TAZ的阳性表达率分别为60%、56%和56%,与癌旁组织相比,在TNBC组织中Pin1和TAZ阳性表达率显著升高(P<0.05),YAP升高,但无显著差异(P>0.05),Pin1、YAP、TAZ的表达与一些临床病理特征无关,如肿瘤分期、有无淋巴转移等(P>0.05)。相关性分析表明,TNBC患者组织中Pin1与YAP(r=0.577,P<0.05)、TAZ(r=0.645,P<0.05)的表达均呈显著正相关关系。为了进一步明确Pin1与YAP、TAZ的相关性,在TNBC细胞采用si RNA的方法敲减Pin1后,YAP、TAZ的表达明显下调。上述实验结果提示,Pin1-YAP/TAZ是TNBC的核心信号通路之一。最后,研究华蟾素注射液抗TNBC的分子机制。RNA-seq结果表明,华蟾素注射液可以影响TNBC中的多种信号通路,其抗TNBC的作用机制可能与调控Pin1-YAP/TAZ信号通路相关。Western blot结果显示华蟾素注射液不仅能够下调TNBC细胞系MDA-MB-231和4T1细胞中Pin1、YAP、TAZ的表达,还可以下调TNBC肿瘤中Pin1、YAP、TAZ的表达,这些结果表明华蟾素注射液通过抑制Pin1-YAP/TAZ信号通路,发挥抗TNBC的作用。综上所述,我们采用体内、外实验,明确了华蟾素注射液通过诱导细胞周期阻滞和凋亡发挥抗TNBC的药效;综合运用TCGA数据库和转录组学技术,探讨了其潜在的分子机制;本研

关键词： 三阴性乳腺癌   化学蛋白质组学   灵芝小分子   天然产物探针   靶标蛋白  

摘要： 研究目的:乳腺癌（Breast cancer,BC）是一种严重威胁全球女性健康和生命的恶性肿瘤,号称“女性健康第一杀手”。三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）是乳腺癌中恶性程度最高的亚型,因其具有高异质性、高侵袭性、高复发率和高病死率,已成为近年来医药界研究和关注的焦点。由于TNBC缺乏有效的靶点,因此治疗TNBC失去了靶向治疗的机会,而且用于TNBC治疗的药物非常稀缺,临床几乎没有可选药物。中药天然产物分子以其结构独特性和多样性,为TNBC的药物筛选提供了丰富来源,将中药天然产物分子探针化可为发现新的抗TNBC靶点提供良好策略。本研究选用具有抗TNBC活性的灵芝小分子LZ-22为目标,主要探讨LZ-22在体内外的抗TNBC的生物活性,运用化学蛋白质组学（Chemical proteomics）研究的技术思路、利用探针（probe）进行靶标蛋白的垂钓与验证,为TNBC的治疗发现新靶点,为新药研发提供临床前实验依据,弥补化疗和免疫疗法的缺陷,为肿瘤的治疗提供新策略。 研究方法:***-MB-231细胞和斑马鱼模型检测LZ-22抗TNBC活性;***8和克隆形成等方法比较LZ-22与小分子探针045的抗TNBC活性;***方法检测045对MDA-MB-231活细胞全蛋白的标记并进行Pull down,运用Proteome Discoverer 1.3对LC-MS/MS蛋白组学数据分析筛选候选靶蛋白;*** RNA干扰实验验证候选靶蛋白功能,确定LZ-22靶蛋白;***-PAGE法、SPR技术和细胞中激光共聚焦实验检验LZ-22与靶蛋白的结合;6.分子对接分析LZ-22与靶蛋白的结合口袋。 研究结果:LZ-22选择性抑制MDA-MB-231细胞生长而不影响正常乳腺细胞,抑制克隆形成,阻滞细胞周期在S期;在斑马鱼动物模型上,LZ-22在低至0.078μM时对MDA-MB-231的抑制能力便强于50μM的顺铂;探针045具有和原型化合物LZ-22相似的抗癌生物活性;探针的标记效率极高,且和LZ-22存在竞争抑制现象;结合Pull down后的质谱信息,经Western Blot验证得到可能的候选靶标蛋白PABPC1、CAPN2、HSPA1B;敲低PABPC1抑制细胞生长,且LZ-22的药效减弱,以此为依据确定了PABPC1为真实靶标;LZ-22直接靶向该蛋白形成共价连接,亲和力为-8.1 kcal/mol,KD值为4.071×10-6M。 研究结论:LZ-22具有良好的抗TNBC活性,探针045鉴定到了靶蛋白PABPC1,为抗TNBC提供了新靶点,为后续以此靶点为基础筛选其他活性分子或药物奠定了基础。本项目为中药天然分子抗肿瘤靶点的识别与鉴定提供了新的案例。

关键词： 三阴性乳腺癌   光动力治疗   光敏脂质体   低氧激活药物   细胞外小囊泡   免疫原性细胞死亡   肿瘤免疫微环境  

摘要： 背景:乳腺癌是目前世界上发病率最高的恶性肿瘤。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)作为乳腺癌中侵袭性最强的病理类型,占乳腺癌中的15%-20%。由于TNBC缺乏雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)、人类表皮生长因子受体 2(humanepidermal growthfactorreceptor2,HER-2),故其对内分泌治疗或者 HER-2治疗不敏感,缺乏标准化治疗方案。目前新辅助化疗(neoadjuvantchemotherapy,NAC)是TNBC的主要治疗手段,但NAC治疗时TNBC患者总体生存率依然较低,容易耐药,亟需寻找新疗法以拓宽TNBC治疗上的选择。光动力治疗(photodynamictherapy,PDT)是一种新型非侵入性临床治疗手段,现已有数款光敏剂被多国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准用于临床治疗,有望成为TNBC患者治疗新选项。PDT通过生成活性氧(reactive oxygen species,ROS)杀伤肿瘤细胞,但其缺陷在于易受肿瘤组织内氧浓度影响,即低氧区域无法产生足够的ROS会降低疗效。针对这一治疗瓶颈问题,我们认为可通过药物与PDT协同作用,以弥补PDT在肿瘤低氧区疗效不佳的缺陷。我们设想将低氧激活型药物TH302与PDT同时应用,利用TH302可受低氧条件激活而产生细胞毒的特性,改善肿瘤组织低氧区的疗效。因此,本论文第一部分研究主要涉及创建PDT联合TH302的治疗手段并观察其对TNBC的疗效,我们利用壳寡糖(chitosan oligosaccharide,CO)修饰的脂质体包载所选用的光敏剂HPPH及TH302并靶向TNBC,提高递药效率与治疗效果。已知PDT产生ROS高效杀伤肿瘤细胞的同时还能通过诱导免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death,ICD)来提高肿瘤免疫原性;也已发现PDT诱导ICD可提高TNBC免疫原性,将TNBC从“冷肿瘤”变为“热肿瘤”。然而,TNBC免疫原性提高后,TNBC免疫微环境中的抑制性免疫细胞依然会阻碍体内免疫系统对肿瘤细胞的杀伤效应,TNBC来源的细胞外小囊泡(small extracellular vesicles,sEVs)则会刺激抑制性免疫细胞活化及扩增。针对这一治疗瓶颈问题,我们认为利用PDT诱导TNBC发生ICD,同时减少TNBC细胞本身分泌的sEVs及PDT刺激TNBC细胞产生的sEVs,能改善TNBC肿瘤免疫微环境、提高抗肿瘤免疫效应。我们设想用中性鞘磷脂酶抑制剂GW4869阻遏TNBC分泌sEVs,与PDT诱导ICD协同作用提高体内抗TNBC免疫反应。因此,本论文第二部分研究主要涉及创建PDT联合GW4869的治疗手段并观察其对TNBC的疗效,我们采用原代BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)来源的sEVs作为递药载体,提高所选用的光敏剂Ce6及GW4869的肿瘤区域递药效率与治疗效果。目的:第一部分:制备新型纳米光敏脂质体CO-HPPH-TH302/Lipo,验证CO修饰脂质体的TNBC细胞靶向性及CO-HPPH-TH302/Lipo的抗TNBC疗效,为TNBC治疗提供新策略和新手段。第二部分:制备新型免疫调节型光敏纳米囊泡Ce6-GW4869/sEVs,验证Ce6-GW4869/sEVs的TNBC细胞靶向性及改善TNBC免疫微环境的效应,进一步为TNBC治疗提供新策略与新途径。方法:第一部分:利用“薄膜水化法”和“后插入法”制备CO-HPPH-TH302/Lipo。对该脂质体进行表征:(1)用Zeta-Plusanalyzer粒径及电位检测仪检测脂质体的水合粒径和Zeta电位并评价脂质体的稳定性;(2)用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察脂质体的形态;(3)用紫外可见光分光光度计检测脂质体的紫外可见光吸收光谱并评价药物包封率;(4)用示差热分析仪(differential scanning calorimetry,DSC)检测脂质体的相变温度。通过SOSG试剂盒、电子自旋共振波谱仪检测离体状态下脂质体ROS生成量;用ROS检测试剂盒(DCFH-DA探针)检测脂质体在细胞内ROS生成量。利用细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)试剂检测PDT和TH302的IC50,为后续体外实验选定药物浓度提供依据。CO-HPPH-TH302/Lipo体外实验方面,通过激光共聚

关键词： 三阴性乳腺癌   戊曲酯   紫堇灵   乳腺癌   MS4A1   脂质代谢   肿瘤免疫微环境  

摘要： 近年来,乳腺癌的发病率始终居高不下,其病例居全球新发癌症患者总数量之首,对女性造成的身心伤害极大。三阴性乳腺癌则是其中恶性程度极高的一种类型,发病年龄早,恶性程度高,易扩散转移,且极易发生化疗抵抗,目前现有的治疗手段治疗效果差强人意。戊曲酯,是一种提取自植物缬草的天然化合物,缬草为多年生草本植物,广泛分布于我国东北至西南的多数地区。既往研究发现,戊曲酯除了具有良好的抗癫痫作用外,还可以对肝癌,肺癌,胰腺癌以及前列腺癌等发挥抑制作用,然而其对三阴性乳腺癌的作用尚未见报道。我们通过对天然化合物库的筛选,确定戊曲酯可以对三阴性乳腺癌细胞发挥抑制作用。为了明确戊曲酯对三阴性乳腺癌的具体影响,我们采用CCK-8法,Western blot,流式细胞检测技术,Transwell实验等探究了戊曲酯对三阴性乳腺癌细胞增殖,干性,凋亡以及侵袭转移方面的影响,发现戊曲酯可以抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖,干性以及侵袭转移能力,并可以促进其凋亡。进一步地,为了探究戊曲酯发挥药用的机制,我们采用了 RNA-Seq测序,并对实验组和对照组的差异表达基因进行了通路富集分析。另一方面,对公共数据库(GEO数据库)数据的分析,得到三阴性乳腺癌组织和正常组织的差异表达基因,进行通路富集分析。最终选择同时存在于RNA-Seq测序富集分析结果和公共数据库富集分析结果的通路——MAPK通路,作为实验验证对象。JNK和P38通路是MAPK通路的重要组成部分,其主要与细胞生长停滞和细胞凋亡相关,并且与许多肿瘤的发生发展息息相关,所以选择JNK和P38进行检测。通过实验验证发现,经戊曲酯处理后,三阴性乳腺癌细胞中的P-JNK和P-P38表达量增加,JNK和P38通路被激活,因此,可推测激活JNK和P38可能是戊曲酯发挥对三阴性乳腺癌抑制作用的制之一。采用类似的方法,我们对另一种药物——紫堇灵(提取自传统中药苦地丁)也进行了抗三阴性乳腺癌活性的研究。综上所述,通过对天然化合物库的筛选,我们发现,戊曲酯可抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖,并可抑制其细胞的干性与侵袭转移能力,同时促进三阴性乳腺癌细胞的凋亡;紫堇灵可抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖,并可抑制其细胞的干性,同时促进三阴性乳腺癌细胞的凋亡经初步探究,我们推测激活JNK和P38通路可能是戊曲酯发挥抗三阴性乳腺癌作用的机制之一,而调节氧化磷酸化通路则可能是紫堇灵发挥抗三阴性乳腺癌活性的机制之一。本研究为开发治疗三阴性乳腺癌的新药物奠定了基础,为三阴性乳腺癌的治疗提供了新的方法与思路,并有望改善三阴性乳腺癌患者的化疗抵抗,改善患者的生存预后,具有非常重要的意义。目前,乳腺癌的发病率居于众多癌症之首,严重危害着女性的身体和心理健康。寻找新的生物学标志物对乳腺癌患者进行早期分期,并且进行及时的干预,这对于改善乳腺癌患者的预后具有十分重要的意义。以往的研究已经可以证明,脂质代谢与乳腺癌患者的预后有关,及时纠正患者的脂质代谢紊乱可以延长患者的生存期,改善患者的预后;而肿瘤免疫微环境(TIME)在肿瘤的发生和发展中也起着非常重要的作用。但脂质代谢与肿瘤免疫微环境两者之间的具体关系,以及二者之间的动态调节仍然是一个尚未被阐明的问题。本研究使用HALLMARK数据库中与脂质代谢相关的四条通路,对TCGA数据库中980例乳腺癌样本进行评分,通过评分分数的高低进行分组,寻找两个分组之间的差异表达基因(DEGs)。进一步地,通过生存分析和COX回归分析筛选候选的差异表达基因,最终将对预后具有保护作用的MS4A1作为进一步分析的对象。经过深入的分析发现,MS4A1的表达与患者的年龄、临床分期、肿瘤的大小和远处转移均呈现负相关的关系。在MS4A1高表达组中,样本的大部分基因均富集于免疫相关的通路;另外,经CIBERSORT算法分析发现,MS4A1的表达与10种免疫细胞的丰度呈现正相关的关系,如CD8+T细胞,这提示MS4A1的高表达与免疫活化相关。综上所述,MS4A1的表达不仅可以提示乳腺癌患者的脂质代谢的情况,还可以反映其肿瘤免疫微环境的状况,并且对患者的生存预后具有保护作用。通过本研究,我们发现,MS4A1有可能成为预测预后的独立指标,并可以作为提示乳腺癌患者脂质代谢情况与免疫状态的新的潜在生物标志物。MS4A1的发现,有助于对患者进行早期分类与早期干预,有利于医生采取对患者最适宜的治疗方案,来改善患者的预后,同时也可以对患者的预后起到一定的预测作用,对临床治疗与临床决策具有重要的意义。

关键词： 三阴性乳腺癌   PD-1/PD-L1   近红外二区荧光   磁共振   双模态分子影像   疗效监测  

摘要： 背景:三阴性乳腺癌(TNBC)分化及预后差、侵袭能力强。近期研究表明免疫检查点阻断治疗(ICBT)可以提高TNBC的病理完全缓解和生存率,有望成为该亚型乳腺癌有效的治疗策略。然而,ICBT仅有20%-30%有效率。因此,如何筛选ICBT可能的获益者是TNBC治疗最受关注的问题。许多研究表明PD-L1在肿瘤微环境的阳性表达情况与良好愈后相关,目前免疫组化(IHC)是检测PD-L1表达的常规方法,然而IHC存在以下弊端:为有创的检测方法;无法实现动态监测;不同抗体的检测平台判读标准及方法存在差异。有研究证明利用放射性核素可检测肿瘤PD-L1表达情况并预测PD-1/PD-L1疗效,然而由于其放射性难以满足连续动态检测的临床需求。多模态成像技术因融合多种模态成像技术的优势,可满足在体、动态监测PD-L1表达水平,并有望提高ICBT疗效评估的准确性。目的:构建靶向PD-L1的高特异性、低背景荧光/核磁双模态成像分子探针,探索在体预测ICBT疗效的更有效方法。方法:1、利用电镜、吸收、发射光谱及T1弛豫时间对探针的形态、荧光、核磁性能进行表征。2、在细胞水平利用CCK8实验验证探针的安全性,利用未带靶的对照探针、不同PD-L1表达的细胞以及竞争性抑制实验验证探针靶向性。3、在小动物水平利用未带靶探针、竞争性抑制以及不同表达水平的肿瘤验证NPs-Ate靶向性4、在小动物水平分别进行PD-1联合化疗、放疗及INF-γ联合治疗,在体监测在治疗过程中PD-L1表达及小鼠愈后。结果:1、成功合成了荧光/核磁双模态靶向PD-L1的探针GdDTPA-HSA@ICG-Atezoilzumab(NPs-Ate),其大小均一,粒径约7nm,具有良好的荧光和磁共振特性,在近红外二区可见荧光拖尾信号。2、NPs-Ate在细胞及小动物水平均表现出良好的靶向性,有良好的生物相容性。人乳腺癌移植瘤模型中,36小时的信号背景比(SBR)最高,达到11.51。经过游离抗体阻断后较阻断前摄取减少34.2%,小鼠异位移植瘤模型及磁共振也观察到类似的结果。3、在小动物水平,NPs-Ate可以无创反映INF-γ、放疗、化疗干预后引起的PD-L1表达水平升高,以及联合免疫治疗PD-L1后的增加,该增加与免疫治疗疗效相关。结论:基于靶向PD-L1的NPs-Ate荧光/核磁双模态成像可以监测小鼠PD-L1在治疗中的变化、预测PD-1/PD-L1疗效,可能成为无创动态检测乳腺癌PD-L1表达的有力工具。

关键词： 丁香醛   查尔酮   CKAP2基因   抗癌活性   乳腺癌  

摘要： 背景及目的：三阴性乳腺癌（Triple-negativebreastcancer,TNBC），是乳腺癌亚型中最具侵袭性、高复发率、高死亡率、差预后的一类高度异质性的乳腺恶性肿瘤。由于目前缺乏有效的靶向治疗，其临床治疗仍以化疗为主。但是随着长期用药，肿瘤细胞对化疗药物的敏感性下降，易产生耐药。基于此，本论文合成了一个新型的丁香醛类查尔酮衍生物CSH1，并在分子和细胞水平上阐明其抗三阴性乳腺癌的药理活性及分子作用机制。　　实验方法：通过3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）法测定CSH1对TNBC细胞的毒性;通过集落克隆形成实验和5-乙炔基-2-脱氧尿苷（EdU）染色法测定细胞增殖活性;通过AnnexinV和PI双染的流式细胞（FACS）技术检测细胞凋亡情况;通过PI单染的FACS技术检测细胞周期分布情况;通过免疫荧光（IF）技术检测DNA损伤情况;采用细胞粘附实验和Transwell实验检测细胞粘附、迁移和侵袭能力;通过转录组测序（RNA-seq）检测mRNA转录水平的改变;实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术检测各种mRNA的转录水平;通过CKAP2siRNA转染实验检测CKAP2蛋白的生物学功能;蛋白免疫印迹（WB）实验检测增殖和转移信号通路相关蛋白的表达水平。　　实验结果：CSH1诱导肿瘤细胞DNA损伤并抑制其修复，导致细胞周期阻滞和细胞凋亡。RNA-seq结果表明，由CSH1引起的改变基因中仅有4%的基因与DNA损伤和修复相关，却有近18%的基因与细胞粘附和迁移相关。进一步的实验结果表明，CSH1显著影响FAK的分布及其磷酸化，减弱TNBC细胞与细胞外基质之间的黏附作用并抑制其迁移。机制研究结果表明，CSH1通过抑制CKAP2介导的FAK和STAT3磷酸化信号通路的激活，达到抑制TNBC细胞的增殖、粘附和迁移的效果。　　实验结论：综上所述，我们的结果表明CKAP2介导的FAK和STAT3磷酸化信号通路是治疗TNBC的一个具有临床实际应用价值的靶点，且CSH1是一个潜在的抗TNBC药物。

关键词： 阿尼芬净   伏立诺他   POLR2A   乳腺癌   凋亡   自噬  

摘要： 目的:探讨阿尼芬净(Anidulafungin,ANI)促伏立诺他(Vorinostat,Suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)的抗三阴性乳腺癌细胞作用及其可能机制。方法:通过CCK-8实验检测ANI、SAHA或其联合药物处理MDA-MB-231、MDA-MB-453乳腺癌细胞24小时及48小时的细胞活力,并计算药物联合指数。平板克隆形成实验检测乳腺癌细胞的增殖能力。通过Annexin V/PI双染色流式细胞术和caspase-3活性检测试剂盒检测乳腺癌细胞凋亡。si RNA干扰检测POLR2A在ANI、SAHA抗乳腺癌中的作用,并用CCK-8实验检测POLR2A表达下调后ANI与SAHA处理的乳腺癌细胞活力。Western Blot检测ANI、SAHA、自噬抑制剂巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1,Baf A1)、POLR2A敲低后MDA-MB-231和/或MDA-MB-453细胞凋亡及自噬相关蛋白Bcl-2、Bax、BECLIN1、SQSTM1/p62、LC3蛋白表达水平。结果:ANI、SAHA或其联合药物处理以时间和剂量依赖性的方式抑制MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞的活力,而ANI和SAHA联合药物处理在抗三阴性乳腺癌细胞作用中具有协同效应,同时具有诱导乳腺癌细胞凋亡和自噬作用。POLR2A杂合性缺失的三阴性乳腺癌细胞对ANI、SAHA及其联合药物处理更敏感。ANI、SAHA或其联合药物处理可下调三阴性乳腺癌细胞中POLR2A表达,而敲低POLR2A表达可诱导MDA-MB-231细胞凋亡与自噬,并增强三阴性乳腺癌细胞对ANI与SAHA的敏感性。结论:ANI和SAHA联合应用对三阴性乳腺癌细胞有协同抑制作用。POLR2A杂合性缺失的三阴性乳腺癌细胞对ANI、SAHA及其联合用药更敏感,其机制与ANI、SAHA及其联合用药下调POLR2A表达有关。图7幅,表6个,参考文献88篇

关键词： SIRT3   SIRT3小分子激动剂   三阴性乳腺癌   细胞自噬   心力衰竭   氧化应激  

摘要： Sirtuin 3（SIRT3）是位于线粒体的高度保守的脱乙酰酶,它可将乙酰化底物蛋白赖氨酸侧链的乙酰基转移到NAD+上,产生脱乙酰化的产物,以调控线粒体能量代谢过程。鉴于SIRT3在富含线粒体的高能代谢组织中广泛表达,并很大程度上能影响疾病的进程,因此靶向SIRT3的小分子药物的发现具有非常重要的研究价值。本课题以SIRT3为研究对象,分别阐明两个不同的SIRT3小分子激动剂在三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer,TNBC）和心力衰竭（Heart failure,HF）中的机制,揭示SIRT3去乙酰化作用在不同疾病中的治疗潜力,为靶向SIRT3在人类疾病中的药物发现与应用提供新的线索。 大量的研究发现SIRT3是一种正向细胞自噬调节剂和潜在的可药性靶点,SIRT3的激活可抑制乳腺癌的发生发展。因此,本文对课题组研究发现的SIRT3的小分子激动剂ADTL-SA1512（33c）进行了系统性抗TNBC的药效学及作用机制研究。通过MTT实验、克隆形成实验发现,33c可以抑制TNBC细胞的长期和短期增殖作用。此外,还发现33c可以通过激活SIRT3重新编程TNBC细胞糖代谢,抑制TNBC的Warburg效应。进一步机制研究表明,33c可通过诱导自噬相关性细胞死亡和Parkin/PINK1介导的线粒体自噬来抑制TNBC细胞的迁移和转移。值得注意的是,通过构建MDA-MB-231细胞异种移植瘤模型发现,化合物33c在小鼠体内也表现出良好的肿瘤抑制效果。基于以上结果,我们得出结论:ADTL-SA1512（33c）作为一种特异性SIRT3小分子激动剂,可通过诱导自噬相关性细胞死亡来抑制TNBC细胞的增殖和迁移作用,并且在体内也有很好的抗癌效果。因此,SIRT3小分子激动剂33c可能是治疗TNBC的潜在药物,而激活SIRT3可能是TNBC的潜在治疗策略。 此外,作为线粒体稳态的守护者,SIRT3在心脏病中起着非常重要的作用。SIRT3可调节包括氧化应激在内的多种细胞过程,还可通过去乙酰化SIRT3下游蛋白,参与调节线粒体功能,保护心肌细胞。在本研究中,我们基于课题组发现并定义的SIRT3激活的潜在口袋“Pocket L”,从小分子化合物库中发现了一种新型SIRT3激动剂（2-APQC）,它在HF治疗中表现出色。细胞活力实验发现,2-APQC在异丙肾上腺素（Isoproterenol,ISO）诱导的H9c2心肌细胞损伤模型中具有很好的保护作用。免疫荧光和Western blot检测心肥厚和心肌纤维化相关蛋白发现,2-APQC可以通过激活SIRT3阻断TGF-β/SMAD3通路,改善心肌纤维化的现象,并通过激活Akt/m TOR通路缓解心肌肥大的症状。接下来我们构建了ISO诱导的大鼠HF模型。通过超声心动图来评价大鼠心脏功能;通过血清生化指标评价大鼠心脏损伤程度;通过H&E染色、天狼星红染色、WGA染色、免疫组化染色评价了大鼠心脏心肌肥厚现象和心肌纤维化现象。研究表明:2-APQC在大鼠体内可缓解心肌肥厚、心肌纤维化的反应,进而改善HF。接下来,基于RNA-seq分析了2-APQC在ISO诱导的心衰模型中的差异表达基因,并通过相关实验进行验证发现,2-APQC可激活SIRT3减少ISO诱导的心肌细胞活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的积累和Ca2+的超载。这些结果表明2-APQC是一种靶向SIRT3治疗HF的候选小分子激动剂。 综上,本研究以SIRT3为研究对象,系统性评价本课题组发现的第一个SIRT3小分子激动剂ADTL-SA1512（33c）抗TNBC的治疗潜力,并进一步阐述了ADTL-SA1512（33c）作为SIRT3激动剂诱导线粒体自噬的相关机制,提示SIRT3的激活可能是一种潜在的TNBC治疗策略。此外,基于课题组发现并定义的激活SIRT3的潜在口袋“Pocket L”,在小分子库中筛选得到另一个SIRT3小分子激动剂2-APQC。本研究综合评价了2-APQC抗心衰的治疗潜力,并且基于RNA-seq的分析结果阐明了其靶向SIRT3抗心衰的作用机制。本研究为激动SIRT3的可药性研究提供新的线索,也为新型靶向SIRT3小分子激动剂的成药性研究提供了新的依据。