关键词： Actein   Toosendanin   构效关系   三阴性乳腺癌  

摘要： 本论文共有三章组成,第一章介绍了中药升麻中actein的结构修饰及抗三阴性乳腺癌活性研究,第二章介绍了中药川楝子中toosendanin的结构修饰及抗三阴性乳腺癌的活性研究,第三章介绍了中药单体成分抗三阴性乳腺癌的研究进展。第一章升麻中actein的结构修饰及抗三阴性乳腺癌活性Actein是从中药升麻（Cimicifuga foetida）的根状茎中分离出来的三萜皂苷,此前已被证明在乳腺癌的治疗中具有潜力,但存在活性不高的问题。在此基础上,我们设计并合成了一系列抗三阴性乳腺癌（TNBC）抑制剂actein的衍生物,并对衍生物进行体外抗三阴性乳腺癌活性评价,其中最具潜力的衍生物1-27对人TNBC细胞株HCC1806和MDA-MB-231具有显著的抑制活性,IC50值分别为2.78和9.11μM,并讨论了actein衍生物的构效关系。此外,初步机制研究发现,1-27在S期阻滞细胞周期显著抑制癌细胞增殖;Western blot结果显示,化合物1-27诱导p21呈剂量依赖性积累,并可能激活MAPK的p38通路从而诱导细胞凋亡。以上结果表明1-27具有开发作为先导化合物的潜力,具有Actein骨架的化合物是一类有前途的治疗TNBC的新型抑制剂。第二章川楝子中toosendanin的结构修饰及抗三阴性乳腺癌活性Toosendanin（TSN）是从中药川楝子（Melia toosendan Sieb et Zucc）中分离出来的抗肿瘤化合物。然而,先前的研究表明TSN治疗三阴性乳腺癌（TNBC）的效果仍不理想。在这项工作中,我们研究了TSN及其衍生物对MDA-MB-231和HCC1806细胞株的作用。结果表明,TSN及其衍生物2-11具有良好的抗肿瘤活性。初步机制研究表明,TSN和2-11均可诱导HCC1806细胞周期S期阻滞和G2/M期细胞数量减少。此外,TSN和2-11降低了p53的蛋白水平以及AKT和ERK的磷酸化,也诱导了p21和p-p38蛋白的积累。第三章中药单体成分抗三阴性乳腺癌的研究进展本章围绕中药单体成分抗三阴性乳腺癌的研究进行综述,主要从植物、动物、矿物中提取分离得到的单体化合物及其衍生物的抗TNBC活性研究;此外还对中药单体联合抗癌药物紫杉醇、顺铂、阿霉素等治疗TNBC进行阐述。希望可以为后期抗三阴性乳腺癌的药物研究提供参考。

关键词： 三阴性乳腺癌   抗菌肽   自噬抑制   癌细胞   细胞凋亡  

摘要： 乳腺癌在全球发病率和死亡率居女性癌症首位，三阴性乳腺癌约占其中的15%-20%。三阴性乳腺癌缺乏其他类型乳腺癌的治疗靶点（如雌激素、孕激素受体和人表皮生长因子受体）的表达，是一种侵袭性较强且治疗难度较大的乳腺癌亚型。目前临床治疗常用手术联合化疗药物治疗，但传统化疗药物存在选择性差、毒副作用大和耐药性等弊端，亟需开发新型抗三阴性乳腺癌药物。抗菌肽是一类固有免疫系统的小分子肽，具有抗菌、抗病毒和抗真菌等活性。研究发现部分抗菌肽在肿瘤治疗领域具有潜力，这类抗菌肽不仅低毒性、对肿瘤细胞选择性高，并且对休眠期和生长缓慢的肿瘤细胞也具有抗癌活性。抗菌肽Pep19-2.5是一种正在开发的抗感染和中和内毒素的合成多肽，安全性高，目前尚无其抗肿瘤活性的报道。本课题组通过筛选发现抗菌肽Pep19-2.5可在体外显著抑制三阴性乳腺癌细胞增殖，但分子机制不明。最近研究表明，三阴性乳腺癌的治疗效果可能受细胞自噬的影响，自噬是一种细胞内的降解和回收过程，涉及细胞内蛋白质、细胞器和其他大分子物质的降解。因此，本课题拟通过体内外系统实验，围绕自噬流、自噬-溶酶体途径研究抗菌肽Pep19-2.5的抗三阴性乳腺癌作用及其分子机制。本文主要研究方法和结果如下：　　1. 抗菌肽Pep19-2.5调节自噬能力的检测：选取课题组前期筛选抑制三阴性乳腺癌细胞株 MDA-MB-231 增殖活性效果较好的Pep19-2.5、Tiger17、AH90、DRGN-1、SHAP1五种抗菌肽，采用稳定表达GFP-LC3B的三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231检测它们调节自噬的能力，发现只有Pep19-2.5具有自噬调节作用。Western blot、RT-PCR和透射电子显微镜结果显示，抗菌肽Pep19-2.5提高了自噬分子LC3B、SQSTM1/p62蛋白表达水平、增加了自噬小体数量，说明Pep19-2.5是一种有效的自噬调节剂。进一步联用Pep19-2.5和自噬早期/晚期抑制剂进行分析，Western blot结果表明Pep19-2.5抑制自噬晚期。　　2. 抗菌肽Pep19-2.5抑制自噬流抗三阴性乳腺癌的体外作用研究：CCK8和细胞克隆形成实验表明，抗菌肽Pep19-2.5显著抑制三阴性乳腺癌细胞增殖，并增强了肿瘤细胞对化疗药顺铂的敏感性。流式细胞术、Tunel和Western blot结果显示，抗菌肽Pep19-2.5诱导肿瘤细胞凋亡。敲除ATG5（自噬小体形成的必需基因）的细胞株不具备形成自噬流的能力。CCK8检测抗菌肽Pep19-2.5对ATG5KO MDA-MB-231细胞增殖的影响，结果表明抗菌肽Pep19-2.5是通过抑制自噬流来抑制MDA-MB-231细胞增殖的。流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测结果显示，抗菌肽Pep19-2.5可穿透肿瘤细胞膜，定位于溶酶体。自噬小体和溶酶体共定位观察实验结果表明Pep19-2.5抑制自噬体-溶酶体降解。ELISA结果显示溶酶体标志酶ACP和溶酶体主要蛋白酶CTSB、CTSD相对酶活性降低，说明抗菌肽Pep19-2.5 影响了溶酶体水解功能，可能影响了溶酶体的pH。RNA-Seq分析结果表明，抗菌肽Pep19-2.5作用相关的途径有：细胞增殖、生物调节、癌症途径、抗癌药物的耐药性等。通过Pulldown-MS蛋白靶点垂钓实验及蛋白靶点的筛选和验证，初步推测，ATP6V1A可能是抗菌肽Pep19-2.5抑制自噬流抗三阴性乳腺癌的作用靶点，但仍有待进一步研究。　　3. 抗菌肽 Pep19-2.5 在动物体内的药效评价：通过构建NOD/SICD小鼠人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞移植瘤模型，对抗菌肽Pep19-2.5进行药效评价。HE染色、TUNEL染色、免疫荧光、免疫组化检测小鼠对抗菌肽Pep19-2.5的耐受性、肿瘤组织的凋亡率及自噬分子LC3、SQSTM1/p62的表达情况，结果表明Pep19-2.5在小鼠体内具有良好的耐受性，能够同样有效的抑制自噬流、诱导肿瘤凋亡。　　4. 抗菌肽Pep19-2.5的结构基础及活性结构初步分析：CCK8结果表明抗菌肽 Pep19-2.5 在 40μM 浓度以下不抑制正常细胞株NIH/3T3、HUVECs和MCF-10A的增殖。溶血试验表明Pep19-2.5在160μM浓度以下的溶血率极低。采用生信分析软件和圆二色谱对Pep19-2.5的理化性质、二级结构、亲疏水性、信号肽等进行分析，结果表明Pep19-2.5是一个双亲性多肽，结构上显示出少量β折叠。对抗菌肽Pep19-2.5序列中碱性氨基酸聚集的部分进行改构，CCK8结果表明，抗菌肽Pep19-2.5抑制MDA-MB-231细胞增殖的作用可能与氨基酸序列中的赖氨酸和精氨酸有关。　　综上所述，本文研究结果表明抗菌肽Pep19-2.5通过

关键词： 北豆根   N-去甲基蝙蝠葛碱   三阴性乳腺癌   NF-κB   3D肿瘤球体  

摘要： 三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）是一类特殊的乳腺癌亚型,患者预后差且生存率低。已有的研究表明,北豆根（Menispermum dauricum DC）及其生物碱活性化合物对多种肿瘤具有抗增殖活性。然而,北豆根生物碱是否具有TNBC增殖抑制活性目前尚不清楚。 本论文以北豆根为研究对象,对其总生物碱进行一维色谱分离制备,根据色谱峰共收集6个馏分（F1–F6）。采用CCK8法对北豆根一维馏分进行抗TNBC增殖检测,筛选出2个活性馏分F5和F6。通过细胞增殖检测、HPLC-MS/MS和核磁分析,从活性馏分中鉴定出两个具有抗TNBC增殖活性的化合物,为蝙蝠葛碱和N-去甲基蝙蝠葛碱。 进一步研究发现,蝙蝠葛碱和N-去甲基蝙蝠葛碱对4种不同分型的TNBC细胞均有良好的增殖抑制能力,其半抑制浓度IC50值介于5.01μM–13.16μM。蝙蝠葛碱与N-去甲基蝙蝠葛碱的抗TNBC增殖活性相似,但是N-去甲基蝙蝠葛碱的抗肿瘤研究较少,因此选择N-去甲基蝙蝠葛碱来研究其抗TNBC增殖作用机制。本论文通过流式细胞技术、细胞伤口愈合实验及Western blot检测研究了N-去甲基蝙蝠葛碱对TNBC细胞凋亡、细胞周期分布和细胞迁移的影响,结果表明N-去甲基蝙蝠葛碱能够通过促进DNA修复酶PARP1切割产物的增加促使TNBC细胞凋亡,通过促进G1/S-特异性周期蛋白-D1和周期蛋白依赖性激酶2的表达引起细胞周期G0/G1期阻滞,通过抑制基质金属蛋白酶9的表达抑制TNBC细胞迁移。此外,Western blot检测结果表明N-去甲基蝙蝠葛碱还可以抑制TNBC细胞中nuclear factor kappa B（NF-κB）p65蛋白的表达,表明N-去甲基蝙蝠葛碱是通过调控典型NF-κB信号通路的激活而抑制TNBC细胞的增殖。3维（3D）肿瘤球体是一种类器官模型。实验结果表明N-去甲基蝙蝠葛碱能够抑制TNBC3D肿瘤球体的生长,并有效地穿透多层细胞,导致外部细胞从3D肿瘤球体表面分离。

关键词： 三阴性乳腺癌   PAK1   HDAC6   靶向药物   抗增殖  

摘要： 三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer,TNBC）是乳腺癌中恶性程度最高的亚型,其特点是雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）阴性的同时缺乏原癌基因HER-2的过表达,因异质性高、侵袭性强、远端转移等特点,三阴性乳腺癌的临床治疗已成为乳腺癌研究领域的难点,临床上尚未有有效的治疗方法,常规化疗仍是该亚型临床最主要的治疗手段。鉴于三阴性乳腺癌的高度异质性,常规单靶向药物大多以失败告终,寻找新的双靶治疗靶标并设计合成全新的双靶向小分子已成为三阴性乳腺癌药物研究的热点。 PAK1在肿瘤的整个进程中发挥着重要作用,其几乎参与了肿瘤调控的每一个阶段,包括肿瘤的发生发展、转移、凋亡及耐药等。PAK1的异常过表达与肿瘤患者的生存期呈负相关。HDAC6是组蛋白去乙酰化酶的重要成员之一,HDAC6通过调控组蛋白乙酰化水平来影响肿瘤的发生和增殖、致癌基因和抑癌基因的平衡,当其修饰紊乱时会导致基因表达异常,影响细胞重要的生理功能,进而导致肿瘤的形成。 在本研究中,鉴于PAK1在调节能量代谢和HDAC6在表观遗传修饰方面的重要作用,我们认为双靶向PAK1和HDAC6可能是治疗TNBC的一种有效新策略。本论文基于结构虚拟筛选和协同药效团融合的策略,设计合成了45个以吡啶[2,3d]嘧啶-7（8H）为母核的新型PAK1/HDAC6双靶抑制剂。体外酶活性测试和抗乳腺癌细胞增殖实验结果表明22l是一个新型的强效的PAK1/HDAC6双靶抑制剂,其IC50分别为38.23 n M和13.62 n M,对MDA-MB-231细胞显示出强效的抗增殖作用,IC50为0.9μM。通过分子对接和动力学模拟阐明了化合物22l与PAK1和HDAC6的结合模式及结合自由能。在酶亚型选择性实验中,化合物22l对HDACs和PAKs家族蛋白中的HDAC6和PAK1亚型蛋白具有一定的选择性。化合物22l也能够在MDA-MB-231细胞水平上同时抑制PAK1和HDAC6的活性。SPR和CETSA实验进一步证实了化合物22l对PAK1/HDAC6的靶向性。在TNBC异种移植瘤裸鼠模型中,化合物22l显示出良好的抗肿瘤作用。 综上所述,本论文设计合成了一系列新型的PAK1/HDAC6双靶抑制剂,其中化合物22l是一个选择性的强效的PAK1/HDAC6双靶抑制剂,在体内外均对三阴性乳腺癌显示出治疗活性,这为PAK1/HDAC6双靶抑制剂治疗三阴性乳腺癌提供了候选药物和理论依据。

关键词： 三阴性乳腺癌   适配体   雷公藤甲素   缩醛酯连接键   靶向治疗药物  

摘要： 三阴性乳腺癌(TNBC)是指雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体均为阴性的乳腺癌亚型,占所有乳腺癌病理类型的15%-25%。由于TNBC具有特殊的生物学行为和临床病理特征,是侵袭性最强、预后最差的乳腺癌亚型,其常规治疗方法包括手术、放疗、化疗及免疫治疗,其中化疗仍是三阴性乳腺癌的标准治疗方式,目前尚无针对性的靶向治疗方法。研究表明,核仁素在多种肿瘤细胞中过表达,且广泛表达与TNBC细胞膜表面。核酸适配体AS1411是一种由26个碱基组成的高水溶性单链寡核苷酸,能够特异性与TNBC细胞表面过表达的核仁素以高亲和性结合。雷公藤甲素(TP)是一种广谱高效的抗癌药,具有多种抗癌机制,可诱导多种肿瘤细胞的凋亡,包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌等,抗肿瘤活性优于顺铂、阿霉素、紫杉醇等传统的抗癌药物。但由于其水溶性差和缺乏肿瘤靶向性,存在严重的毒副反应,其临床运用受到极大限制。由此,基于肿瘤的靶向治疗和药物的精准释放技术,本课题设计了合成一种p H高度敏感的核酸适配体AS1411-雷公藤甲素偶合物(AS-TP),用于靶向治疗三阴性乳腺癌。主要研究内容及结果如下: 首先,采用丁二酸酐和烯丙醇为原料,设计合成了一种新型酸敏感性连接键,并将TP与核酸适配体AS1411通过该连接键进行偶联,合成了核酸适配体AS1411-雷公藤甲素偶合物。随后,采用HPLC测定AS-TP的血清稳定性、酸敏感性性及水溶性,结果证明AS-TP可在血清中保持稳定不分解,且易在弱酸微环境下断裂释放雷公藤甲素原药,进一步的水溶性测定证明与TP相比,AS1411偶联可显著提高TP的水溶性。 随后,采用分子对接技术和生物分子相互作用分析仪测定了AS-TP与核仁素蛋白的亲和力,结果证明AS1411偶联可显著提高TP与核仁素蛋白的靶向性,细胞免疫荧光显示AS-TP与核仁素蛋白具有优异的共定位效果。进一步采用流式细胞术测定了核仁素表达量不同的细胞对羟基荧光素标记的AS-TP的摄取能力,细胞对FAM-AS-TP的摄入量与核仁素蛋白的表达量相关三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞高摄取FAM-AS-TP,AS1411可竞争性抑制MDA-MB-231对AS-TP的摄入及AS-TP有对MDA-MB-231的细胞毒性。 采用MTT实验测定了AS-TP对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用及对正常细胞的细胞毒性,结果证明AS1411偶联可显著增强TP的抗肿瘤作用并降低其对正常细胞的细胞毒性,流式细胞术分析显示AS-TP发挥与TP相似的抗肿瘤机制,其主要通过诱导MDA-MB-231细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡发挥抗TNBC作用。进一步研究表明,AS-TP主要通过降低MDA-MB-231细胞线粒体膜电位水平、促进细胞内活性氧生成及激活线粒体凋亡途径发挥抗TNBC作用。 为了进一步验证AS-TP的体内分布及体内抗肿瘤作用,本论文构建了三阴性乳腺癌荷瘤小鼠模型。小动物活体成像实验表明,AS-TP可显著蓄积于TNBC肿瘤组织并主要通过肝、肾组织代谢。体内疗效实验发现,AS-TP可发挥高效的体内抗TNBC作用,其可显著损伤肿瘤组织、诱导肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤组织增殖。体内生物安全性表明,在有效治疗剂量条件下,AS-TP并未对小鼠正常组织结构造成病理损伤,同时血生化数据表明AS-TP并未引起小鼠肝、肾指标变化,这表明AS-TP具有较好的体内生物安全性。

关键词： 三阴性乳腺癌   细胞周期依赖性激酶7   RNA聚合酶   THZ1   ZJC-11  

摘要： 研究目的 三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）是一种侵袭性乳腺癌,没有雌激素受体（Estrogen receptor,ER）,孕激素受体（progesterone receptor,PR）和人表皮生长因子受体-2（Human epidermal growth factor receptor-2,HER2）的表达。它是一种高度转移的异质性疾病,占乳腺癌总病例的10-15%,与非TNBC病例相比,治疗后五年内预后较差,复发率高。TNBC肿瘤的诊断和亚型对于确定治疗方案并为每个TNBC个体建立个性化,有针对性的药物至关重要。CDK7是细胞周期蛋白家族（Cyclin-dependent kinase,CDK）的重要成员之一,其参与调节多种生物过程,如细胞周期、基因转录和DNA修复。研究显示CDK7在TNBC中显著高表达,与TNBC临床预后显著相关,并形成肿瘤发生的驱动力,因此靶向CDK7可能成为治疗TNBC发生发展有效手段之一。本课题组前期合成并筛选了CDK7抑制剂THZ1的结构改造物——ZJC-11,发现其可能具有抗TNBC作用。因此本研究探究了ZJC-11药物代谢与动力学特征,阐述了ZJC-11对TNBC细胞周期、转录以及DNA修复的影响机制,提供了靶向CDK7可作为抗TNBC的可行性证据,进一步为临床开发更多高效的CDK7抑制剂提供参考。 研究方法 一、CDK7抑制剂ZJC-11的药代动力学及抗TNBC药效学研究 1.通过MTT实验筛选15个THZ1结构改造化合物的抗TNBC细胞活性,得到化合物ZJC-11; 2.通过药代动力学研究ZJC-11的药代动力学特征,KM小鼠单次尾静脉给予10mg/kg ZJC-11和10mg/kg THZ1,在给药后5min、10min、15min、30min、1h、2h取眼眶静脉血,分离得到含药血浆,样品经前处理后采用HPLC/MS检测样品血药浓度,再用DAS 3.0软件计算主要药代动力学参数(如t1/2、AUC、CL等),并拟合药时曲线。 3.通过MTT检测ZJC-11对TNBC细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-468）与ER/PR+细胞系（ZR-75-1）细胞活力的影响; 4.通过细胞克隆和明场下观察ZJC-11对TNBC细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-468）与ER/PR+细胞系（ZR-75-1）细胞增殖和细胞形态的影响; 5.通过流式细胞术和荧光检测ZJC-11对TNBC细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-468）与ER/PR+细胞系（ZR-75-1）细胞死亡的诱导作用; 6.通过流式细胞术检测ZJC-11对TNBC细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-468）与ER/PR+细胞系（ZR-75-1）细胞周期和细胞活性的影响; 7.通过Western Blot检测ZJC-11对TNBC细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-468）、ER/PR+细胞系（ZR-75-1）以及肿瘤组织中CDK7和RNAPII的磷酸化蛋白水平的影响; 8.通过建立BALB/c裸鼠体内MDA-MB-231细胞原位移植瘤模型,腹腔注射给予4mg/kg和8mg/kg ZJC-11,观察ZJC-11对裸鼠肿瘤生长及体重的影响; 9.通过免疫组化检测ZJC-11对细胞增殖标志物Ki67的影响。 二、CDK7抑制剂ZJC-11抗TNBC的机制研究 1.通过体外激酶活性实验检测ZJC-11对CDK2、CDK7以及CDK9的选择性抑制作用; 2.通过分子对接模型验证ZJC-11与CDK7的结合作用; 3.通过转录组学分析ZJC-11对TNBC细胞系（MDA-MB-231）基因转录的影响; 4.通过Reactome富集分析探究ZJC-11诱导细胞衰老的作用。 研究结果 一、CDK7抑制剂ZJC-11的药代动力学及抗TNBC药效学研究 1.通过对15个化合物的抗TNBC活性筛选发现,ZJC-11能够抑制MDA-MB-231细胞活力,且IC50均高于其余化合物; 2.药代动力学实验结果显示,与THZ1相比,ZJC-11的AUC、C0、Cmax明显较高,而Tmax较低,这表明ZJC-11在血浆中暴露量比THZ1大。相反,ZJC-11的Vd和CL更低,这表明了ZJC-11的清除率更高,并且其在体内的分布更窄。 ***实验结果表明,相比ER/PR+乳腺癌细胞ZR-75-1,ZJC-11分别处理TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468 48h和72h后能显著降低细胞活力,并且具有较好的时间依赖性和剂量依赖性; 4.细胞克隆实验及明场观察细胞结果表明,相比ER/PR+乳腺癌细胞ZR-75-1,ZJC-11能显著改变TNBC细胞MDA-MB-

关键词： 三阴性乳腺癌   细胞周期蛋白依赖性激酶7   N76-1   细胞周期，凋亡  

摘要： 1背景: 目前,乳腺癌的治疗手段主要包括手术治疗、化疗、放疗、内分泌治疗和靶向治疗。然而,三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)因缺乏雌激素受体(Estrogen receptor,ER)、孕激素受体(Progesterone receptor,PR)、人表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER2)的表达,对靶向治疗或内分泌治疗几乎无效,除化疗外尚无其他有效的全身治疗措施。但是,遗传高度特异性的TNBC具有相对统一的转录程序,该程序异常依赖于细胞周期蛋白依赖性激酶7(Cyclin dependent kinases 7,CDK7)。因此CDK7被认为是TNBC有潜力的治疗靶点,CDK7抑制剂的开发对TNBC有效治疗策略的研发具有重要意义。在这项研究中,我们通过将共价CDK7抑制剂THZ1的侧链连接到ALK抑制剂色瑞替尼的母核,获得了新型CDK7的抑制剂N76-1。本研究旨在阐明N76-1抗TNBC的作用和潜在机制,以期为TNBC新药开发提供新的策略和研究基础。 方法: 一、CDK7抑制剂N76-1抗TNBC作用研究 1.以TNBC乳腺癌细胞系MDA-MB-231、CAL-148、MFM-223细胞和ER+乳腺癌细胞系ZR-75-1为研究对象,采用MTT实验以及平板克隆实验检测N76-1对TNBC细胞活力和增殖的影响; 2.高内涵细胞成像系统分析N76-1对TNBC细胞迁移的影响; 3.采用流式细胞术检测N76-1对MDA-MB-231、CAL-148和MFM-223细胞周期的影响;Western blot检测N76-1对细胞周期相关蛋白:细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(Cyclin-dependent kinase 1,CDK1)及磷酸化CDK1(p-CDK1)表达的影响; 4.采用流式细胞术检测N76-1对MDA-MB-231、CAL-148和MFM-223细胞凋亡的影响;Western blot检测N76-1对细胞凋亡相关蛋白:多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(Poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)、Cleaved-PARP、胱天蛋白酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase3,Caspase3)、Cleaved-Caspase3表达的影响; 5.4周龄KM小鼠,尾静脉注射N76-1(3mg/kg)和THZ1(3mg/kg)后,不同时间点取血,并分离淡黄色含药血浆,使用液质联用色谱检测血药浓度,分析N76-1和THZ1在小鼠体内的代谢情况。 6.建立MDA-MB-231细胞株裸鼠原位移植瘤模型,以每天两次的频率腹腔注射阳性对照THZ1(10mg/kg)以及N76-1(4 mg/kg和2mg/kg)共21天,评估N76-1体内抗肿瘤作用; 7.苏木精—伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)检测N76-1对裸鼠脏器生理结构的影响;免疫组织化学染色(Immunohistochemistry staining,IHC)检测N76-1对裸鼠原位移植瘤Ki67表达水平的影响。 二、N76-1抗TNBC作用机制研究 1.蛋白激酶实验检测N76-1对细胞周期蛋白依赖性激酶1(Cyclin-dependent kinase 1,CDK1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(Cyclin-dependent kinase 2,CDK2)、CDK7细胞周期蛋白依赖性激酶9(Cyclin-dependent kinase 9,CDK9)和细胞周期蛋白依赖性激酶12(Cyclin-dependent kinase 12,CDK12)5个激酶的半抑制浓度,初步评估N76-1的靶点选择性;Western blot检测N76-1对CDK7蛋白表达水平和CDK7下游蛋白RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase II,RNAPⅡ)的表达水平及其磷酸化水平的影响; 2.使用分子对接预测N76-1与CDK7的结合位点以及结合能;细胞热转移分析(Cellular Thermal Shift Assay,CETSA)实验检测N76-1与CDK7结合作用; 3.使用si RNA敲低CDK7,流式细胞术检测CDK7和N76-1对TNBC细胞细胞活力、周期和凋亡的影响; 4.N76-1处理三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞48 h,收集细胞,提取RNA,经转录组学测序,分析N76-1对MDA-MB-231细胞全基因组转录水平的影响;Reactome富集分析、GO富集分析和GSEA富集分析N76-1调控的三阴性乳腺癌的可能作用机制并检测关

关键词： 三阴性乳腺癌   丹参酮ⅡA   G蛋白偶联雌激素受体   细胞迁移   基质金属蛋白酶9  

摘要： 目的:基于体外细胞实验,探索丹参酮ⅡA对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移的抑制作用及其分子机制。方法:选取三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231,利用细胞增殖实验检测丹参酮ⅡA对MDA-MB-231细胞增殖的作用,并筛选适宜的药物浓度;应用划痕实验检测丹参酮ⅡA对MDA-MB-231细胞迁移率的影响;Western Blot法检测丹参酮ⅡA对G蛋白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor,GPER)及基质金属蛋白酶9(Matrix metalloprotein-9,MMP-9)表达的影响。结果:细胞增殖实验结果显示,丹参酮ⅡA可以抑制MDA-MB-231细胞增殖,且呈剂量依赖性(P<0.05);划痕实验结果显示,丹参酮ⅡA可以抑制MDA-MB-231细胞迁移,且呈剂量依赖性(P<0.01),加入GPER特异性抑制剂G15后迁移率有所上升(P<0.01)。Western Blot结果显示,丹参酮ⅡA可以显著下调GPER和MMP-9蛋白的表达水平并呈剂量依赖性(P<0.05),加入GPER特异性抑制剂G15后,MMP-9表达有所上升(P<0.01)。结论:丹参酮ⅡA可以抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移,其机制可能与抑制GPER介导的MMP-9表达相关。

关键词： 三阴性乳腺癌   淋巴管生成   VEGFR3   PARP   双靶点抑制剂  

摘要： 三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）作为乳腺癌的一种特殊分子分型,占整体乳腺癌的15%左右,具有特殊的分子表达特征、生物学行为以及临床病理特征。目前临床上常用的TNBC治疗手段仍然是手术和常规的全身细胞毒化疗,但是密集型,高剂量的化疗会产生巨大的毒性,且肿瘤复发或转移后往往缺乏有效的药物,治疗效果不理想,预后依然很差。肿瘤血管和淋巴管生成在TNBC的发生和发展过程中起关键作用,诸多研究表明抗血管内皮生长因子受体（Vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR）通路介导的血管和淋巴管生成是TNBC治疗领域富有潜力的策略。然而,VEGFR抑制剂的缺点也非常突出,包括抑制生理性血管生成而导致的严重不良反应（如出血、伤口愈合延迟、胃肠道穿孔、血栓栓塞并发症、蛋白尿等）、抗肿瘤效果持续时间短,血管生成代偿信号通路激活导致的治疗性耐药,这些都在一定程度上限制了该类抑制剂的临床应用。因此,设计和发现具有高效价、高选择性和低毒性的VEGFR抑制剂,不仅能够为抗TNBC的治疗药物研究提供科学策略,也能有助于进一步探索VEGFR通路在TNBC发生和发展中的具体机制和功能。本人在攻读博士学位期间,围绕VEGFR介导肿瘤血管和淋巴管生成,开展了新型VEGFR3选择性和VEGFR/PARP双靶标抑制剂的设计、合成和构效关系研究,并对优选化合物开展体内外抗TNBC药效学、作用机制和药代动力学性质研究。具体内容简介如下: 一、选择性VEGFR3抑制剂的设计、合成及抗TNBC活性研究 TNBC的转移是一个多步骤、多基因参与的过程,一旦患者发生远端转移常提示预后差,生存时间短,远端转移也是晚期TNBC的主要致死原因。淋巴管生成和重塑在TNBC的远端转移过程中发挥关键作用,原发肿瘤通过异常生成的瘤周淋巴管与淋巴结进行连接,促进肿瘤细胞进入淋巴结、全身循环和远端转移。诸多研究表明抗VEGFR通路介导的淋巴管生成是TNBC转移治疗领域富有潜力的策略。相对于同家族的VEGFR1/2,VEGFR3在TNBC转移相关的淋巴管生成过程中发挥着关键作用,是抗TNBC转移的一个潜力靶标。目前,国内外针对VEGFR3进行选择性抑制剂的药物设计还较少,尚无进入临床试验阶段的候选药物。SAR131675是唯一被报道的选择性VEGFR3抑制剂,体内研究表明其能够有效地抑制淋巴结侵袭和肺部转移,但其低体内药效和积蓄毒性,阻碍了它的进一步临床评估。研究发现SAR131675结构中的乙炔基团通过烷基化CYP450的合成血红素生色基团或关键残基,使肝脏CYP450酶失活,从而不可逆地抑制药物代谢系统,造成累积性毒性。因此,有必要研发具有更高亲和力、更高选择性,更好安全性的VEGFR3抑制剂。 在本章中,我们通过对活性小分子库进行VEGFR3激酶抑制活性随机筛选,以此确定了具有中等抑制活性的苗头化合物1,其对VEGFR3酶水平抑制活性(IC50)为3.5μM。紧接着,我们通过分子对接研究化合物1与VEGFR3的结合模式,以此对化合物1的结构进行优化和构效关系研究。第一步,通过对化合物1的噻吩并[2,3-d]嘧啶环骨架进行骨架跃迁,我们锁定噻吩并[2,3-d]嘧啶为优势骨架结构;第二步,我们对噻吩并[2,3-d]嘧啶的6位取代部分进行详细考察,找到N-甲基-4-（对苯基）哌嗪取代能够使生物活性显著提升;第三步,我们对噻吩并[2,3-d]嘧啶的2位取代部分进行探究,发现在该位置引入疏水基团可以提高抗增殖活性,但不利于VEGFR3抑制活性;第四步,我们对链接基团哌嗪进行结构修饰,以此考察对生物活性的影响。构效研究发现,对哌嗪基团的结构修饰会导致哌嗪发生不利于分子与蛋白结合的构象变化;最后,我们对头部基团进行优化,发现引入含有脲基的大位阻基团能够显著提高生物活性。整个研究过程共计合成52个化合物,最终发现优选化合物22k,该化合物对VEGFR3酶水平抑制活性为110.4 n M,并具有较优的抗TNBC细胞增殖活性(MDA-MB-231,IC50=2.2μM;MDA-MB-436,IC50=3.5μM)。另外,化合物22k对VEGFR3具有良好的选择性(VEGFR1,IC50>10μM;VEGFR2,IC50>10μM),优于阳性对照SAR131675(VEGFR1,IC50=3100 n M;VEGFR2,IC50=220 n M)。此外,化合物22k具有可接受的口服药代性质,口服生物利用度达到30.9%。 随后,我们利用多种分子生物学实验对化合物22k的作用机制及体内药效进行深入研究。体外机制研究表明,在VEGFC诱导的人表皮淋巴管内皮细胞HDLEC中,22k通过靶向VEGFR3抑制细胞迁移和淋