关键词： 三阴性乳腺癌   PAK1   HDAC6   靶向药物   抗增殖  

摘要： 三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer,TNBC）是乳腺癌中恶性程度最高的亚型,其特点是雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）阴性的同时缺乏原癌基因HER-2的过表达,因异质性高、侵袭性强、远端转移等特点,三阴性乳腺癌的临床治疗已成为乳腺癌研究领域的难点,临床上尚未有有效的治疗方法,常规化疗仍是该亚型临床最主要的治疗手段。鉴于三阴性乳腺癌的高度异质性,常规单靶向药物大多以失败告终,寻找新的双靶治疗靶标并设计合成全新的双靶向小分子已成为三阴性乳腺癌药物研究的热点。 PAK1在肿瘤的整个进程中发挥着重要作用,其几乎参与了肿瘤调控的每一个阶段,包括肿瘤的发生发展、转移、凋亡及耐药等。PAK1的异常过表达与肿瘤患者的生存期呈负相关。HDAC6是组蛋白去乙酰化酶的重要成员之一,HDAC6通过调控组蛋白乙酰化水平来影响肿瘤的发生和增殖、致癌基因和抑癌基因的平衡,当其修饰紊乱时会导致基因表达异常,影响细胞重要的生理功能,进而导致肿瘤的形成。 在本研究中,鉴于PAK1在调节能量代谢和HDAC6在表观遗传修饰方面的重要作用,我们认为双靶向PAK1和HDAC6可能是治疗TNBC的一种有效新策略。本论文基于结构虚拟筛选和协同药效团融合的策略,设计合成了45个以吡啶[2,3d]嘧啶-7（8H）为母核的新型PAK1/HDAC6双靶抑制剂。体外酶活性测试和抗乳腺癌细胞增殖实验结果表明22l是一个新型的强效的PAK1/HDAC6双靶抑制剂,其IC50分别为38.23 n M和13.62 n M,对MDA-MB-231细胞显示出强效的抗增殖作用,IC50为0.9μM。通过分子对接和动力学模拟阐明了化合物22l与PAK1和HDAC6的结合模式及结合自由能。在酶亚型选择性实验中,化合物22l对HDACs和PAKs家族蛋白中的HDAC6和PAK1亚型蛋白具有一定的选择性。化合物22l也能够在MDA-MB-231细胞水平上同时抑制PAK1和HDAC6的活性。SPR和CETSA实验进一步证实了化合物22l对PAK1/HDAC6的靶向性。在TNBC异种移植瘤裸鼠模型中,化合物22l显示出良好的抗肿瘤作用。 综上所述,本论文设计合成了一系列新型的PAK1/HDAC6双靶抑制剂,其中化合物22l是一个选择性的强效的PAK1/HDAC6双靶抑制剂,在体内外均对三阴性乳腺癌显示出治疗活性,这为PAK1/HDAC6双靶抑制剂治疗三阴性乳腺癌提供了候选药物和理论依据。

关键词： 三阴性乳腺癌   细胞周期依赖性激酶7   RNA聚合酶Ⅱ   THZ1   ZJC-11  

摘要： 研究目的 三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）是一种侵袭性乳腺癌,没有雌激素受体（Estrogen receptor,ER）,孕激素受体（progesterone receptor,PR）和人表皮生长因子受体-2（Human epidermal growth factor receptor-2,HER2）的表达。它是一种高度转移的异质性疾病,占乳腺癌总病例的10-15%,与非TNBC病例相比,治疗后五年内预后较差,复发率高。TNBC肿瘤的诊断和亚型对于确定治疗方案并为每个TNBC个体建立个性化,有针对性的药物至关重要。CDK7是细胞周期蛋白家族（Cyclin-dependent kinase,CDK）的重要成员之一,其参与调节多种生物过程,如细胞周期、基因转录和DNA修复。研究显示CDK7在TNBC中显著高表达,与TNBC临床预后显著相关,并形成肿瘤发生的驱动力,因此靶向CDK7可能成为治疗TNBC发生发展有效手段之一。本课题组前期合成并筛选了CDK7抑制剂THZ1的结构改造物——ZJC-11,发现其可能具有抗TNBC作用。因此本研究探究了ZJC-11药物代谢与动力学特征,阐述了ZJC-11对TNBC细胞周期、转录以及DNA修复的影响机制,提供了靶向CDK7可作为抗TNBC的可行性证据,进一步为临床开发更多高效的CDK7抑制剂提供参考。 研究方法 一、CDK7抑制剂ZJC-11的药代动力学及抗TNBC药效学研究 1.通过MTT实验筛选15个THZ1结构改造化合物的抗TNBC细胞活性,得到化合物ZJC-11; 2.通过药代动力学研究ZJC-11的药代动力学特征,KM小鼠单次尾静脉给予10mg/kg ZJC-11和10mg/kg THZ1,在给药后5min、10min、15min、30min、1h、2h取眼眶静脉血,分离得到含药血浆,样品经前处理后采用HPLC/MS检测样品血药浓度,再用DAS 3.0软件计算主要药代动力学参数(如t1/2、AUC、CL等),并拟合药时曲线。 3.通过MTT检测ZJC-11对TNBC细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-468）与ER/PR+细胞系（ZR-75-1）细胞活力的影响; 4.通过细胞克隆和明场下观察ZJC-11对TNBC细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-468）与ER/PR+细胞系（ZR-75-1）细胞增殖和细胞形态的影响; 5.通过流式细胞术和荧光检测ZJC-11对TNBC细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-468）与ER/PR+细胞系（ZR-75-1）细胞死亡的诱导作用; 6.通过流式细胞术检测ZJC-11对TNBC细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-468）与ER/PR+细胞系（ZR-75-1）细胞周期和细胞活性的影响; 7.通过Western Blot检测ZJC-11对TNBC细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-468）、ER/PR+细胞系（ZR-75-1）以及肿瘤组织中CDK7和RNAPII的磷酸化蛋白水平的影响; 8.通过建立BALB/c裸鼠体内MDA-MB-231细胞原位移植瘤模型,腹腔注射给予4mg/kg和8mg/kg ZJC-11,观察ZJC-11对裸鼠肿瘤生长及体重的影响; 9.通过免疫组化检测ZJC-11对细胞增殖标志物Ki67的影响。 二、CDK7抑制剂ZJC-11抗TNBC的机制研究 1.通过体外激酶活性实验检测ZJC-11对CDK2、CDK7以及CDK9的选择性抑制作用; 2.通过分子对接模型验证ZJC-11与CDK7的结合作用; 3.通过转录组学分析ZJC-11对TNBC细胞系（MDA-MB-231）基因转录的影响; 4.通过Reactome富集分析探究ZJC-11诱导细胞衰老的作用。 研究结果 一、CDK7抑制剂ZJC-11的药代动力学及抗TNBC药效学研究 1.通过对15个化合物的抗TNBC活性筛选发现,ZJC-11能够抑制MDA-MB-231细胞活力,且IC50均高于其余化合物; 2.药代动力学实验结果显示,与THZ1相比,ZJC-11的AUC、C0、Cmax明显较高,而Tmax较低,这表明ZJC-11在血浆中暴露量比THZ1大。相反,ZJC-11的Vd和CL更低,这表明了ZJC-11的清除率更高,并且其在体内的分布更窄。 ***实验结果表明,相比ER/PR+乳腺癌细胞ZR-75-1,ZJC-11分别处理TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468 48h和72h后能显著降低细胞活力,并且具有较好的时间依赖性和剂量依赖性; 4.细胞克隆实验及明场观察细胞结果表明,相比ER/PR+乳腺癌细胞ZR-75-1,ZJC-11能显著改变TNBC细胞MDA-MB-

关键词： 三阴性乳腺癌   细胞周期蛋白依赖性激酶7   N76-1   细胞周期，凋亡  

摘要： 1背景: 目前,乳腺癌的治疗手段主要包括手术治疗、化疗、放疗、内分泌治疗和靶向治疗。然而,三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)因缺乏雌激素受体(Estrogen receptor,ER)、孕激素受体(Progesterone receptor,PR)、人表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER2)的表达,对靶向治疗或内分泌治疗几乎无效,除化疗外尚无其他有效的全身治疗措施。但是,遗传高度特异性的TNBC具有相对统一的转录程序,该程序异常依赖于细胞周期蛋白依赖性激酶7(Cyclin dependent kinases 7,CDK7)。因此CDK7被认为是TNBC有潜力的治疗靶点,CDK7抑制剂的开发对TNBC有效治疗策略的研发具有重要意义。在这项研究中,我们通过将共价CDK7抑制剂THZ1的侧链连接到ALK抑制剂色瑞替尼的母核,获得了新型CDK7的抑制剂N76-1。本研究旨在阐明N76-1抗TNBC的作用和潜在机制,以期为TNBC新药开发提供新的策略和研究基础。 方法: 一、CDK7抑制剂N76-1抗TNBC作用研究 1.以TNBC乳腺癌细胞系MDA-MB-231、CAL-148、MFM-223细胞和ER+乳腺癌细胞系ZR-75-1为研究对象,采用MTT实验以及平板克隆实验检测N76-1对TNBC细胞活力和增殖的影响; 2.高内涵细胞成像系统分析N76-1对TNBC细胞迁移的影响; 3.采用流式细胞术检测N76-1对MDA-MB-231、CAL-148和MFM-223细胞周期的影响;Western blot检测N76-1对细胞周期相关蛋白:细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(Cyclin-dependent kinase 1,CDK1)及磷酸化CDK1(p-CDK1)表达的影响; 4.采用流式细胞术检测N76-1对MDA-MB-231、CAL-148和MFM-223细胞凋亡的影响;Western blot检测N76-1对细胞凋亡相关蛋白:多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(Poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)、Cleaved-PARP、胱天蛋白酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase3,Caspase3)、Cleaved-Caspase3表达的影响; 5.4周龄KM小鼠,尾静脉注射N76-1(3mg/kg)和THZ1(3mg/kg)后,不同时间点取血,并分离淡黄色含药血浆,使用液质联用色谱检测血药浓度,分析N76-1和THZ1在小鼠体内的代谢情况。 6.建立MDA-MB-231细胞株裸鼠原位移植瘤模型,以每天两次的频率腹腔注射阳性对照THZ1(10mg/kg)以及N76-1(4 mg/kg和2mg/kg)共21天,评估N76-1体内抗肿瘤作用; 7.苏木精—伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)检测N76-1对裸鼠脏器生理结构的影响;免疫组织化学染色(Immunohistochemistry staining,IHC)检测N76-1对裸鼠原位移植瘤Ki67表达水平的影响。 二、N76-1抗TNBC作用机制研究 1.蛋白激酶实验检测N76-1对细胞周期蛋白依赖性激酶1(Cyclin-dependent kinase 1,CDK1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(Cyclin-dependent kinase 2,CDK2)、CDK7细胞周期蛋白依赖性激酶9(Cyclin-dependent kinase 9,CDK9)和细胞周期蛋白依赖性激酶12(Cyclin-dependent kinase 12,CDK12)5个激酶的半抑制浓度,初步评估N76-1的靶点选择性;Western blot检测N76-1对CDK7蛋白表达水平和CDK7下游蛋白RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase II,RNAPⅡ)的表达水平及其磷酸化水平的影响; 2.使用分子对接预测N76-1与CDK7的结合位点以及结合能;细胞热转移分析(Cellular Thermal Shift Assay,CETSA)实验检测N76-1与CDK7结合作用; 3.使用si RNA敲低CDK7,流式细胞术检测CDK7和N76-1对TNBC细胞细胞活力、周期和凋亡的影响; 4.N76-1处理三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞48 h,收集细胞,提取RNA,经转录组学测序,分析N76-1对MDA-MB-231细胞全基因组转录水平的影响;Reactome富集分析、GO富集分析和GSEA富集分析N76-1调控的三阴性乳腺癌的可能作用机制并检测关

关键词： 三阴性乳腺癌   丹参酮ⅡA   G蛋白偶联雌激素受体   细胞迁移   基质金属蛋白酶9  

摘要： 目的:基于体外细胞实验,探索丹参酮ⅡA对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移的抑制作用及其分子机制。方法:选取三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231,利用细胞增殖实验检测丹参酮ⅡA对MDA-MB-231细胞增殖的作用,并筛选适宜的药物浓度;应用划痕实验检测丹参酮ⅡA对MDA-MB-231细胞迁移率的影响;Western Blot法检测丹参酮ⅡA对G蛋白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor,GPER)及基质金属蛋白酶9(Matrix metalloprotein-9,MMP-9)表达的影响。结果:细胞增殖实验结果显示,丹参酮ⅡA可以抑制MDA-MB-231细胞增殖,且呈剂量依赖性(P<0.05);划痕实验结果显示,丹参酮ⅡA可以抑制MDA-MB-231细胞迁移,且呈剂量依赖性(P<0.01),加入GPER特异性抑制剂G15后迁移率有所上升(P<0.01)。Western Blot结果显示,丹参酮ⅡA可以显著下调GPER和MMP-9蛋白的表达水平并呈剂量依赖性(P<0.05),加入GPER特异性抑制剂G15后,MMP-9表达有所上升(P<0.01)。结论:丹参酮ⅡA可以抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移,其机制可能与抑制GPER介导的MMP-9表达相关。

关键词： 补骨脂乙素   三阴性乳腺癌   SIRT2   氧化应激   周期阻滞  

摘要： 目的:补骨脂乙素（IBC）是一种天然查尔酮,本课题旨在研究IBC对三阴性乳腺癌的细胞毒性,并对其在体内外抗三阴性乳腺癌作用及分子机制进行探索。 方法:1.利用MTT法检测IBC对乳腺癌细胞的细胞毒性,并计算其IC50。2.运用酶活性检测和分子对接实验确定IBC作用的分子靶点。3.利用蛋白免疫印迹实验检测IBC对乳腺癌细胞内蛋白信号的调控作用。4.运用Hoechst 33258染色和Annexin V-FITC/PI染色检测IBC对乳腺癌细胞造成的细胞核形态变化和凋亡百分比。5.利用流式细胞术检测IBC对活性氧（ROS）生成和细胞周期阻滞的影响,并探讨二者的关系。6.利用MDA-MB-231细胞异种移植鼠模型评价IBC对乳腺癌细胞的体内活性作用,并确定其量效关系。7.通过免疫组织化学、组织病理学检测等方法,评估了IBC体内抗乳腺癌的有效性和安全性。 结果:***以剂量依赖方式抑制TNBC细胞MDA-MB-231增殖,IC50为9.63±1.58μM。***能在SITR2活性袋中与VAL233和ALA1352氨基酸的氨基以氢键作用力的方式结合。在亚微摩尔浓度下抑制SIRT2酶活性,IC50为0.84±0.39μM。3.蛋白分子印迹结果显示,IBC可以使α-tubulin的乙酰化水平升高,而P-STAT3和C-myc的表达显著降低。*** 33258染色结果表明,IBC可导致MDA-MB-231细胞的细胞核萎缩,凋亡小体数目增多。Annexin V-FITC/PI染色进一步验证了IBC可诱导细胞凋亡,凋亡细胞比例由6.74±1.05%增加到47.32±4.86%。5.流式细胞仪检测结果显示,IBC能明显诱导MDA-MB-231细胞中ROS生成,IBC治疗组S期细胞数量从29.3±3.60%增加到36.2±6.01%,导致细胞周期阻滞在S期。抗氧化剂NAC能明显逆转S期阻滞效应,产生G0/G1期阻滞。6.在对MDA-MB-231细胞异种移植小鼠模型给药12天后,IBC对小鼠肿瘤生长有显著的抑制作用,30 mg/kg和60 mg/kg IBC治疗组的抑制率分别为25%和53%。7.免疫组化结果显示,高剂量IBC处理组的Ki67+细胞比例显著降低,TUNEL+细胞明显增多。提示IBC对小鼠体内三阴性乳腺癌细胞具有抑制增殖和促进凋亡作用。 结论:补骨脂乙素能通过靶向抑制SIRT2去乙酰化活性和诱导ROS产生从而诱导三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞凋亡和周期阻滞,对人MDA-MB-231异种移植小鼠肿瘤模型有较好的抑制作用。

关键词： 三阴性乳腺癌   Pin1-YAP/TAZ信号通路   华蟾素注射液  

摘要： 三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌中最具侵袭性的分子亚型。其特征是孕激素受体(progesterone receptor,PR)、雌激素受体(estrogen receptor,ER)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)不表达。国内外目前主要采用放、化疗的方式进行治疗,但毒副作用明显,而且化疗药物容易产生耐药性。因此,迫切需要使用更有效、毒性更小的药物来治疗TNBC。中药在肿瘤的预防和治疗方面具有独特的优势,中药复方中蕴含多种活性成分,可通过多个靶点、多种途径发挥增效作用,且作用温和。华蟾素注射液(cinobufacini injection,CI)是由中华大蟾蜍皮加工制成的,微黄色或淡黄色的水溶性制剂,具有抗癌谱广、高效低毒的特点。临床上用于包括TNBC在内的多种肿瘤的治疗,但其分子机制及作用靶点尚不明确。Pin1-YAP/TAZ是近年来研发抗肿瘤药物的热点信号通路。其中,肽基脯氨酰顺反异构酶NIMA相互作用蛋白1(peptidylprolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1,Pin1)被认为是一种新的诊断TNBC的生物标志物,Yes相关蛋白(Yes-Associated Protein,YAP)/PDZ结合域的转录共刺激因子(transcriptional co-activator with PDZbinding motif,TAZ),作为Hippo通路的两个核心成分在肿瘤发生和耐药性中起关键作用。有研究发现,在TNBC中Pin1可以与YAP/TAZ相互作用,提示靶向Pin1-YAP/TAZ信号通路的药物,可能有助于TNBC的临床治疗。首先,研究华蟾素注射液在体内外对TNBC的影响。动物实验表明,华蟾素注射液对荷瘤小鼠肿瘤起到抑制生长的作用,与阿霉素相比,华蟾素注射液对小鼠的体重、脏器没有影响,提示药物的毒副作用小;TNBC细胞的CCK8、克隆形成实验表明,华蟾素注射液可以抑制人源的MDA-MB-231细胞和鼠源的4T1细胞的增殖,且具有一定的时间、剂量依赖性;通过流式细胞分析术进行细胞凋亡、周期检测,结果表明华蟾素注射液可以诱导TNBC细胞周期阻滞,使MDA-MB-231细胞在G2/M期受到阻滞,4T1细胞在S期受到阻滞,最终诱导TNBC细胞发生凋亡;western blot的结果证实,华蟾素注射液通过下调CDK1、CDK2和Bcl-2/Bax蛋白水平,诱导细胞发生周期阻滞和凋亡。其次,基于癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库进行临床数据挖掘,结果表明,与正常组织相比,Pin1和TAZ在乳腺癌中过表达;与其他乳腺癌相比,晚期乳腺癌中Pin1和TAZ的表达水平升高,在第4期最为显著;与正常组织以及其他乳腺癌亚型的组织相比,Pin1和TAZ在TNBC中表达更高,表达水平与生存率负相关。尽管YAP的表达在TNBC患者中不是最高的,但在TNBC患者中,YAP表达越高,患者生存率也越低。利用免疫组织化学法将虚拟数据与现实世界的真实病例对接,结果显示,TNBC组织中Pin1、YAP和TAZ的阳性表达率分别为60%、56%和56%,与癌旁组织相比,在TNBC组织中Pin1和TAZ阳性表达率显著升高(P<0.05),YAP升高,但无显著差异(P>0.05),Pin1、YAP、TAZ的表达与一些临床病理特征无关,如肿瘤分期、有无淋巴转移等(P>0.05)。相关性分析表明,TNBC患者组织中Pin1与YAP(r=0.577,P<0.05)、TAZ(r=0.645,P<0.05)的表达均呈显著正相关关系。为了进一步明确Pin1与YAP、TAZ的相关性,在TNBC细胞采用si RNA的方法敲减Pin1后,YAP、TAZ的表达明显下调。上述实验结果提示,Pin1-YAP/TAZ是TNBC的核心信号通路之一。最后,研究华蟾素注射液抗TNBC的分子机制。RNA-seq结果表明,华蟾素注射液可以影响TNBC中的多种信号通路,其抗TNBC的作用机制可能与调控Pin1-YAP/TAZ信号通路相关。Western blot结果显示华蟾素注射液不仅能够下调TNBC细胞系MDA-MB-231和4T1细胞中Pin1、YAP、TAZ的表达,还可以下调TNBC肿瘤中Pin1、YAP、TAZ的表达,这些结果表明华蟾素注射液通过抑制Pin1-YAP/TAZ信号通路,发挥抗TNBC的作用。综上所述,我们采用体内、外实验,明确了华蟾素注射液通过诱导细胞周期阻滞和凋亡发挥抗TNBC的药效;综合运用TCGA数据库和转录组学技术,探讨了其潜在的分子机制;本研

关键词： 三阴性乳腺癌   化学蛋白质组学   灵芝小分子   天然产物探针   靶标蛋白  

摘要： 研究目的:乳腺癌（Breast cancer,BC）是一种严重威胁全球女性健康和生命的恶性肿瘤,号称“女性健康第一杀手”。三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）是乳腺癌中恶性程度最高的亚型,因其具有高异质性、高侵袭性、高复发率和高病死率,已成为近年来医药界研究和关注的焦点。由于TNBC缺乏有效的靶点,因此治疗TNBC失去了靶向治疗的机会,而且用于TNBC治疗的药物非常稀缺,临床几乎没有可选药物。中药天然产物分子以其结构独特性和多样性,为TNBC的药物筛选提供了丰富来源,将中药天然产物分子探针化可为发现新的抗TNBC靶点提供良好策略。本研究选用具有抗TNBC活性的灵芝小分子LZ-22为目标,主要探讨LZ-22在体内外的抗TNBC的生物活性,运用化学蛋白质组学（Chemical proteomics）研究的技术思路、利用探针（probe）进行靶标蛋白的垂钓与验证,为TNBC的治疗发现新靶点,为新药研发提供临床前实验依据,弥补化疗和免疫疗法的缺陷,为肿瘤的治疗提供新策略。 研究方法:***-MB-231细胞和斑马鱼模型检测LZ-22抗TNBC活性;***8和克隆形成等方法比较LZ-22与小分子探针045的抗TNBC活性;***方法检测045对MDA-MB-231活细胞全蛋白的标记并进行Pull down,运用Proteome Discoverer 1.3对LC-MS/MS蛋白组学数据分析筛选候选靶蛋白;*** RNA干扰实验验证候选靶蛋白功能,确定LZ-22靶蛋白;***-PAGE法、SPR技术和细胞中激光共聚焦实验检验LZ-22与靶蛋白的结合;6.分子对接分析LZ-22与靶蛋白的结合口袋。 研究结果:LZ-22选择性抑制MDA-MB-231细胞生长而不影响正常乳腺细胞,抑制克隆形成,阻滞细胞周期在S期;在斑马鱼动物模型上,LZ-22在低至0.078μM时对MDA-MB-231的抑制能力便强于50μM的顺铂;探针045具有和原型化合物LZ-22相似的抗癌生物活性;探针的标记效率极高,且和LZ-22存在竞争抑制现象;结合Pull down后的质谱信息,经Western Blot验证得到可能的候选靶标蛋白PABPC1、CAPN2、HSPA1B;敲低PABPC1抑制细胞生长,且LZ-22的药效减弱,以此为依据确定了PABPC1为真实靶标;LZ-22直接靶向该蛋白形成共价连接,亲和力为-8.1 kcal/mol,KD值为4.071×10-6M。 研究结论:LZ-22具有良好的抗TNBC活性,探针045鉴定到了靶蛋白PABPC1,为抗TNBC提供了新靶点,为后续以此靶点为基础筛选其他活性分子或药物奠定了基础。本项目为中药天然分子抗肿瘤靶点的识别与鉴定提供了新的案例。

关键词： 三阴性乳腺癌   光动力治疗   光敏脂质体   低氧激活药物   细胞外小囊泡   免疫原性细胞死亡   肿瘤免疫微环境  

摘要： 背景:乳腺癌是目前世界上发病率最高的恶性肿瘤。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)作为乳腺癌中侵袭性最强的病理类型,占乳腺癌中的15%-20%。由于TNBC缺乏雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)、人类表皮生长因子受体 2(humanepidermal growthfactorreceptor2,HER-2),故其对内分泌治疗或者 HER-2治疗不敏感,缺乏标准化治疗方案。目前新辅助化疗(neoadjuvantchemotherapy,NAC)是TNBC的主要治疗手段,但NAC治疗时TNBC患者总体生存率依然较低,容易耐药,亟需寻找新疗法以拓宽TNBC治疗上的选择。光动力治疗(photodynamictherapy,PDT)是一种新型非侵入性临床治疗手段,现已有数款光敏剂被多国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准用于临床治疗,有望成为TNBC患者治疗新选项。PDT通过生成活性氧(reactive oxygen species,ROS)杀伤肿瘤细胞,但其缺陷在于易受肿瘤组织内氧浓度影响,即低氧区域无法产生足够的ROS会降低疗效。针对这一治疗瓶颈问题,我们认为可通过药物与PDT协同作用,以弥补PDT在肿瘤低氧区疗效不佳的缺陷。我们设想将低氧激活型药物TH302与PDT同时应用,利用TH302可受低氧条件激活而产生细胞毒的特性,改善肿瘤组织低氧区的疗效。因此,本论文第一部分研究主要涉及创建PDT联合TH302的治疗手段并观察其对TNBC的疗效,我们利用壳寡糖(chitosan oligosaccharide,CO)修饰的脂质体包载所选用的光敏剂HPPH及TH302并靶向TNBC,提高递药效率与治疗效果。已知PDT产生ROS高效杀伤肿瘤细胞的同时还能通过诱导免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death,ICD)来提高肿瘤免疫原性;也已发现PDT诱导ICD可提高TNBC免疫原性,将TNBC从“冷肿瘤”变为“热肿瘤”。然而,TNBC免疫原性提高后,TNBC免疫微环境中的抑制性免疫细胞依然会阻碍体内免疫系统对肿瘤细胞的杀伤效应,TNBC来源的细胞外小囊泡(small extracellular vesicles,sEVs)则会刺激抑制性免疫细胞活化及扩增。针对这一治疗瓶颈问题,我们认为利用PDT诱导TNBC发生ICD,同时减少TNBC细胞本身分泌的sEVs及PDT刺激TNBC细胞产生的sEVs,能改善TNBC肿瘤免疫微环境、提高抗肿瘤免疫效应。我们设想用中性鞘磷脂酶抑制剂GW4869阻遏TNBC分泌sEVs,与PDT诱导ICD协同作用提高体内抗TNBC免疫反应。因此,本论文第二部分研究主要涉及创建PDT联合GW4869的治疗手段并观察其对TNBC的疗效,我们采用原代BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)来源的sEVs作为递药载体,提高所选用的光敏剂Ce6及GW4869的肿瘤区域递药效率与治疗效果。目的:第一部分:制备新型纳米光敏脂质体CO-HPPH-TH302/Lipo,验证CO修饰脂质体的TNBC细胞靶向性及CO-HPPH-TH302/Lipo的抗TNBC疗效,为TNBC治疗提供新策略和新手段。第二部分:制备新型免疫调节型光敏纳米囊泡Ce6-GW4869/sEVs,验证Ce6-GW4869/sEVs的TNBC细胞靶向性及改善TNBC免疫微环境的效应,进一步为TNBC治疗提供新策略与新途径。方法:第一部分:利用“薄膜水化法”和“后插入法”制备CO-HPPH-TH302/Lipo。对该脂质体进行表征:(1)用Zeta-Plusanalyzer粒径及电位检测仪检测脂质体的水合粒径和Zeta电位并评价脂质体的稳定性;(2)用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察脂质体的形态;(3)用紫外可见光分光光度计检测脂质体的紫外可见光吸收光谱并评价药物包封率;(4)用示差热分析仪(differential scanning calorimetry,DSC)检测脂质体的相变温度。通过SOSG试剂盒、电子自旋共振波谱仪检测离体状态下脂质体ROS生成量;用ROS检测试剂盒(DCFH-DA探针)检测脂质体在细胞内ROS生成量。利用细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)试剂检测PDT和TH302的IC50,为后续体外实验选定药物浓度提供依据。CO-HPPH-TH302/Lipo体外实验方面,通过激光共聚

关键词： 三阴性乳腺癌   戊曲酯   紫堇灵   乳腺癌   MS4A1   脂质代谢   肿瘤免疫微环境  

摘要： 近年来,乳腺癌的发病率始终居高不下,其病例居全球新发癌症患者总数量之首,对女性造成的身心伤害极大。三阴性乳腺癌则是其中恶性程度极高的一种类型,发病年龄早,恶性程度高,易扩散转移,且极易发生化疗抵抗,目前现有的治疗手段治疗效果差强人意。戊曲酯,是一种提取自植物缬草的天然化合物,缬草为多年生草本植物,广泛分布于我国东北至西南的多数地区。既往研究发现,戊曲酯除了具有良好的抗癫痫作用外,还可以对肝癌,肺癌,胰腺癌以及前列腺癌等发挥抑制作用,然而其对三阴性乳腺癌的作用尚未见报道。我们通过对天然化合物库的筛选,确定戊曲酯可以对三阴性乳腺癌细胞发挥抑制作用。为了明确戊曲酯对三阴性乳腺癌的具体影响,我们采用CCK-8法,Western blot,流式细胞检测技术,Transwell实验等探究了戊曲酯对三阴性乳腺癌细胞增殖,干性,凋亡以及侵袭转移方面的影响,发现戊曲酯可以抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖,干性以及侵袭转移能力,并可以促进其凋亡。进一步地,为了探究戊曲酯发挥药用的机制,我们采用了 RNA-Seq测序,并对实验组和对照组的差异表达基因进行了通路富集分析。另一方面,对公共数据库(GEO数据库)数据的分析,得到三阴性乳腺癌组织和正常组织的差异表达基因,进行通路富集分析。最终选择同时存在于RNA-Seq测序富集分析结果和公共数据库富集分析结果的通路——MAPK通路,作为实验验证对象。JNK和P38通路是MAPK通路的重要组成部分,其主要与细胞生长停滞和细胞凋亡相关,并且与许多肿瘤的发生发展息息相关,所以选择JNK和P38进行检测。通过实验验证发现,经戊曲酯处理后,三阴性乳腺癌细胞中的P-JNK和P-P38表达量增加,JNK和P38通路被激活,因此,可推测激活JNK和P38可能是戊曲酯发挥对三阴性乳腺癌抑制作用的制之一。采用类似的方法,我们对另一种药物——紫堇灵(提取自传统中药苦地丁)也进行了抗三阴性乳腺癌活性的研究。综上所述,通过对天然化合物库的筛选,我们发现,戊曲酯可抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖,并可抑制其细胞的干性与侵袭转移能力,同时促进三阴性乳腺癌细胞的凋亡;紫堇灵可抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖,并可抑制其细胞的干性,同时促进三阴性乳腺癌细胞的凋亡经初步探究,我们推测激活JNK和P38通路可能是戊曲酯发挥抗三阴性乳腺癌作用的机制之一,而调节氧化磷酸化通路则可能是紫堇灵发挥抗三阴性乳腺癌活性的机制之一。本研究为开发治疗三阴性乳腺癌的新药物奠定了基础,为三阴性乳腺癌的治疗提供了新的方法与思路,并有望改善三阴性乳腺癌患者的化疗抵抗,改善患者的生存预后,具有非常重要的意义。目前,乳腺癌的发病率居于众多癌症之首,严重危害着女性的身体和心理健康。寻找新的生物学标志物对乳腺癌患者进行早期分期,并且进行及时的干预,这对于改善乳腺癌患者的预后具有十分重要的意义。以往的研究已经可以证明,脂质代谢与乳腺癌患者的预后有关,及时纠正患者的脂质代谢紊乱可以延长患者的生存期,改善患者的预后;而肿瘤免疫微环境(TIME)在肿瘤的发生和发展中也起着非常重要的作用。但脂质代谢与肿瘤免疫微环境两者之间的具体关系,以及二者之间的动态调节仍然是一个尚未被阐明的问题。本研究使用HALLMARK数据库中与脂质代谢相关的四条通路,对TCGA数据库中980例乳腺癌样本进行评分,通过评分分数的高低进行分组,寻找两个分组之间的差异表达基因(DEGs)。进一步地,通过生存分析和COX回归分析筛选候选的差异表达基因,最终将对预后具有保护作用的MS4A1作为进一步分析的对象。经过深入的分析发现,MS4A1的表达与患者的年龄、临床分期、肿瘤的大小和远处转移均呈现负相关的关系。在MS4A1高表达组中,样本的大部分基因均富集于免疫相关的通路;另外,经CIBERSORT算法分析发现,MS4A1的表达与10种免疫细胞的丰度呈现正相关的关系,如CD8+T细胞,这提示MS4A1的高表达与免疫活化相关。综上所述,MS4A1的表达不仅可以提示乳腺癌患者的脂质代谢的情况,还可以反映其肿瘤免疫微环境的状况,并且对患者的生存预后具有保护作用。通过本研究,我们发现,MS4A1有可能成为预测预后的独立指标,并可以作为提示乳腺癌患者脂质代谢情况与免疫状态的新的潜在生物标志物。MS4A1的发现,有助于对患者进行早期分类与早期干预,有利于医生采取对患者最适宜的治疗方案,来改善患者的预后,同时也可以对患者的预后起到一定的预测作用,对临床治疗与临床决策具有重要的意义。